Đề tài Tìm hiểu và thu nhận enzyme amylase từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae

Tìm hiểu và thu nhận enzyme Amylase từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ЖЖЖ Đề tài: Tìm hiểu và thu nhận enzyme amylase từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae GV lớp 07SH2D: Nguyễn Thị Thu Sang Sinh Viên: 1. 2. 3. 4. 5.  Nguyễn Chí Ty Phạm Phi Long Vương Lưu Thị Cẩm Vy Huỳnh Lê Thiên Tứ Nguyễn Anh Thắng  1 Tìm hiểu và thu nhận enzyme Amylase từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae Mục lục: Phần I: Tổng quan về enzym amylase I. Phân loại enzyme amylase II. Đặc tính và cơ chế tác dụng của enzym amylase I.1. α-amylase I.2. β-amylase I.3. γ-amylase I.4. oligo-1,6-glucosilase hay dextrinnase tới hạn I.5. Pullulanase I.6. α-glucosidase hay maltase Phần II: Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae I. Giới thiệu chủng nấm mốc Aspergillus oryzae II. Giới thiệu phương pháp phân lập nấm mốc Aspergillus oryzae Phần III: Công nghệ sản xuất enzym α-amylase I.Giới thiệu về phương pháp lên men bề mặt I.1. Ưu và nhược điểm của phương pháp nuôi cấy bề mặt I.2. Qui trình sản xuất II. Qui trình lên men công nghiệp tạo enzym α-amylase II.1. Nguyên liệu II.2. Qui trình công nghệ II.3. Các yếu tố ảnh hưởng khi thu nhận enzym α-amylase từ nấm mốc Aspergillus Oryzae II.3.1. Sinh trưởng và sinh tổng hợp amylase từ nấm II.3.2. Các yếu tố dinh dưỡng II.3.3. Các yếu tố khác Phần IV : Ứng dụng Phần V: Phụ lục và tài liệu tham khảo  2 Tìm hiểu và thu nhận enzyme Amylase từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae Lời giới thiệu: Tinh bột là sản phẩm tự nhiên quan trọng nhất có nhiều ứng dụng trong kỹ thuật và trong đời sống con người. Nhiều nước trên thế giới sử dụng nguồn tinh bột từ khoai tây, lúa mì, ngô (sắn), còn riêng ở nước ta thì sử dụng gạo và khoai mì là nguồn tinh bột chủ yếu. Trong chế biến tinh bột và đường, công đoạn quan trọng nhất là thuỷ phân tinh bột về các đường đơn giản. Sau đó, chủ yếu trên cơ sở đường đơn nhờ lên men, người ta sẽ nhận được rất nhiều sản phẩm quan trọng như: rượu cồn, rượu vang, bia, các loại acid hữu cơ, amino acid,…. Quá trình thuỷ phân tinh bột gồm hai công đoạn chủ yếu là giai đoạn hồ hoá và giai đoạn đường hoá. Để thực hiện hai công đoạn công nghệ nói trên, trong thực tế sản xuất người ta áp dụng hai cách: Thuỷ phân tinh bột bằng acid và bằng enzym. Để thuỷ phân tinh bột từ lâu người ta đã sử dụng acid vô cơ như HCl và H2SO4. Nhưng kết quả cho thấy, thuỷ phân bằng acid rất khó kiểm soát và thường tạo nhiều sản phẩm không mong muốn và không đáp ứng tiêu chuẩn an toàn thực phẩm. Do vậy, việc thay thế và ứng dụng enzym để thuỷ phân tinh bột là một kết quả tất yếu của lịch sử phát triển. Enzym amylase đã được tìm ra đã góp phần quan trọng cho nhiều ngành công nghiệp chế biến thực phẩm. Enzym amylase có thể tìm thấy ở nhiều nguồn khác nhau như amylase từ thực vật, động vật và VSV. Amylase càng ngày càng được thay thế acid trong sản xuất ở qui mô công nghiệp. Hiện nay, các nhà sản xuất có thể sử dụng amylase có khả năng chịu nhiệt cao mà không bị mất hoạt tính, chẳng hạn amylase được tách chiết từ VSV, cụ thể là các chủng vi khuẩn chịu nhiệt được phân lập từ những suối nước nóng. Ngoài ra, amylase còn có nhiều ưu điểm hơn khi sử dụng acid để thuỷ phân tinh bột: Năng lượng xúc tác thấp, không yêu cầu cao về thiết bị