Khóa luận Thử nghiệm sản xuất kháng huyết thanh kháng vi khuẩn E.coli

1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ Trong chăn nuôi việc chẩn đoán, phát hiện bệnh sớm để điều trị kịp thời sẽ làm giảm đáng kể những thiệt hại gây ra về kinh tế cũng nhƣ sức khỏe của ngƣời tiêu dùng. Tùy theo từng tác nhân gây bệnh mà có các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh khác nhau. Thông thƣờng để chẩn đoán bệnh do vi sinh vật ngƣời ta dùng phƣơng pháp cổ điển là nuôi cấy phân lập tế bào vi sinh vật, định danh chúng bằng các phản ứng huyết thanh học. Kĩ thuật hiện đại nhƣ PCR (Polymerase Chain Reaction) có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn các phƣơng pháp kinh điển do đó giúp chẩn đoán nhanh và chính xác hơn. Nhƣng kĩ thuật này đòi hỏi phải có trang thiết bị và nguyên liệu riêng, đắt tiền, kĩ thuật thực hiện còn phức tạp, cán bộ kĩ thuật phải có trình độ kĩ thuật nhất định. Các kĩ thuật chẩn đoán miễn dịch học mà điển hình là kĩ thuật ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) cũng tỏ ra rất hiệu quả trong việc chẩn đoán nhanh và chính xác các vi sinh vật gây bệnh không thua kém phƣơng pháp PCR. Nguyên tắc của kĩ thuật này dựa trên sự kết hợp giữa kháng nguyên với một kháng thể đặc hiệu. Dựa vào nguyên tắc này các nhà sản xuất tạo ra các bộ kít chẩn đoán phát hiện vi sinh vật gây bệnh để ngƣời chăn nuôi có thể tự mình kiểm tra xem vật nuôi có mang mầm bệnh hay không nhƣ bộ kit chẩn đoán bệnh đốm trắng cho tôm. Hiện nay ở Việt Nam việc sản xuất kháng huyết thanh và kháng thể phục vụ cho việc chẩn đoán bệnh bằng miễn dịch học trong chăn nuôi còn ít, chỉ mới áp dụng cho một số bệnh. Xuất phát từ yêu cầu thực tế đó chúng tôi đi vào nghiên cứu đề tài “Thử nghiệm sản xuất kháng huyết thanh kháng vi khuẩn E. coli” để phục vụ cho việc chẩn đoán nhanh và điều trị bệnh kịp thời. Ngoài ra có thể ứng dụng vào sản xuất kháng huyết thanh kháng các vi sinh vật gây bệnh quan trọng khác. 1.2. MỤC ĐÍCH, YÊU CẦU 1.2.1. Mục đích Xây dựng và hoàn thiện quy trình sản xuất kháng huyết thanh phục vụ cho công tác chẩn đoán bệnh. 1.2.2. Yêu cầu  Xây dựng quy trình tiêm thỏ thí nghiệm.  Thu nhận kháng huyết thanh từ thỏ thí nghiệm.  Đánh giá chất lƣợng kháng huyết thanh thu đƣợc.

