Đề tài Cải tạo giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy và dung hợp tế bào trần

CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS LÊ THỊ THUỶ TIÊN Trang 1 Trường Đại Học Bách Khoa Tp. HCM KHOA KỸ THUẬT HOÁ HỌC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO TIỂU LUẬN CÔNG NGHỆ TẾ BÀO Đề tài: Cải tạo giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy và dung hợp tế bào trần. GVHD: TS LÊ THỊ THUỶ TIÊN SVTH: MSSV 1. NGUYỄN HOÀNG ANH 60800048 2. NGUYỄN THIÊN ANH DŨNG 60800353 Tp. HCM Ngày 8 Tháng 6 Năm 2011 CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS LÊ THỊ THUỶ TIÊN Trang 2 Mục lục Trang 1. Mở đầu: 1.1. Đặt vấn đề: .................................................................................. 3 1.2. Mục đích nghiên cứu: .................................................................. 4 2. Tổng quan tài liệu: 2.1. Tế bào trân: ............................................................................... 4 2.2. Lịch sử nghiên cứu tế bào trần: ................................................. 4 3. Kỹ thuật thu nhận tế bào trần: ............................................................. 7 4. Xác định mật độ tế bào trần và khả năng sống sót: .............................. 10 5. Nuôi cấy và tái sinh tế bào trần: 5.1. Môi trường nuôi cấy: ................................................................ 11 5.2. Sự tái sinh cây:.......................................................................... 14 6. Dung hợp tế bào trần và sự lai soma: 6.1. Nguyên tắc: ............................................................................... 15 6.2. Các phương pháp dung hợp tế bào trần: .................................... 15 6.3. Dung hợp tế bào trần bao gồm 3 pha:........................................ 16 6.4. Phương pháp nuôi cấy và mật độ tế bào lai: .............................. 17 6.5. Sự phát triển của tế bào lai: ....................................................... 17 6.6. Những thuận lợi và khó khăn của dung hợp tế bào trần:............ 18 7. Tài liệu tham khảo: ............................................................................. 19 CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS LÊ THỊ THUỶ TIÊN Trang 3 1. Mở đầu: 1.1. Đặt vấn đề: Màng nguyên sinh chất cho phép các tế bào trần có thể hấp thu các tế bào đại phân tử (nucleic acid, protein), thậm chí cả các cơ quan tử như lục lạp, ty thể, nhân bào…theo cơ chế của amip. Nếu để các tế bào trần cạnh nhau, chúng có thể dễ dàng hòa làm một. Đây là hiện tượng dung hợp (protoplast fusion) hay còn gọi là lai vô tính tế bào (cell somatic hybridization). Khi 2 hoặc nhiều tế bào trần dung hợp ngẫu nhiên sẽ tạo một khối tế bào trần, trong đó nhân của chúng có thể kết hợp hoặc tồn tại riêng rẽ. Nếu hai nhân khác nhau sẽ tạo ra thể lai dị nhân ngược lại có thể lai đồng nhân. Sự kết hợp nhân trong thể dị nhân hình thành tế bào trần lai thực sự gọi là thể dị nhân. Nếu 1 trong 2 nhân bị đào thải, nguyên sinh chất của 2 tế bào trần sẽ dung hợp tạo ra thể lai tế bào chất cybrid (Cytoplasmid hybrid). Sự liên kết và dung hợp tế bào trần để tạo thành các tế bào lai heterocaryon giữa các mô cùng một loài hoặc thuộc các loài khác nhau tùy thuộc vào nồng độ các ion như natri, kali, canxi, cũng như độ pH của môi trương nuôi cấy. Đồng thời phụ thuộc