sử dụng, giảm chi phí cho quá trình tinh sạch dịch đường. Nguồn amylase có thể lấy từ mầm thóc, mầm đại mạch ( malt), hạt bắp nảy mầm, hay từ nấm mốc,… Nguyên liệu cho sản xuất là gạo, bắp, khoai mì,… đây là những nguồn nguyên liệu dễ tìm, rẻ tiền có thể tìm thấy dễ dàng ở nước ta. Do đó, đây là một lợi thế và là hướng phát triển mạnh làm cơ sở cho nhiều ngành khác phát triển. Ví dụ: sản xuất bánh kẹo, bia, cồn, sirô và làm mềm vải,…  3 Tìm hiểu và thu nhận enzyme Amylase từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae Phần I: Tổng quan về enzym amylase I.Phân loại enzyme amylase: Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật . Các enzyme này thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử trong nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước: Exoamylase  R.R’ + H-OH Amylase  RH + R’OH Endoamylase β-amylase  γ-amylase Khử trực tiếp α-dextrin 6 – glucosidase (Pullulanase)  Enzyme khử nhánh  α-amylase Khử gián tiếp Oligo-1,6 glucosidase (transglucosidase) Và amilo 1,6-glucosidase Cơ chất tác dụng của amylase là tinh bột và glycogen II.Đặc tính và cơ chế tác dụng của enzym amylase II.1. α-amylase α-amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần amino acid khác nhau, mỗi loại α-amylase có một tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng. α-amylase là một protein giàu tyrosine, tryptophan, acid glutamic và aspartic. Các glutamic acid và aspartic acid chiếm khoảng ¼ tổng lượng amino acid cấu thành nên phân tử enzyme: - - -  α-amylase có ít methionine và có khoảng 7-10 gốc cysteine. Trọng lượng phân tử của α-amylase nấm mốc: 45.000-50.000 Da ( Knir 1956;Fisher,Stein, 1960 ). Amylase dễ tan trong nước, trong dung dịch muối và rượu loãng.  4 Tìm hiểu và thu nhận enzyme Amylase từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae - - -  Protein của các α-amylase có tính acid yếu và có tính chất của globuline. Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH=4,2-5,7 ( Bernfeld P, 1951 ). α-amylase là một metaloenzyme. Mỗi phân tử α-amylase đều có chứa 1-30 nguyên tử gam Ca/mol, nhưng không ít hơn 1-6 nguyên tử gam Ca/mol. Ca tham gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc 3 của enzyme, duy trì hoạt động của enzyme ( Modolova, 1965 ). Thành phần amino acid của α-amylase ở nấm mốc Aspergillus như sau ( g/100 g protein ): Không giống các α-amylase khác, amylase của Asp.oryzae có chứa phần phi protein là polysaccharide. Polysaccharide này bao gồm 8 mol maltose, 1 mol glucose, 2 mol hexozamin trên mỗi mol enzyme ( Akabori et amiloza, 1965 ). Vai trò của polyose này vẫn chưa rõ, song đã biết được rằng nó không tham gia vào thành phần của trung tâm hoạt động và nằm ở phía trong phân tử enzyme. α-amylase của nấm mốc hầu như chỉ tấn công những hạt tinh bột bị thương tổn. Sản phẩm cuối cùng của thủy phân amylase là glucose và maltose. Đối với nấm sợi tỉ lệ là 1:3,79 ( Hanrahan, Caldwell, 1953 ) α-amylase của nấm sợi không tấn công liên kết α-1,6 glucoside của amylopectin, nên khi thủy phân nó sẽ tạo thành các dextrin tới hạn phân nhánh. Đây là một cấu trúc phân tử tinh bột do enzym α-amylase phân cắt tạo thành dextrin tới hạn phân nhánh. 