pdf64 trang | Chia sẻ: tuandn | Ngày: 27/04/2013 | Lượt xem: 1968 | Lượt tải: 4download
Bạn đang xem nội dung tài liệu Khóa luận Thử nghiệm sản xuất kháng huyết thanh kháng vi khuẩn E.coli, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT KHÁNG HUYẾT THANH KHÁNG VI KHUẨN E. coli Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2001-2005 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN VÂN ANH Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 ii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT KHÁNG HUYẾT THANH KHÁNG VI KHUẨN E. coli Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. NGUYỄN NGỌC HẢI NGUYỄN VÂN ANH PGS. TSKH. NGUYỄN LÊ TRANG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 iii LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn: - Ban Giám Hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập. - Các Thầy Cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học cùng các Thầy Cô đã luôn tận tình hƣớng dẫn, giảng dạy, giúp đỡ và động viên tôi. - TS. Nguyễn Ngọc Hải và PGS. TSKH. Nguyễn Lê Trang đã trực tiếp hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp. - Các chị Nguyễn Thị Nguyệt Thu, Đỗ Thị Châm, Dƣơng Ngọc Diễm, Võ Thị Mỹ Duyên, Lạc Thị Thêm, Doãn Thị Sim thuộc phòng Miễn dịch viện Pasteur Tp. HCM đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo tôi trong suốt thời gian thực hiện khoá luận. - Thầy Lê Anh Phụng, cô Nguyễn Thị Kim Loan phụ trách phòng thí nghiệm Vi Sinh và các thầy cô thuộc Bệnh xá Thú y đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua. - Toàn thể lớp CNSH27 đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian làm đề tài. Con thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những ngƣời thân trong gia đình luôn tạo điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập tại trƣờng. Chân thành cảm ơn. Tháng 08 năm 2005 Nguyễn Vân Anh iv TÓM TẮT NGUYỄN VÂN ANH, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2005. “THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT KHÁNG HUYẾT THANH KHÁNG VI KHUẨN E. coli” Hội đồng hƣớng dẫn: 1. TS. Nguyễn Ngọc Hải 2. PGS. TSKH. Nguyễn Lê Trang Thời gian nghiên cứu: từ tháng 2/2005 đến tháng 8/2005 Địa điểm nghiên cứu:  Viện Pasteur Tp. HCM  Bệnh xá Thú y Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. HCM  Phòng thí nghiệm Vi Sinh. Đánh giá chất lƣợng kháng huyết thanh thu đƣợc ở hai qui trình gây đáp ứng miễn dịch ngắn ngày và dài ngày. Đề tài thực hiện trên 2 lô thỏ thí nghiệm đƣợc gây miễn dịch theo hai qui trình khác nhau: qui trình ngắn ngày (35 ngày) và qui trình dài ngày (154 ngày). Kháng huyết thanh thu đƣợc từ hai qui trình tủa trong amonium sulfate bão hòa và có thể phục hồi bằng phƣơng pháp thẩm tích. Hiệu quả đáp ứng miễn dịch của hai qui trình đƣợc đánh giá qua phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính (định tính) và phản ứng ngƣng kết chậm trong ống nghiệm (định lƣợng). Ngoài ra để tăng cƣờng độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng ngƣng kết kháng huyết thanh đƣợc xử lí gắn với Staphylococcus aureus và hấp phụ với kháng nguyên vi khuẩn K88+. Kết quả đạt đƣợc: 1. Cả hai qui trình ngắn ngày và dài ngày đều gây đáp ứng miễn dịch trên thỏ. 2. Phát hiện đƣợc kháng thể trong kháng huyết thanh sau khi tiêm mũi mẫn cảm 14 ngày bằng phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính. 3. Xác định đƣợc nồng độ S. aureus thích hợp để gắn với KHT nhằm tăng độ nhạy của phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính. KHT đƣợc xử lí gắn với S. aureus (nồng độ 1014 tế bào/ ml) và tỉ lệ thể tích KHT : S. aureus là 1:4. 4. Hiệu giá kháng thể ngƣng kết ở qui trình dài ngày cao hơn qui trình ngắn ngày. 5. Tách kháng thể ra khỏi kháng huyết thanh bằng cách tủa trong muối amonium sulfate bão hòa. 6. Hấp phụ các kháng thể không đặc hiệu trong kháng huyết thanh. v MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm ơn ........................................................................................................... iii Tóm tắt ................................................................................................................. iv Mục lục ................................................................................................................. v Danh sách các chữ viết tắt .................................................................................... ix Danh sách các hình ............................................................................................... x Danh sách các bảng .............................................................................................. xi Danh sách các biểu đồ ......................................................................................... xii Danh sách các sơ đồ ........................................................................................... xiii 1. MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................. 1 1.2. MỤC ĐÍCH, YÊU CẦU ................................................................................. 