Khóa luận ứng dụng phương pháp mô học truyền thống khảo sát sự biến đổi cấu trúc tế bào tôm càng xanh (macrobrachium rosenbegii de man 1879) bị bệnh đục thân

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP MÔ HỌC TRUYỀN THỐNG KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỔI CẤU TRÚC TẾ BÀO TÔM CÀNG XANH (Macrobrachium rosenbegii De Man 1879) BỊ BỆNH ĐỤC THÂN Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN MINH VÀNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP MÔ HỌC TRUYỀN THỐNG KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỔI CẤU TRÚC TẾ BÀO TÔM CÀNG XANH (Macrobrachium rosenbegii De Man 1879) BỊ BỆNH ĐỤC THÂN Giáo viên hƣớng dẫn: TS. LÝ THỊ THANH LOAN CN. ĐOÀN VĂN CƢỜNG Sinh viên thực hiện: NGUYỄN MINH VÀNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 iii LỜI CẢM TẠ Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh đã tận tình chỉ dạy, truyền đạt kiến thức cho em trong suốt thời gian em học tập tại trƣờng. Em xin chân thành cảm ơn cô - TS. Lý Thị Thanh Loan đã hƣớng dẫn em giải quyết các vấn đề em thắc mắc trong suốt quá trình làm đề tài cũng nhƣ tạo điều kiện cho em hoành thành khoá luận tốt nghiệp này. Em xin chân thành cảm ơn toàn thể các anh chị làm việc tại Trung Tâm quốc gia Quan Trắc, thuộc Viện nghiên cứu và nuôi trồng thuỷ sản II, nhất là các anh chị tại phòng Mô học: anh Đoàn Văn Cƣờng, anh Phạm Văn Điền, chị Tuyết Anh, chị Lan đã tận tình chỉ bảo cho em các phƣơng pháp thao tác và thực hành đề tài trong suốt thời gian em làm đề tài này. Sau cùng, xin cảm ơn toàn thể gia đình mến yêu cùng toàn thể các bạn học chung khoá 29, ngành Công Nghệ Sinh Học, Đại Học Nông Lâm thân thƣơng vì đã luôn động viên, chỉ bảo, giúp đỡ, thƣơng yêu nhau. Vì là bƣớc đầu làm quen với việc nghiên cứu khoa học, cho nên không trách khỏi khiếm khuyết và sai lầm, mong đƣợc sự góp ý chỉ bảo của các thầy cô cùng các bạn sinh viên. TP. HCM, tháng 9 năm 2007 Sinh viên thực hiện, NGUYỄN MINH VÀNG iv TÓM TẮT NGUYỄN MINH VÀNG, lớp Công nghệ sinh học, khóa 29, niên khóa 2003 – 2007, trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Việt Nam. “ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP MÔ HỌC TRUYỀN THỐNG KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỔI CẤU TRÚC TẾ BÀO TÔM CÀNG XANH (Macrobrachium rosenbergii De Man 1879) BỊ BỆNH ĐỤC THÂN”. Giáo viên hƣớng dẫn: TS. LÝ THỊ THANH LOAN CN. ĐOÀN VĂN CƢỜNG Thời gian thực hiện đề tài: 3/2007  9/2007. Bệnh đục thân trên Macrobrachium rosenbergii De Man, 1879 là một bệnh nguy hiểm gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng có thể gây chết 100% ấu trùng và hậu ấu trùng tôm càng xanh. Bằng phƣơng pháp mô học truyền thống, chúng tôi đã khảo sát những biến đổi cấu trúc tế bào của các tổ chức mô trên tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii) bị đục thân. Để khảo sát những biến đổi cấu trúc mô học, chúng tôi tiến hành thu mẫu tôm càng xanh tại hai địa điểm: An Giang (thu mẫu bệnh không có dấu hiệu đục thân) và Bến Tre (thu mẫu bệnh có dấu hiệu đục thân). Kết quả phân tích mô học cho thấy có những bất thƣờng trong cấu trúc tế bào của các tổ chức mô trên cơ quan mang, gan tụy, cơ ở tôm càng xanh bị bệnh đục thân. Sự xuất hiện các thể ẩn bên trong nhân của các tế bào cơ quan gan tụy, các thể vùi bên trong nhân của các tế bào của cơ quan mang và sự hoại tử cơ là những đặc điểm chung quan sát đƣợc trên các mẫu tôm ấu trùng bị bệnh đục thân. v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT B (B-cells): Blasenzellen cells (Tế bào B) DNA: Deoxyribonucleic Acid ELISA: Enzyme linked immunosorbent assay F (F-cells): Fibrillenzellen cells (Tế bào F) FAO: Food and Agriculture Organization of the United Nations (Tổ chức lƣơng nông thế giới) HP: Hepatopancreas (Cơ quan gan tụy) HPV: Hepatopancreatic parvovirus IHHNV: Infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus ILS: Interlamellar space