5alamine 6,8 glycine 6,6 valine 6,9 leucine 8,3 Isoleucine 5,2 prolin 4,2 phenylalanine 4,2 tyrosine 9,5 trytophan 4,0 xetin 6,5 trionin 10,7 cystein + cystine 1,6 glutamic acid 6,9 amide 1,5 Tìm hiểu và thu nhận enzyme Amylase từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae Sản phẩm thủy phân cuối cùng của tinh bột dưới tác dụng của amylase nấm sợi chủ yếu là maltose, thứ đến là maltotriose. Khi dùng nồng độ α-amylase VSV tương đối lớn có thể chuyển hóa 70-85% tinh bột thành đường lên men. Còn các α-amylase của nấm mốc thì mức độ đường hóa đến glucose và maltose có thể lên tới 84-87%. Điều kiện hoạt động của α-amylase từ các nguồn khác nhau thường không giống nhau. pH tối thích cho hoạt động của α-amylase từ nấm sợi là 4,0-4,8 ( có thể hoạt động tốt trong vùng pH từ 4,5-5,8 ). Theo số liệu của Liphis, pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa và đường hóa của chế phẩm amylase từ Asp.oryzae trong vùng 5,6-6,2. Còn theo số liệu của Fenixova thì pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa của nó là 6,0- 7,0. Độ bền đối với tác dụng của acid cũng khác khác nhau. α-amylase của Asp.oryzae bền vững đối với acid tốt hơn là α-amylase của malt và vi khuẩn Bac.subtilis. Ở pH= 3,6 và 0oC, α-amylase của malt bị vô hoạt hoàn toàn sau 15-30 phút; α-amylase vi khuẩn bị bất hoạt đến 50%, trong khi đó hoạt lực của α-amylase của nấm sợi hình như không giảm bao nhiêu ( Fenilxova, Rmoshinoi 1989 ). Trong dung dịch α-amylase nấm sợi bảo quản tốt ở pH= 5,0-5,5; α-amylase dextrin hóa của nấm sợi đen có thể chịu được pH từ 2,5-2,8.Ở 0oC và pH= 2,5, nó chỉ bị bất hoạt hoàn toàn sau 1 giờ. Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α-amylase từ các nguồn khác nhau cũng không đồng nhất, α-amylase của nấm sợi rất nhạy cảm đối với tác động nhiệt. . Nhiệt độ tối thích của nó là 500C và bị vô hoạt ở 70OC( Kozmina, 1991 ). Trong dung dịch đệm pH= 4,7, α-amylase của Asp.oryzae rất nhạy với tác động của nhiệt độ cao, thậm chí ở 400C trong 3 giờ hoạt lực dextrin hóa của nó chỉ còn 22-29%, hoạt lực đường hóa còn 27-85%. Ở 500C trong 2 giờ, α-amylase của nấm sợi này bị vô hoạt hoàn toàn ( Miller và cộng sự ). α-amylase từ các nguồn khác nhau có nhiều điềm rất giống nhau. α-amylase có khả năng phân cách các liên kết α-1,4-glucoside nằm ở phía bên trong phần tử cơ chất ( tinh bột hoặc glycogen ) một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào cả. α-amylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân cả hạt tinh bột nguyên song với tốc đột rất chậm.  6 Tìm hiểu và thu nhận enzyme Amylase từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-amylase là quá trình đa giai đoạn. + Ở giai đoạn đầu ( giai đoạn dextrin hóa ):Chỉ một số phân tử cơ chất bị thủy phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin ), độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh ( các amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh ). + Sang giai đoạn 2 (giai đoạn đường hóa): Các dextrin phân tử thấp tạo thành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu với iodine. Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi α-amylase cho tới disaccharide và monosaccharide. Dưới tác dụng của α-amylase, amylose bị phân giải khá nhanh thành oligosaccharide gồm 6-7 gốc glucose( vì vậy, người ta cho rằng α-amylase luôn phân cắt amylose thành từng đoạn 6-7 gốc glucopiranose 1). + Sau đó, các mạch glucose này bị phân cách tiếp tục tạo nên các mạch glucose colagen cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose và maltotriose và maltose. Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân của amylose chứa 13% glucose và 87% maltose. Tác dụng của α-amylase lên amylopectin cũng xảy ra tương tự nhưng vì không phân cắt được liên kết α-1,6-glycoside ở chỗ mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên dù có chịu tác dụng lâu thì sản phẩm cuối cùng, ngoài các đường nói trên (72% maltose và 19% glucose) còn có dextrin phân tử thấp và isomaltose 8%. Tóm lại, dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể chuyển thành maltotetrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên, thông thường α-amylase chỉ thủy phân tinh bột thành chủ yếu là dextrin phân tử thấp không cho màu với Iodine và một ít maltose. Khả năng dextrin hóa cao của α-amylase là tính chất đặc trưng của nó. Vì vậy, người ta thường gọi loại amylase này là amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa. II.2. β-amylase Còn có tên gọi khác là α-1,4-glucan-mantohydrolase 3.2.1.2 β-amylase xác tác sự thuỷ phân các liên kết α-1,4 glucan trong tinh bột, glucogen và polysaccharide đồng loại, phân cắt tuần tự từng gốc maltose một từ đầu không khử của mạch.Maltose tạo thành có cấu hình β, vì thế amylase này được gọi là β-amylase. β-amylase không thuỷ phân hạt tinh bột nguyên lành mà thuỷ phân mạnh mẽ hồ tinh bột. β-amylase phân giải 100% amylose thành maltose và phân giải 54-58% amylopectin thành maltose. Quá trình thuỷ phân amylapectin tạo thành được 10-12 phân tử maltose,phần saccharide còn lại là dextrin phân tử lớn có chứa rất nhiều liên kết α-1,6 glucoside. β-amylase là một albumin, tâm xúc tác có chứa các nhóm-SH và nhóm –COOH cùng với vòng imidazol của các gốc histidin. pH tối tích trong dung dịch tinh bột thuần khiết của β-amylase là 4,6 và nhiệt độ tối thích trong dung dịch tinh bột thuần khiết là 40-500C, β-amylase bị vô hoạt ở 700C. β-amylase chỉ phố biến trong thế giới thực vật đặc biệt có nhiều trong các hạt nảy mầm. Trong vi khuẩn không có β-amylase. II.3. γ-amylase ( α-1,4-glucan-glucohydrolase,3.2.1.3 hay Glucoamylase )  7 Tìm hiểu và thu nhận enzyme Amylase từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae γ-amylase có khả năng xúc tác thuỷ phân cả liên kết α-1,4 lẫn α-1,6 glucan. Vì thế các nhà nghiên cứu Nhật Bản ( 1964-1984) đã đề nghị đặt cho nó một tên phân loại khác là α-1,4-glucan-glucohydrolase. γ- amylase được các nhà khoa học Nhật Bản tách ra lần đầu tiên từ Asp.awamori. Sau đó nó được tìm thấy trên Rhizopus delemar, Asp.niger, Asp. oryzae rồi ở các nhóm VSV khác và ở mô động vật. γ-amylase là enzyme ngoại phân, nó thuỷ phân polysaccharide từ đầu không khử để tạo ra glucose. Khi thuỷ phân tinh bột cùng với glucose còn có thể tạo thành các α-oligosaccharide. γ-amylase có khả năng thuỷ phân hoàn toàn tinh bột, glucogen, amylopectin dextrin cuối, panose, isomatose và maltose tới glucose. Các cơ chất có cấu tạo phân nhánh bị γ-amylase tấn công với tốc độ khá lớn. Đa số γ-amylase đã biết đều thuộc loại enzyme “acid”. Thể hiện hoạt lực tối đa ở vùng pH 3,5-5,5. So với α-amylase, γ-amylase bền hơn đối với acid nhưng lại kém bền hơn dưới tác dụng của rượu etylic, aceton không được bảo bảo vệ bằng Ca2+ . Điểm đẳng điện của γ-amylase từ các nguồn khác nhau không đồng nhất: γ-amylase từ Asp.niger là 6,5, γ-amylase từ Asp.amamori là 7,5, γ-amylase từ Rh.delamar là 7,4. Hiện nay chỉ mới biết được phân tử lượng của một số chế phẩm γ-amylase tinh thể. Chẳng hạn như phân tử lượng