2 1.2.1. Mục đích .................................................................................................. 2 1.2.2. Yêu cầu .................................................................................................... 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................................... 3 2.1. ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH ................................................................................. 3 2.1.1. Khái niệm miễn dịch ................................................................................ 3 2.1.2. Kháng nguyên .......................................................................................... 3 2.1.2.1. Định nghĩa ........................................................................................ 3 2.1.2.2. Khái niệm về epitop ........................................................................... 3 2.1.3. Kháng thể dịch thể ................................................................................... 4 2.1.3.1. Định nghĩa ......................................................................................... 4 2.1.3.2. Cấu trúc của một phân tử immunoglobulin ....................................... 4 2.1.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng đáp ứng miễn dịch của động vật .... 5 2.1.4.1. Loài động vật ..................................................................................... 5 2.1.4.2. Yếu tố di truyền .................................................................................. 5 vi 2.1.4.3. Kháng nguyên ..................................................................................... 6 2.1.4.4. Qui trình gây miễn dịch ..................................................................... 7 2.1.4.5. Chất bổ trợ ......................................................................................... 8 2.1.5. Cơ chế đáp ứng miễn dịch dịch thể .......................................................... 9 2.1.5.1. Các tế bào tham gia đáp ứng miễn dịch dịch thể............................... 9 2.1.5.2. Cơ chế hình thành đáp ứng miễn dịch dịch thể ............................... 11 2.2. VI KHUẨN E. coli ........................................................................................ 14 2.2.1. Định nghĩa .............................................................................................. 14 2.2.2. Đặc tính sinh hóa .................................................................................... 14 2.2.3. Yếu tố kháng nguyên ............................................................................. 14 2.2.3.1. Kháng nguyên thân O ...................................................................... 14 2.2.3.2. Kháng nguyên bề mặt hay kháng nguyên vỏ K .............................. 15 2.2.3.3. Kháng nguyên lông roi H ............................................................... 15 2.3. TÁCH KHÁNG THỂ BẰNG AMMONIUM SULFATE ............................ 15 2.4. HỒI CHẾ KHÁNG THỂ BẰNG PHƢƠNG PHÁP THẨM TÍCH .............. 16 2.5. PHẢN ỨNG KHÁNG NGUYÊN – KHÁNG THỂ ...................................... 17 2.5.1. Các lực liên kết kháng nguyên – kháng thể (KN-KT) ........................... 17 2.5.2. Các đặc tính chung của sự liên kết KN-KT ........................................... 17 2.5.3. Phản ứng ngƣng kết KN-KT .................................................................. 18 2.5.3.1. Phản ứng ngƣng kết KN-KT xảy ra theo 2 pha ............................... 18 2.5.3.2. Các yếu tố ảnh hƣởng đến phản ứng ngƣng kết KN-KT ................ 19 2.6. PROTEIN A .................................................................................................. 19 3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM .......................................... 21 3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM ........................................................................ 21 3.1.1. Thời gian thực nghiệm ........................................................................... 21 3.1.2. Địa điểm ................................................................................................. 21 3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ......................................................................... 21 3.3. VẬT LIỆU THÍ NGHIỆM ............................................................................ 21 3.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................. 22 3.4.1. Gây đáp ứng miễn dịch trên thỏ ............................................................. 22 3.4.1.1. Chuẩn bị dịch tiêm .......................................................................... 22 3.4.1.2. Tiêm thú thí nghiệm ....................................................................... 22 vii 3.4.1.3. Bố trí thí nghiệm ............................................................................. 23 3.4.2. Thu nhận kháng huyết thanh .................................................................. 