vào một số chất có tác dụng tăng cường liên kết tế bào như lysozym, và đặc biệt là polyethylen glycol do cấu trúc phân tử của chúng có thể tạo nên các liên kết ion với các chất có mặt ở màng sinh chất của tế bào. Sử dụng polyethylen glycol (với nồng độ từ 0,2- 0,3M) có thể tạo ra các tế bào lai đạt từ 25- 50% và các tế bào lai có thể tồn tại qua nhiều thế hệ. Sự tạo thành mô sẹo (callus) và tái sinh cây từ tế bào lai syncaryon không phụ thuộc vào phương pháp tạo tế bào lai. Kỹ thuật này cho phép mở rộng nguồn gene của các loài thực vật, tạo ra các dòng tế bào sản xuất mới mang các đặc tính di truyền ưu việt của cả bố và mẹ.[1] Bằng phương pháp dung hợp tế bào trần, ta có thể chuyển những gene hữu ích như đề kháng sâu bệnh, cố định đảm, giúp tốc độ sinh trưởng nhanh hơn, tốc độ hình thành sản phầm cao hơn (chấ lượng Protein), chống chịu được sương giá, chịu hạn, kháng thuốc diệt cỏ, … Dung hợp tế bào trần là một công cụ quan trọng giúp cho sự cải tiến giống để đem đến thay đổi đặc tính di truyền và phát triển trong chủng nấm sợi lai. Dung hợp tế bào trần thường được dùng để kết hợp các gene của các loài sinh vật khác nhau để tạo ra các chủng với đặc tính mong muốn. đây chính là công nghệ mạnh mẽ cho việc nhân giống VSV mang tính chất công nghiệp. Công nghệ dung hợp tế bào trần sẽ tiếp tục được nghiên cứu và phát triển cho nền công nghệ sinh học hiện đại. Kĩ thuật này trong tương lai sẽ là công cụ được sử dụng thường xuyên nhất trong nuôi cấy mô, sinh học phân tử, cho các nhà hóa sinh và công nghệ sinh học.[2] CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS LÊ THỊ THUỶ TIÊN Trang 4 1.2. Nội dung nghiên cứu:  Tìm hiểu kỹ thuật thu nhận và nuôi cấy tế bào trần.  Xác định mật độ tế bào trần và khả năng sống sót.  Tìm hiểu các phương pháp nuôi cấy và tái sinh tế bào trần.  Tìm hiểu các phương pháp dung hợp tế bào trần. 2. Tổng quan tài liệu: 2.1. Tế bào trần: Tế bào trần là những tế bào mà vách tế bào của nó được loại bỏ và được bao phủ bằng màng nguyên sinh chất. Tế bào trần được thu được bằng cách sử dụng các emzyme loại bỏ vách tế bào. Dung hợp tế bào trần là một quá trình vật lý, bằng cách hợp nhất hai hay nhiều tế bào tiếp xúc và hòa hợp với nhau, hay chúng tự phát trong các phản ứng sinh tồng hợp. [2] Đặc điểm của tế bào trần:  Có khả năng tiếp nhận một đoạn/toàn bộ DNA lạ hoặc cả một bào quan để cải tạo bộ máy di truyền.  Có thể dung hợp với tế bào cùng loài hay khác loài.  Có khả năng tái tạo vách cellulose và phục hổi toàn bộ chức năng của tế bào nguyên thuỷ (2-6 ngày);  Có thể tái sinh thành cây nguyên vẹn.  Dễ dàng nghiên cứu ở mức độ phân tử.[3] 2.2. Lịch sử nghiên cứu tế bào trần: Các nghiên cứu về tế bào trần trong thời kỳ 1960 và 1970 - Cooking 1960: Quy trình sử dụng enzyme để cô lập tế bào trần thực vật. - Ruesink 1973: Nghiên cứu những tính chất vật lý của màng sinh chất . - Willison et al. 1971: Nghiên cứu nhập bào và hấp thu các phần tử, các bào quan (Potrykus 1975) và vi sinh vật (Davey và Power 1975). - Howland et al. 1975: Phương pháp phá vỡ tế bào để nhanh chóng thâu nhận các bào quan và các đại phân tử mà không gặp phải sự biến dạng hư hỏng như các phương pháp ly trích thông thường. - Nickell và Torey 1969: Tạo ra tế bào lai sinh dưỡng liên quan đến sự cải thiện năng suất thu hoạch mùa vụ. - Takebe 1975: Do mỗi một tế bào