INIs: Các thể vùi trong nhân tế bào INOs: Các thể ẩn trong nhân tế bào L: Lamellae (Phiến mang) LU: Lumen M: Muscle (Cơ) MBV: Monodon baculovirus MrNV: Macrobrachium rosenbergii nodavirus PCR: Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuổi Polymerase) R (R-cells): Restzellen cells (Tế bào R) RNA: Ribonucleic Acid RT-PCR: Reverse – transcription polymerase chain reaction (Phản ứng chuổi Polymerase phiên mã ngƣợc) TCX: Tôm càng xanh UNDP: United Nations Development Programe XSV: Extral small virus WSSV: White Spot Syndrome Virus (Virus gây hội chứng đốm trắng) vi DANH SÁCH CÁC HÌNH TRANG Hình 2.1: Hình dạng bên ngoài của loài Macrobrachium rosenbergii De Man 1879 4 Hình 2.2: Cấu tạo bên ngoài của Macrobrachium rosenbergii De Man 1879. ........... 4 Hình 2.3: Bản đồ vùng phân bố tự nhiên của Macrobrachium rosenbergii trên thế giới. ............................................................................................................................... 7 Hình 2.4: Các khu vực sản xuất TCX chính trên thế giới. .......................................... 8 Hình 2.5: Biểu đồ phân bố sản lƣợng TCX trên thế giới qua các năm. ....................... 8 Hình 2.6: Dấu hiệu lâm sàng bệnh đục thân trên TCX. ............................................... 14 Hình 2.7: Hình dạng tế bào của Enterococus KM002 dƣới kính hiển vi điện tử. ....... 15 Hình 2.8: Hình dạng XSV và MrNV dƣới kính hiển vi điện tử. ................................. 16 Hình 2.9: Vị trí của Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) trong họ nodavirus. ..................................................................................................................... 16 Hình 2.10: Cấu trúc tế bào cơ quan gan tụy TCX. ...................................................... 18 Hình 2.11: Cấu trúc tế bào cơ quan mang TCX. ......................................................... 19 Hình 4.1: Cấu trúc tế bào tổ chức mô cơ TCX. ........................................................... 27 Hình 4.2: Các tổ chức tế bào bình thƣờng của cơ quan gan tụy. ................................. 28 Hình 4.3a: Thể ẩn bên trong nhân của các tế bào trên gan tụy TCX. ......................... 29 Hình 4.3b: Thể ẩn bên trong nhân của các tế bào trên gan tụy TCX .......................... 30 Hình 4.4: Cấu trúc tế bào cơ quan mang TCX. ........................................................... 31 Hình 4.5: Thể vùi bên trong nhân của các tế bào trrên cơ quan mang TCX ............... 33 Hình 4.6: Sự hoại tử cơ trên TCX bị đục thân. ............................................................ 34 vii DANH SÁCH CÁC BẢNG TRANG Bảng 4.1: Dấu hiệu lâm sàng mẫu tôm thu ngẫu nhiên tại An Giang ......................... 25 Bảng 4.2: Kết quả phân tích mô học mẫu TCX thu định kỳ tại An Giang .................. 26 Bảng 4.3: Kết quả phân tích mô học các mẫu TCX bệnh đục thân ............................. 32 Bảng 4.4: So sánh các mẫu TCX bị đục thân và không bị đục thân ............................ 35 viii MỤC LỤC TRANG LỜI CẢM TẠ ................................................................................................................ iii TÓM TẮT .......................................................................................................................iv DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................ v DANH SÁCH CÁC HÌNH .............................................................................................vi DANH SÁCH CÁC BẢNG ......................................................................................... vii MỤC LỤC ................................................................................................................... viii Phần I ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1 Phần II TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................. 3 2. 