của γ-amylase tách từ Asp.niger là 97000Dal. II.4. Oligo-1,6-glucosilase hay dextrinnase tới hạn Enzyme này thuỷ phân các loại liên kết α-1,6 glucosid trong izomaltose, pantose và các dextrin tới hạn và có thể chuyển hoá các chất này đến các loại đường lên man được.Các loại nấm sợi Asp.awamori, Asp.oryzae, Asp.usamii sinh tổng hợp enzyme này mạnh hơn cả. Chúng thuỷ phân dextrin sâu sắc hơn là α,β- amylase, do đó mà maltose được tích tụ nhiều trong dung dịch thuỷ phân. Các dextrinnase hoạt động tối thích ở nhiệt độ 400C và pH 5,1. II.5. Pullulanase Ở vi khuẩn Aerobacter aerogenes người ta tìm thấy các enzyme có khả năng thuỷ phân liên kết α-1,6 glucoside trong các polyose và oligosaccharide kiểu tinh bột và glucogen. Cơ chất đặc thù cho enzyme này là pullulan- một polyose được tách từ giả nấm men Aureobasidium punllana sym.Pullulasia pullulans. Phân tử lượng của Pullulanase là 145 000 Dal, chế phẩm enzyme thu được khi kết tủa bằng aceton có pH hoạt động tối thích là 5,0 và nhiệt độ tối thích là 47,50C. Pullulanase phân giải các liên kết α-1,6 glucoside bị bao quanh bởi các liên kết α-1,4. Nó còn có khả năng thuỷ phân cả những dextrin phân tử thấp. II.6. α-glucosidase hay maltase Nấm sợi sản sinh enzyme này. Nó thuỷ phân maltose thành glucose nhưng không thuỷ phân tinh bột.Một số tác giả cho rằng nó có hoạt tính glucosyltransferase, tức là có khả năng chuyển các gốc glucosyl sang đường và rượu. Phần II: Chủng nấm mốc Aspergillus Oryzae  8 Tìm hiểu và thu nhận enzyme Amylase từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae Quá trình lên men là hoạt động sống của tế bào VSV trong môi trường. Quá trình này xảy ra ở điều kiện tự nhiên và quá trình sản xuất công nghiệp. Bản chất của 2 quá trình này có thể nói là như nhau nhưng về mặt hình thức và phương diện thì khác nhau hoàn toàn. Quá trình lên men trong điều kiện tự nhiên là một quy luật sống còn của VSV. Tự tham gia tổng hợp nên chất sống từ vật liệu lên men có trong tự nhiên. Các VSV và vật chất sử dụng trong quá trình lên men tự nhiên rất phức tạp, không đồng đều về chủng loại và về số lượng. Mặt khác, quá trình lên men này không được kiểm soát, bao gồm nhiều pha và không định hướng. Sản phẩm lên men là đa dạng, không ổn định; do dó, chất lượng sản phẩm kém không đồng nhất. Quá trình lên men trong sản xuất công nghiệp, tất cả các khâu về phân lập giống VSV, cơ chất, nhiệt độ, pH, độ ẩm… các quá trình phản ứng sinh học, quá trình thu nhận, tinh sạch sản phẩm đều được kiểm soát hoàn toàn ( Sản phẩm tạo ra mang tính định hướng rõ ràng ngay từ lúc đầu ở khâu chọn giống VSV cho đến cuối quá trình thu nhận sản phẩm ) . Do đó chất lượng sản phẩm được cải thiện . I. Giới thiệu về chủng nấm mốc Aspergillus oryzae Condium of Aspergillus oryzae Asp. oryzae là một loại nấm vi thể thuộc bộ Plectascales, lớp Ascomycetes ( nang khuẩn ). Cơ thể sinh trưởng của nó là một hệ sợi bao gồm những sợi rất mảnh, chiều ngang 5-7 µm, phân nhánh rất nhiều và có vách ngang , chia sợi thành nhiều bao tế bào ( nấm đa bào ). Từ những sợi nằm ngang này hình thành những sợi đứng thằng gọi là cuống đính bào tử, ở đó có cơ quan sinh sản vô tính. Cuống đính bào tử của Asp.oryzae thường dài 1-2 mm nên có thể nhìn thấy bằng mắt thường. Phía đầu cuống đính bào tử phồng lên gọi là bọng. Từ bọng này phân chia thành những tế bào nhỏ, thuôn, dài, gọi là những tế bào hình chai. Đầu các