cách ly với tế bào khác trong quần thể tế bào trần và là một hệ thống đơn bào nên có thể thao tác tương tự như quần thể vi sinh vật. Tính chất này được khai thác thành công trong thí nghiệm cho nhiễm CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS LÊ THỊ THUỶ TIÊN Trang 5 đồng loạt bởi virus, nuôi cấy nhân giống vô tính tế bào và phân lập các tế bào đột biến. - Pojnar et al. 1967: Tế bào trần phân lập từ mô quả cà chua được khảo sát chi tiết đầu tiên quá trình cung cấp enzym để phục hồi trở lại vách tế bào - Nagata và Takebe 1970: Nghiên cứu sự phân chia tế bào đầu tiên từ tế bào trần. - Grout and Coutts 1974 : Nghiên cứu bằng điện di có thể xác định bề mặt tế bào có tích điện và có thể trong một số điều kiện thông thường nào đó điện tích này là âm. - Power et al. 1970: Tìm ra hợp chất gây ra sự tan rã là nitrate sodium chúng làm giảm điện tích âm xuống làm cho màng tế bào sát lại gần nhau. - Kao và Michayluk 1974, Wallin et al. 1974: tìm ra chất Polyethylene glycol (PEG) được chấp nhận rộng rãi như một tác nhân gây ra sự tan rã - Power et al. 1976: Thực vật lai sinh dưỡng của Petunia hybrida và P. parodii đã được tạo ra thành công. - Cocking (1989): thành công khi sử dụng các đối tượng của họ cà Solanaceae để dung hợp tế bào trần. - Abdullah et al. 1986: tái tạo cây nguyên vẹn từ tế bào trần lúa, cô lập không phải từ lá nhưng từ dịch treo nuôi cấy tế bào. Các nghiên cứu về tế bào trần trong thời kỳ 1980 và 1990 - Petunia parodii và Petunia parviflora (Powder et al. 1980) : nhìn thấy được phương pháp tinh vi mở rộng trong tái tạo lại cây nguyên vẹn từ gia tăng vững chắc số các loài cây và trong sản xuất tế bào lai sinh dưỡng và cybrids. - Bajaj 1989: Các quy trình được phát triển xa hơn cho các kỹ thuật vi tiêm, dung hợp bằng điện, flow cytometry, hấp thu và tích hợp DNA, cô lập nhân và nhiễm sắc thể từ tế bào trần. - Cocking and Pojnar 1969: khám phá ra tế bào trần có thể bị nhiễm bởi virus khảm thuốc lá. - kích thích sự quan tâm về vấn đề hấp thu vào hệ thống tế bào trần, mà đỉnh điểm là sự biểu hiện của plasmid Ti trong vi khuẩn Agrobacterium gây khối u, được đưa và tế bào trần để biến đổi tế bào trần, cung cấp bằng chứng đầu tiên về vai trò độc lập của plasmid Ti ở khía cạnh này (Davey et al. 1980). - Zang et al. 1988: thành công trong lúa chuyển gen có khả năng sinh sản theo phương cách chuyển nạp bằng điện xung vào tế bào trần lúa plasmids chimaeric. - Davey và Kumar 1983: xác nhận rằng PEG cũng gia tăng sự thu hút virus và acid nhân của virus vào trong tế bào trần. CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS LÊ THỊ THUỶ TIÊN Trang 6 - Những năm cuối thập niên 1970 đầu thập niên 1980 đây là thời gian phối hợp giữa các kỹ thuật xác định plasmid Ti có thể chuyển nạp hay không vào tế bào trần thực vật. - Guerche et al. 1987: Chuyển nạp gen hữu thụ cho Brassica napus được chuyển gen bởi pABD1 vào trong tế bào trần thịt lá bằng phương pháp xung điện . - Kưhler et al. 1987: Chuyển gen trực tiếp cũng chứng minh khả năng tạo hạt rau Vigna aconitifolia kháng kanamycin mô sẹo tái tạo từ tế bào trần sốc nhiệt xử lý bởi PEG và pLGV NEO 2103. - Các nghiên cứu chuyển gen trực tiếp vào tế bào trần thực vật cũng cung cấp một hệ thống để quan sát sự biểu hiện gen trong khoảng thời gian vài giờ xử lý chuyển nạp. Các nghiên cứu biểu hiện