1 Hình thái tôm càng xanh ......................................................................................... 3 2. 2 Đặc điểm sinh học tôm càng xanh .......................................................................... 4 2.2.1 Sinh sản tôm càng xanh ..................................................................................... 4 2.2.2 Môi trƣờng và chu kỳ sống ................................................................................ 6 2.2.3 Phân bố .............................................................................................................. 7 2. 3 Tình hình nuôi tôm càng xanh tại Việt Nam và trên thế giới ................................. 7 2. 4 Các bệnh thƣờng gặp trên tôm càng xanh ............................................................... 9 2.7.1 Bệnh trên ấu trùng tôm càng xanh ..................................................................... 9 2.7.2 Những bệnh thƣờng gặp trên tôm trƣởng thành .............................................. 12 2. 5 Bệnh đục thân ........................................................................................................ 13 2. 6 Các phƣơng pháp nghiên cứu mô học ................................................................... 17 2.6.1 Phƣơng pháp mô học truyền thống .................................................................. 17 2.6.2 Phƣơng pháp phóng xạ tự chụp ....................................................................... 17 2.6.3 Phƣơng pháp hóa mô miễn dịch ...................................................................... 17 2.6.4 Phƣơng pháp lai tại chổ ................................................................................... 17 2. 7 Cấu trúc tế bào chơ quan gan tụy và mang tôm càng xanh................................... 18 2.7.1 Cấu trúc tế bào cơ quan gan tụy ...................................................................... 18 2.7.2 Cấu trúc tế bào cơ quan mang ......................................................................... 19 Phần III BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM VÀ PHƢƠNG PHÁP THỰC HIỆN .................... 20 3.1 Bố trí thí nghiệm ................................................................................................... 20 3.1.1 Thời gian và địa điểm thực hiện ...................................................................... 20 ix 3.1.2 Bố trí thí nghiệm .............................................................................................. 20 3.2 Vật liệu, trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất ............................................................. 20 3.2.1 Trang thiết bị, dụng cụ, hoá chất cần chuẩn bị ................................................ 20 3.2.2 Phƣơng pháp tiến hành .................................................................................... 21 Phần IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................... 24 4.1 Kết quả .................................................................................................................. 24 4.1.1 Kết quả khảo sát mô học mẫu tôm càng xanh thu định kỳ không có dấu hiệu đục thân ....................................................................................................................... 24 4.1.2. Kết quả khảo sát mô học tôm càng xanh có dấu hiệu đục thân .................. 32 4.2 Thảo luận ............................................................................................................... 34 Phần V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................ 37 Kết luận .......................................................................................................................... 37 Đề xuất ........................................................................................................................... 