25 3.4.2.1. Tách kháng thể bằng amonium sulfate bão hoà .............................. 26 3.4.2.2. Phục hồi kháng thể ......................................................................... 26 3.4.3. Xử lí kháng huyết thanh ......................................................................... 27 3.4.3.1. Hấp phụ kháng thể không đặc hiệu ................................................. 28 3.4.3.2. Gắn kháng thể với protein A của Staphylococcus aureus ............... 29 3.4.4. Đánh giá ................................................................................................. 30 3.4.4.1. Định tính (bằng phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính) ......... 30 3.4.4.2. Định lƣợng (định hiệu giá bằng phản ứng ngƣng kết chậm trong ống nghiệm) .................................................................................................... 31 3.5. CHỈ TIÊU THEO DÕI ................................................................................... 32 3.6. XỬ LÍ KẾT QUẢ .......................................................................................... 32 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................. 33 4.1. KẾT QUẢ ....................................................................................................... 33 4.1.1. Định tính ................................................................................................ 33 4.1.1.1. Qui trình ngắn ngày ........................................................................ 33 4.1.1.2. Qui trình dài ngày ............................................................................ 34 4.1.2. Định lƣợng ............................................................................................. 34 4.1.2.1. Qui trình ngắn ngày ......................................................................... 35 4.1.2.2. Qui trình dài ngày ............................................................................ 36 4.1.2.3. Hiệu quả gây đáp ứng miễn dịch ở 2 qui trình ................................ 37 4.1.3. Xử lí tăng độ nhạy của kháng huyết thanh............................................. 38 4.1.3.1. Xác định nồng độ S. aureus thích hợp gắn với kháng huyết thanh . 38 4.1.3.2. Kiểm tra phản ứng ngƣng kết với kháng huyết thanh xử lí gắn S. aureus ........................................................................................................ 38 4.1.4. Xử lí tăng độ đặc hiệu của kháng huyết thanh ....................................... 40 4.2. THẢO LUẬN ................................................................................................. 42 4.2.1. Định tính ................................................................................................ 42 4.2.2. Định lƣợng ............................................................................................. 43 4.2.2.1. Qui trình ngắn ngày ......................................................................... 43 4.2.2.2. Qui trình dài ngày ........................................................................... 43 viii 4.2.3. Xử lí để tăng độ nhạy kháng huyết thanh .............................................. 44 4.2.4. Xử lí tăng độ đặc hiệu của kháng huyết thanh ....................................... 44 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................. 46 5.1. KẾT LUẬN .................................................................................................... 46 5.2. ĐỀ NGHỊ ........................................................................................................ 46 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................. 47 7. PHỤ LỤC ............................................................................................................. 49 ix DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT APC Antigen-presenting cell (Tế bào trình diện kháng nguyên) E. coli Escherichia coli Ig Immunoglobulin (Globulin miễn) IL Interleukine KHT Kháng huyết thanh KN Kháng nguyên KT Kháng thể KN-KT Kháng nguyên – Kháng thể MHC II Major histocompatibility complex class II antigens (các kháng nguyên phù hợp tổ chức chính lớp II) S. aureus Staphylococcus aureus. SIg Surface immunoglobulin (Globulin miễn màng tế bào) TCR T cell receptor (Thụ quan bề mặt tế bào T) TH lympho T helper cell (tế bào lympho T hỗ trợ) x DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1 Cấu trúc tổng quát phân tử kháng thể ...................................................... 4 Hình 2.2 KN đƣợc tế bào B tóm bắt, phân cắt, gắn với MHC lớp II và biểu lộ trên bề mặt tế bào ......................................................................................... 10 Hình 2.3 Phức hợp KN- MHC lớp II gắn với phức hợp thụ thể TCR/CD4+ trên tế bào TH ................................................................................................... 10 Hình 2.4 Cấu trúc đặc trƣng của tế bào tƣơng ...................................................... 