gen tạm thời (ngắn ngủi) như vậy có ích trong việc đánh giá cấu trúc và gen khởi động khi gen reporter sẵn sàng có thể thử nghiệm ví dụ như CAT và b-glucurionidase. - Allshire et al. 1987: chứng chứng tỏ rằng các mẫu DNA lớn có thể đưa vào và biểu hiện ở tế bào động vật. Viễn cảnh hiện nay - Davey et al. 1974: chứng minh rằng tế bào trần có thể cô lập bằng enzyme từ một số nhóm tế bào ví dụ như từ tế bào biểu bì lá của thuốc lá rồi có thể tái tạo lại thành cây nguyên vẹn. - Cooking 1985: chứng minh rằng lông hút của rễ là sản phẩm tự nhiên của tế bào biểu bì rễ, và nó đã được chứng minh xử lý bằng enzyme có thể làm tiêu hủy đỉnh sinh trưởng của lông hút và phóng thích tế bào trần - Ahuja et al. 1983: Tế bào trần cô lập từ rễ cây con, thân lá mầm, và lá mầm của Lotus corniculatus (sen) sẵn sàng phân chia trong môi trường nuôi cấy để tạo ra mô sẹo và từ đó có thể sinh ra tế bào trần - Abdullah et al. 1986: phát hiện sự phát sinh phôi dưỡng trong các tế bào trần cô lập từ dịch nuôi cấy để tái tạo cây nguyên vẹn - Chand et al. (1988): quan sát thấy sự sự bóc trần tế bào cây dược liệu thân gỗ Solanum dulcamara ở điện áp 250 đến 1250 vol/cm2 trong ba xung điện kế tiếp nhau mỗi xung kéo dài 10 – 50 ms đã kích thích sự tăng trưởng của mô dẫn suất từ tế bào trần và cho thấy có gia tăng khả năng biệt hóa (Chand et al. 1988). - Sẽ rất quan trọng để mở rộng các nghiên cứu này trên hệ thống tế bào trần. Sẽ có ích khi tế bào trần Physcomitrella tái tạo chỉ sản sinh một khối u khi đáp ứng với ánh sáng đơn cực, và tế bào phân cực này phân chia sau 24 giờ từ tế bào trần cô lập, từ hai tế bào con có hai mặt phát triển khác nhau (Jenkin và Cove 1983). Biến đổi con đường phát triển có thể cung cấp đầu mối giải mã về sự phát triển tế bào thực vật, tế bào của nó và điều khiển phân tử. CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS LÊ THỊ THUỶ TIÊN Trang 7 - Al-Mallah et al. 1989 và 1990: đã quan sát cấu trúc nốt sần tạo ra ở rễ lúa, rễ cây con của cây cải cho dầu khi xử lý rễ với hỗn hợp enzyme cellulase và pectinase và cho nhiễm Rhizobium hay Bradyrhizobium - Cooking và Davey 1991: Các nghiên cứu này bao gồm sự phân hủy một phần vách tế bào làm lộ ra một phần màng sinh chất của tế bào biểu mô có ý nghĩa quan trọng cho việc nghiên cứu sự cộng sinh của Rhizobium đối với các cây trồng không phải họ đậu.[4] 3. Kỹ thuật thu nhận tế bào trần: Nguyên tắc xử lý vách tế bào: Sử dụng enzyme để phân huỷ vách tế bào. Các phương pháp tách tế bào trần: Trước khi thành tế bào bị phá bỏ, các tế bào cần được ngâm trong dung dịch làm ổn định áp suất thẩm thấu và được điều chỉnh cẩn thận liên quan đến khả năng thẩm thấu tế bào. Thường sử dụng mannitol hoặc sorbitol 12-14% (W/v) để duy trì tính ổn định màng sinh chất. Có ba phương pháp tách:  Phương pháp tách bằng cơ học: Cắt nhỏ nhu mô thịt lá rồi nghiền nhỏ cho vào dung dịch co nguyên sinh nên cả tế bào chất bị co nhỏ lại ngay lập tức cho vào dung dịch phản nguyên sinh, làm giãn nở 1 cách đột ngột đẩy phần nguyên sinh chất qua thành tế bào. Ta thu được tế bào trần. - Ưu điểm: Dụng cụ đơn giản - Nhược điểm: Khá phức tạp, hiệu quả thấp.  