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 38 Tiếng Việt ...................................................................................................................... 38 Tiếng Anh ...................................................................................................................... 38 Danh sách các trang website .......................................................................................... 42 1 Phần I ĐẶT VẤN ĐỀ Tôm càng xanh (TCX) (Macrobrachium rosenbergii De Man, 1879) là loài tôm nƣớc ngọt có kích thƣớc lớn nhất trong họ Palaemonidae, chỉ phân bố ở vùng Tây Nam châu Á Thái Bình Dƣơng (Nguyễn Việt Thắng, 1993). Là một đối tƣợng thủy sản quan trọng trong sản xuất và khai thác, TCX đƣợc thuần dƣỡng để sản xuất tại nhiều khu vực trên thế giới. Việt Nam, đồng bằng sông Cửu Long có sản lƣợng tôm lớn nhất nƣớc. Trong chu kỳ phát triển của ấu trùng tôm càng xanh, bệnh đục thân trên ấu trùng TCX là một trong những bệnh nguy hiểm nhất đối với ngƣời sản xuất giống bởi khả năng gây chết rất cao, có thể lên đến 100% trong vòng 5 ngày. Trƣờng hợp đầu tiên đƣợc ghi nhận là vào năm 1995 ở Martinique, Pháp (Arcier và c.t.v., 1999), sau đó ở Hàn Quốc (Tung và c.t.v., 1999), Trung Quốc (Qian và c.t.v., 2003), gần đây nhất ở Ấn Độ (Hameed, 2003). Bệnh tác động chủ yếu vào giai đoạn TCX giống, tác nhân gây bệnh này hiện vẫn chƣa rõ. Hiện có nhiều phƣơng pháp hiện đại đƣợc ứng dụng vào chẩn đoán bệnh thủy sản nhƣ là PCR (Polymerase Chain Reaction), RT-PCR (Reverse – transcription polymerase chain reaction), ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), hóa mô miễn dịch, lai tại chổ (in situ hybridization), miễn dịch huỳnh quang, ... cho kết quả chính xác. Nhƣng đối với những bệnh mới có tác nhân gây bệnh mới chƣa biết đƣợc về cấu trúc di truyền, không thể tạo đƣợc mẫu dò (probe), đoạn mồi (primer), kháng thể, ....vì thế, không thể chẩn đoán đƣợc tác nhân gây bệnh. Phƣơng pháp mô học (histopathology) truyền thống đƣợc phát triển từ những năm đầu có kính hiển vi đã đƣợc ứng dụng một cách rộng rãi trên thế giới, từ các bệnh viện, các phòng nghiên cứu, các trung tâm xét nghiệm, các viện nghiên cứu, .... Đây là phƣơng pháp nghiên cứu căn bản, chủ yếu quan sát về cấu trúc mô, cấu trúc tế bào, xác định đƣợc chức năng cũng nhƣ các trạng thái bệnh lý của tế bào, đặc biệt là đối với một số bệnh mới ta chƣa có primer, probe, ... thì phƣơng pháp mô học truyền thống rất hiệu quả trong chẩn đoán mầm bệnh. 2 Hiện nay tại Việt Nam, tỉ lệ ấu trùng TCX bệnh đục thân khá cao, vẫn chƣa xác định chính xác tác nhân gây bệnh. Đáp ứng nhu cầu bức thiết của thực tế sản xuất và tình hình dịch bệnh, dƣới sự hƣớng dẫn và giúp đỡ của TS. Lý Thị Thanh Loan cùng các anh chị tại phòng thí nghiệm Mô học, Trung tâm Quốc gia Quan Trắc Cảnh báo môi trƣờng và Phòng ngừa dịch bệnh thuỷ sản (thuộc Viện nghiên cứu và nuôi trồng thuỷ sản II), chúng tôi xin đƣợc thực hiện đề tài: “Ứng dụng phƣơng pháp mô học truyền thống khảo sát sự biến đổi cấu trúc tế bào tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii De Man, 1879) bị bệnh đục thân”. Mục đích của đề tài: Khảo sát sự biến đổi cấu trúc tế bào của ấu trùng TCX bị bệnh đục thân để tìm ra tác nhân gây bệnh. Nội dung thực hiện:  Khảo sát cấu trúc tế bào (cơ quan mang, gan tụy, cơ) của ấu trùng TCX không bị bệnh đục thân.  Khảo sát cấu trúc tế bào (cơ quan mang, gan tụy, cơ) của ấu trùng TCX bị bệnh đục thân.  So sánh những biến đổi cấu trúc tế bào của các cơ quan, từ đó xác định nguyên nhân gây bệnh. 3 Phần II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. 