11 Hình 2.5 Đáp ứng của tế bào B với kháng nguyên và mối liên hệ giữa sự đáp ứng này với hàm lƣợng kháng thể trong huyết thanh .................................. 12 Hình 2.6 Sự khác biệt giữa KN phụ thuộc tuyến ức và KN không phụ thuộc tuyến ức trong kích hoạt đáp ứng ở tế bào B .................................................. 13 Hình 2.7 Đáp ứng tạo kháng thể khác nhau tùy vào KN phụ thuộc tuyến ức hay không phụ thuộc tuyến ức. KN không phụ thuộc vào tuyến ức không gây ra sự thay đổi từ sản xuất IgM sang IgG ........................................ 13 Hình 2.8 Trên bao thẩm tích có các lỗ nhỏ cho phép các phân tử muối đi ra ngoài còn KT bị giữ lại .................................................................................. 17 H ình 2.9 Phản ứng ngƣng kết do kháng thể tạo nên ............................................. 19 Hình 2.10 Kháng thể IgG gắn với protein A của S. aureus .................................... 20 Hình 3.1 Tủa kháng huyết thanh ........................................................................... 26 Hình 3.2 Dịch kháng huyết thanh tủa trong amonium sulfate trƣớc và sau thẩm tích ........................................................................................................ 27 Hình 3.3 Phản ứng ngƣng kết trên phiến kính ...................................................... 30 Hình 3.4 Phản ứng ngƣng kết chậm trong ống nghiệm ........................................ 32 Hình 7.1 Thỏ nuôi thí nghiệm ............................................................................... 50 Hình 7.2 Lấy máu tĩnh mạch tai ........................................................................... 50 Hình 7.3 Tiêm dƣới da .......................................................................................... 50 xi DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 3.1 Gây miễn dịch thu kháng thể theo qui trình ngắn ngày ........................ 23 Bảng 3.2 Gây miễn dịch thu kháng thể theo qui trình dài ngày (qui trình viện Pasteur Tp. HCM) ................................................................................. 24 Bảng 4.1 Kết quả thử phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính với kháng huyết thanh của thỏ 1 và thỏ 2 ........................................................................ 33 Bảng 4.2 Kết quả thử phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính với kháng huyết thanh của thỏ 3, thỏ 4 và thỏ 5 ............................................................. 34 Bảng 4.3 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể ngƣng kết của kháng huyết thanh thỏ 1 và thỏ 2 ........................................................................................ 35 Bảng 4.4 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể của kháng huyết thanh thỏ 3 và thỏ 4 ...................................................................................................... 36 Bảng 4.5 Trung bình hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong kháng huyết thanh thỏ ở qui trình ngắn ngày và dài ngày ............................................................ 37 Bảng 4.6 Kết quả phản ứng ngƣng kết trên phiến kính với kháng huyết thanh gắn S. aureus ở các nồng độ khác nhau ....................................................... 38 Bảng 4.7 Kết quả thử phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính với kháng huyết thanh đƣợc xử lí và không đƣợc xử lí với S. aureus của thỏ 1 và thỏ 2 ............................................................................................................ 39 Bảng 4.8 Kết quả thử phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính với kháng huyết thanh đƣợc xử lí và không đƣợc xử lí với S. aureus của thỏ 3, thỏ 4 và thỏ 5 ...................................................................................................... 39 Bảng 4.9 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể của kháng huyết thanh sau khi hấp phụ của thỏ 1 và thỏ 2 (qui trình ngắn ngày) ........................................ 40 Bảng 4.10 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể của kháng huyết thanh sau khi hấp phụ của thỏ 3 và thỏ 4 (qui trình dài ngày) ........................................... 41 xii DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ BIỂU ĐỒ TRANG Biểu đồ 4.1 Biến đổi hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong kháng huyết thanh của thỏ 1 và thỏ 2 theo thời điểm lấy mẫu ............................................. 35 Biểu đồ 4.2 Hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong huyết thanh lúc đầu và KHT đã thẩm tích của thỏ 2 ........................................................................... 36 Biểu đồ 4.3 Hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong kháng huyết thanh của thỏ 3 và thỏ 4 ở các thời điểm khác nhau ...................................................... 36 Biểu đồ 4.4 Hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong huyết thanh lúc đầu và KHT đã thẩm tích của thỏ 4 .......................