tế bào hình chai phân chia thành những bào tử đính vào nhau, nên gọi là đính bào tử. Đính bào tử của Asp.oryzae có màu vàng lục hay màu vàng hoa cau…  9 Tìm hiểu và thu nhận enzyme Amylase từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae Đặc điểm của giống Asp.oryzae: giàu các enzyme thủy phân nội bào và ngoại bào (amylase, protease, pectinasa,…), ta rất hay gặp chúng ở các kho nguyên liệu, trong các thùng chứa đựng bột, gạo… đã hết nhưng không được rửa sạch, ở cặn bã bia, bã rượu, ở lỏi ngô, ở bã sắn… Chúng mọc và phát triển có khi thành lớp mốc, có màu sắc đen ,vàng… Màu do các bào tử già có màu sắc. Các bào tử này, dễ bị gió cuốn bay xa và phát tán khắp nơi, khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ mọc thành mốc mới. II.Giới thiệu phương pháp phân lập nấm mốc Aspergillus Oryzae Trong đất có nhiều loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase. Ở nấm mốc nguồn cơ chất thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp enzyme amylase này là tinh bột. Chúng ta có thể phân lập từ đất, thức ăn hay có thể mua trực tiếp từ nơi cung cấp nấm mốc giống. Ưu điểm của việc này là giống mua thì thời gian bảo quản và hiệu suất chất lượng giống được đảm bảo chắc chắn. Tuy nhiên, quá trình phân lập giống này có thể cho những kết quả đầy thú vị và có ý nghĩa trong việc bổ sung một chủng giống mới tại phòng thí nghiệm. Quá trình lấy mẫu: Có thể lấy mẫu từ đất ẩm khoảng 100g hay khoai tây cắt lát đem chôn xuống đất. Sau khoảng 8 ngày, đào hố lấy những miếng khoai tây ra, rủ sạch cát đất bám trên bề mặt miếng khoai tây. Sau đó cho vào bao nyclon và mang về phòng thí nghiệm. Tiến hành thí nghiệm phân lập: Nghiền mẫu đối với những mẫu khoai tây Lấy 10g mẫu đất hoặc mẫu khoai tây (đã làm nhuyễn) cho vào 90ml nước cất vô trùng sau đó đảo trộn mẫu. Dùng pipet hút 10ml từ dung dịch mẫu ban đầu chuyển sang 1 ông nghiệm khác có chứa 90ml nước cất vô trùng. Tiếp tục pha loãng mẫu ở nồng độ 10-3, 10-4 ở những ống nghiệm tiếp theo. Hút 0,1ml cho vào đĩa petri có chứa môi trường dinh dưỡng chọn lọc cho nấm mốc phát triển,môi trường PDA (Potato Dextro Agar). Dùng que trải, trải đều phần dinh dưỡng trên bề mặt môi trường đem ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 3 ngày.  10 Tìm hiểu và thu nhận enzyme Amylase từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae Mốc sẽ sử dụng nguồn tinh bột làm cơ chất, nên ở những chỗ này sẽ xuất hiện những quầng sáng xung quanh khuẩn lạc. Nhận biết bằng cách bổ sung Iodine vào trong môi trường trước khi cấy. Có tác dụng là chất chỉ thị cho tinh bột. Cấy truyền những mốc đặc trưng trong môi trường PDA trong ống thạch nghiêng với 1% tinh bột cho phép mốc phát triển trong 72 giờ sau đó có thể dự trữ trong máy làm đông. -Nhân giống vi sinh vật ở bình tam giác (qui mô nhỏ). Đổ 10ml H2O cất vô trùng vào ống thạch nghiêng có chứa bào tử nấm. Lắc đều cho bào tử hoà trộn vào môi trường đến khi tạo dung dịch huyền phù. Hút 0,1ml dịch huyền phù có chứa bào tử nấm cho vào bình tam giác có chứa môi trường sinh trưởng của nấm: PH = 6,5 Phân phối khoảng 30 – 40ml môi trường vào erlen 50ml đem khử trùng bởi Autoclave ở 1210C trong 15 phút sau đó để nguội đến nhiệt độ phòng. Sau đó đem ủ ở 25 – 300C trong vòng 72 giờ trên máy lắc 200 vòng/phút. Sau khi nhân giống thành công có thể sử dụng ngay hoặc đem đi bảo quản và dự trữ, để có hiệu quả cao cho nấm mốc g