Phương pháp tách bằng enzyme: Dùng enzym pectinase, hemicelolase, cellulase. Để phá vỡ thành tế bào có thể dùng riêng lẻ hoặc kết hợp tuỳ vào từng loại tế bào. Enzym sử dụng phải tinh khiết, nếu còn chứa ít nhiều protease hoặc peroxidase sẽ làm hỏng tế bào trần. Hiệu quả của việc tạo tế bào trần còn phụ thuộc vào loại mô và cây được sử dụng. - Ưu điểm: Thu được lượng lớn các tế bào trần - Các bước tiến hành như sau:  Thu mẫu và vô trùng bề mặt lá.  Ngâm trong dung dịch có áp suất thẩm thấu cao -> hiện tượng co nguyên sinh chất, tế bào bị mất nước, nội dung tế bào nhỏ lại, màng nguyên sinh chất tách khỏi tế bào.  Loại bỏ biểu bì mặt dưới hoặc cắt mẫu lá thành các lát mỏng, tạo thuận lợi cho sự xâm nhập của các enzym.  Xử lý hỗn hợp enzym.  Tinh sạch và thu nhận các tế bào trần. CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS LÊ THỊ THUỶ TIÊN Trang 8  Chuyển tế bào trần vào các môi trường nuôi cấy thích hợp.  Phương pháp hỗn hợp: Sử dụng phương pháp cơ học để thu được 1 lượng lớn các tế bào tự do sau đó dùng enzyme thường được sử dụng để tách thu được tế bào trần. Thành tế bào cấu tạo gồm cellulose, hemicellulose, pectin và một lượng ít hơn là protein và lipit. Vì vậy cần một lượng hỗn hợp cả 3 loại enzym cellulaza, pectinaza hemicellulaza ở những tỷ lệ khác nhau.[1]  Theo nghiên cứu mới của TS. Nguyễn Thị Phương Thảo đã xác định được quy trình tách tế bảo trần cho 8 dòng khoai tây nhị bội trong đó: Nồng độ dung dịch co nguyên sinh:  Manitol: 0.5M  CaCl2: 0.01%  ES: 0.06M Nồng độ enzyme:  Tỷ lệ: ௠௔௖௘௥௢௭௬௠௘ ௖௘௟௟௨௟௢௦௘ = ଴.ଵ ଴.଺݉݃/100݈݉ − ଴.ଶ଴.଼ − ଴.ଵ଴.଼ ; ଴.ଵଵ  Thời gian ủ enzyme (14-16h), tốc độ và thời gian ly tâm: từ 150-200 vòng/phút trong thời gian 20 phút ở ly tâm lần 1; và 250-300 vòng/phút trong thời gian 5 phút ở ly tâm lần 2 và 3. [5] Thu nhận tế bào trần từ lá cây: Lá là nguồn nguyên liệu thông dụng và truyền thống cho kỹ thuật protoplast thực vật, do nó cho phép phân lập được một số lớn các tế bào tương đối đồng nhất (relatively uniform cells). Phương pháp cơ bản để tách tế bào trần từ lá cây 1. Khử trùng mẫu lá 2. Ngâm mẫu trong dung dịch thẩm thấu để tế bào co nguyên sinh chất 3. Tách lớp mặt dưới lá 4. Ngâm mẫu trong hỗn hợp enzym 5. Tinh sạch tế bào trần 6. Nuôi cấy tế bào trần trong môi trường thích hợp CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS LÊ THỊ THUỶ TIÊN Trang 9 Hình 1. Các bước phân lập tế bào trần từ lá cây Thu nhận tế bào trần từ mô sẹo: Các mô sẹo non nuôi cấy in vitro cũng là nguyên liệu lý tưởng để thu được một lượng lớn tế bào trần. Nuôi cấy các mô sẹo già hơn thường cho các tế bào có kích thước lớn hơn và vách tế bào dày, điều này sẽ gây khó khăn cho sự thủy phân bằng enzyme. Vì thế, người ta thường sử dụng các mô sẹo non sau hai tuần cấy chuyển để phân lập tế bào trần. Nồng độ enzyme đặc biệt là cellulose có thể thấp hơn so với lá. CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS LÊ THỊ THUỶ TIÊN Trang 10 Hình 2. Tạo mô sẹo, Tái sinh cây và sự phát triển của cây con từ tế bào trần Thu nhận tế bào trần từ huyền phù tế bào: Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào (cell suspension cultures) cũng cung cấp nguồn nguyên liệu rất tốt cho phân lập tế bào trần. Dịch huyền phù tế bào có mật độ cao được ly tâm, sau đó loại bỏ thể nổi (supernatants). Các tế bào được ủ trong hỗn hợp enzyme (cellulase + pectinase) và lắc từ 6 giờ tới qua đêm tùy thuộc vào nồng độ của các enzyme. Sử dụng nồng độ thấp của các enzyme mục đích ngăn cản sự kết dính trong dịch huyền phù tế bào để thu