1 Hình thái tôm càng xanh Macrobrachium rosenbergii De Man, 1879 đƣợc Holthius (1950) phân loại nhƣ sau: Ngành chân khớp : Arthropoda Ngành phụ : Anterata Lớp giáp xác : Crustacea Lớp phụ giáp xác bậc cao : Malacostraca Bộ mƣời chân : Decapoda Bộ phụ chân bơi : Natantia Phân bộ : Caridea Họ : Palaemonidae Họ phụ : Palaemoninae Giống : Macrobrachium Loài : M. rosenbergii DE MAN 1879 Macrobrachium rosenbergii De Man, 1879 là loài TCX lớn nhất trong giống Macrobrachium: con đực có thể dài tới 320 mm, con cái 250 mm (đo từ mút chủy (rostrum) đến mút đuôi (telson)). Toàn thân thƣờng có màu xám hơi lục hoặc hơi nâu, đôi khi có màu hơi xanh, màu sắc đậm dần lên ở những con lớn hơn. Có những sọc nâu, xám, trắng đục dọc theo chiều dài thân. Tác giả Forster và Wickins (1972) mô tả đặc điểm cấu tạo ngoài TCX (Hình 2.2), toàn thân đƣợc phân thành 20 phần phụ (segment) (somite) và đƣợc chia thành hai phần riêng biệt: phần đầu (cephalothorax) có 14 phần phụ và phần đuôi (abdomen) có 6 phần phụ. Phần đầu lại đƣợc chia thành 2 phần riêng biệt nhau là cephalon và thorax. Tên gọi và chức năng của 20 phần phụ của Macrobrachium rosenbergii đƣợc liệt kê trong phần Phụ lục A. 4 Hình 2.1: Hình dạng bên ngoài của loài Macrobrachium rosenbergii De Man, 1879 Hình 2.2: Cấu tạo bên ngoài của Macrobrachium rosenbergii De Man, 1879 (Forster và Wickins, 1972) 2. 2 Đặc điểm sinh học tôm càng xanh 2.2.1 Sinh sản tôm càng xanh Phần lớn tôm đực trƣởng thành lớn hơn tôm cái cùng tuổi, có đôi chân ngực (chân bò) thứ hai lớn và dài, đầu lớn, bụng nhỏ, thuôn, lỗ sinh dục đực nằm ở gốc của đôi chân ngực thứ 5. Giải phẩu cơ quan sinh dục đực gồm có các phần: màng treo, dịch thể, ống xoắn dẫn tinh (gồm có ống dẫn tinh giữa, ống phóng tinh ra ngoài, đƣờng ống dẫn tinh trong suốt) (Nguyễn Việt Thắng, 1993). Con cái có đầu và đôi chân ngực thứ 2 nhỏ hơn ở con đực cùng tuổi nhiều lần, vị trí của lổ sinh dục cái ở giữa hai gốc của đôi chân bò thứ 3. Ở con cái thành thục, có 5 thể nhìn thấy trứng màu đỏ da cam qua lớp vỏ giáp đầu ngực. Màng bụng uốn vào phía trong tạo thành một buồng chứa trứng. Phần gốc của những chân bụng, đặc biệt là ba đôi chân bụng đầu tiên phát triển dài ra và có những tấm lông cứng, dài để mang trứng khi sinh sản. Tôm đực trƣởng thành, thành thục có thể trạng khoẻ mạnh (vỏ cứng) có thể tiến hành giao vĩ trong khi con cái chỉ có thể tiến hành giao vĩ khi đã hoàn tất lột vỏ tiền giao vĩ (Nguyễn Việt Thắng, 1993), quá trình giao vĩ có thể chia thành 4 giai đoạn: Tiếp xúc, Ôm giữ tôm cái, Trèo lên lƣng, Lật ngửa và gắn túi tinh. Sau khi giao vĩ từ 6 – 20 giờ, tôm cái bắt đầu đẻ trứng. Những con cái chƣa giao vĩ nhƣng đã thành thục, chín mùi sinh dục cũng có thể đẻ trong vòng 24 giờ sau khi lột vỏ tiền giao vĩ, nhƣng không đƣợc thụ tinh và trứng chỉ lƣu lại trong buồng ấp trứng của con cái vài giờ mà thôi. Khi đẻ trứng con cái cong mình về phía trƣớc đến khi ngực bụng tiếp xúc nhau, đẩy trứng từ buồng trứng ra ngoài qua lổ sinh dục, trứng sẽ đi qua túi tinh (khi con cái đã đƣợc giao vĩ) và đƣợc thụ tinh,. sau đó trứng rơi vào buồng ấp. Vị trí của buồng ấp trứng ở chân bụng thứ tƣ nhận đƣợc trứng đầu tiên, sau đó lần lƣợt tới chân bụng thứ ba, thứ hai và cuối cùng là chân bụng thứ nhất, trong đó, trứng đƣợc bao bọc bởi một màng nhày trong suốt, và đƣợc sắp rất đều và ngăn nắp vào các sợi lông ở 4 cặp chân ngực này. Theo Nguyễn Việt Thắng (1993), thời gian ấp trứng từ 19 – 23 ngày nếu nhiệt độ từ 25 – 31oC, thời gian này dao động từ 17 – 23 ngày với nhiệt độ từ 26 – 30oC. Suốt thời gian ấp trứng, tôm cái dùng chân bụng quạt nƣớc, tạo dòng nƣớc luôn chuyển động qua vùng bụng làm thoáng khí cho trứng. Tôm cái khéo léo dùng chân ngực thứ nhất loại bỏ những trứng hƣ và những vật lạ bám vào buồng trứng. Trứng của loài tôm nƣớc ngọt này có dạng hình bầu dục rất nhỏ, chiều dài trục lớn của trứng chỉ khoảng 0,6 – 0,7 mm, có màu sáng da cam trong suốt 2 – 3 ngày sau nở, sau đó chuyển dần sang màu da cam, đến ngày thứ 12 có màu xám xanh nhạt, sau đó màu đậm dần đến khi nở. 6 2.2.2 Môi trƣờng và chu kỳ sống Ấu trùng TCX sau khi nở ra cần có môi trƣờng nƣớc lợ (6 – 18 o/oo) để sống và phát triển, chính vì vậy cho nên dù là loài tôm nƣớc ngọt, khu vực sống tự nhiên của chúng phải tiếp giáp với vùng nƣớc lợ. Những con tôm