được hiệu suất phân lập tế bào trần cao hơn. Các protoplast có nguồn gốc từ nuôi cấy dịch huyền phù tế bào có tiềm năng tái sinh cây hơn hẳn ở các loài mà trước đó đã không thành công khi thử tái sinh từ các protoplast có nguồn gốc tế bào thịt lá. Những thành công gần đây khi tái sinh cây in vitro hoàn chỉnh từ protoplast của các loài ngũ cốc (kê, lúa miến, lúa mạch giống Golden Promise) đã chứng minh nuôi cấy dịch huyền phù tế bào là nguồn nguyên liệu lý tưởng cung cấp các tế bào trần toàn vẹn.[6] 4. Xác định mật độ tế bào trần và khả năng sống sót: Các tế bào trần đều có dạng hình tròn khi quan sát dưới kính hiển vi. Để xác định chất lượng của tế bào trần cần trải qua ba bước: - Bước 1: Xác định xem còn thành tế bào hay không? Dùng calcofour để xác định .Calcofour bám vào các phân tử cellulose và gây ra phát ánh sáng huỳnh quang mầu xanh rực rỡ khi soi dưới tia cực tím. Nếu các tế CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS LÊ THỊ THUỶ TIÊN Trang 11 bào đã bị loại bỏ hoàn toàn thành tế bào, hiển vi trường có mầu tối thẫm, các tế bào trần sẽ không nhìn thấy được ngoại trừ sự tự phát ánh sáng huỳnh quang đỏ của các lạp thể. - Bước hai: Xác định khả năng sống sót của tế bào trần. Bởi vì quy trình tách tế bào trần thường làm tổn thương hoặc làm hỏng một tỷ lệ tế bào nên không thể thiếu bước này. Có thể quan sát trực tiếp huyền phù tế bào trần dưới kính hiển vi ở vật kính 20x và 40x. Tế bào chất của những tế bào xuất hiện ở dạng dòng chảy hoặc chuyển động tròn, trông như những hạt nhỏ trong nguyên sinh chất là những tế bào sống. Ngược lại là những tế bào gần như bị chết do màng nguyên sinh chất bị phá huỷ. - Bước ba: Xác định sức sống của tế bào trần. Dùng kính hiển vi huỳnh quang kết hợp với nhuộm xanh evan. Trộn 2 ml dung dịch thuốc nhuộm 1% + 10 ml môi trường tách tế bào trần. Lấy 0,25 ml huyền phù tế bào trần và đưa vào 1 ml hỗn hợp dịch nhuộm trên, để trong 15 phút, Quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang. Những tế bào còn nguyên vẹn sẽ ngăn không cho thuốc nhuộm xâm nhập vào nguyên sinh chất, còn những tế bào có màng nguyên sinh chất bị mất chức năng sẽ bắt màu xanh và chúng không thể sinh trưởng được. Kiểm tra tỷ lệ sống của tế bào trần: Sử dụng fluorescein diacetat (FDA) ở thể tích 0,8ml dung dịch với 20ml môi trường chứa tế bào trần. Khi soi dưới ánh sáng tử ngoại, tế bào trần còn sống sẽ phát ánh sáng huỳnh quang màu xanh, những tế bào trần có màng sinh cất bị phá huỷ sẽ có màu sẫm hoặc màu tối.[1] 5. Nuôi cấy và tái sinh tế bào trần: 5.1. Môi trường nuôi cấy: a. Thành phần môi trường: Nói chung, môi trường nuôi cấy tế bào trần tương tự với môi trường nuôi cấy dịch huyền phù tế bào và mô sẹo. Tuy nhiên, nồng độ của Fe, Zn và amonium dùng trong môi trường nuôi cấy mô thực vật có thể là quá cao đối với nuôi cấy tế bào trần. Hầu hết muối của môi trường B5 và MS có cải biến một ít là thích hợp. Tăng nồng độ Ca2+ trong môi trường nuôi cấy protoplast từ 2-4 lần so với bình thường có lợi cho việc duy trì tính toàn vẹn của màng tế bào. Nồng độ sucrose thích hợp thường từ 3-5%, nhưng ở một số loài (ví dụ: thuốc lá) sucrose được sử dụng ở nồng độ thấp hơn (1,5%). Môi trường nuôi cấy tế bào trần sử dụng nitơ hữu cơ dạng CH và nitơ vô cơ NH4NO3 (20 mmol/L). CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS LÊ THỊ