Luận án Nghiên cứu thiết lập một số chất chuẩn được chiết xuất từ dược liệu để góp phần hoàn thiện tiêu chuẩn chất lượng Hy thiêm và Vối Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN KIỂM NGHIỆM THUỐC TRUNG ƯƠNG NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THẢO NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP MỘT SỐ CHẤT CHUẨN ĐƯỢC CHIẾT XUẤT TỪ DƯỢC LIỆU ĐỂ GÓP PHẦN HOÀN THIỆN TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG HY THIÊM VÀ VỐI VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI, NĂM 2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN KIỂM NGHIỆM THUỐC TRUNG ƯƠNG NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THẢO NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP MỘT SỐ CHẤT CHUẨN ĐƯỢC CHIẾT XUẤT TỪ DƯỢC LIỆU ĐỂ GÓP PHẦN HOÀN THIỆN TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG HY THIÊM VÀ VỐI VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGHÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 9720210 Người hướng dẫn khoa học : PGS.TS. Phương Thiện Thương TS. Nguyễn Thị Liên HÀ NỘI, NĂM 2023 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan Luận án “Nghiên cứu thiết lập một số chất chuẩn được chiết xuất từ dược liệu để góp phần hoàn thiện tiêu chuẩn chất lượng Hy thiêm và Vối Việt Nam” là công trình nghiên cứu của tôi với sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS. Phương Thiện Thương và TS. Nguyễn Thị Liên. Các kết quả được trình bày trong luận án là trung thực và được công bố một phần trong các bài báo khoa học của nhóm nghiên cứu. Luận án chưa từng được công bố, không trùng lặp với luận văn, luận án hoặc các công trình nghiên cứu khoa học của các tác giả khác. Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Phương Thảo LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án, tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình và có hiệu quả của nhiều tập thể và cá nhân, của các thầy, cô giáo, đồng nghiệp, bạn bè và gia đình. Cho phép tôi bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới: PGS.TS. Phương Thiện Thương – Phó Viện trưởng Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam – Hàn Quốc, TS. Nguyễn Thị Liên – Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, những người thầy đã định hướng, hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện luận án. Ban Lãnh đạo Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, các Khoa/Phòng trong Viện đã tạo điều kiện về môi trường nghiên cứu, cơ sở vật chất, trang thiết bị, chia sẻ những kinh nghiệm quý báu để tôi hoàn thành luận án. Bộ Khoa học và Công nghệ đã cấp kinh phí cho Nhiệm vụ Khoa học và Công nghệ cấp Bộ, mã số 01.2020M001, đồng nghiệp tại Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam – Hàn Quốc đã phối hợp và hỗ trợ tôi trong quá trình thực hiện nghiên cứu. Công trình nghiên cứu này được hoàn thành với sự nỗ lực của bản thân và sự ủng hộ của gia đình, bạn bè, xin cảm ơn mọi người đã luôn sát cánh bên tôi, động viên khích lệ tôi hoàn thành nghiên cứu này. Hà Nội, ngày 01 tháng 12 năm 2022 NCS. Nguyễn Thị Phương Thảo MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ ..................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................... 3 1.1. VAI TRÒ CỦA CHẤT ĐỐI CHIẾU TRONG KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU .................................................................................................................... 3 1.1.1. Sự cần thiết phải có chất đối chiếu trong kiểm nghiệm dược liệu ............ 3 1.1.2. Hướng dẫn của Tổ chức Y tế thế giới về lựa chọn chất đánh dấu trong dược liệu ....................................................................................................................... 4 1.2. TỔNG QUAN VỀ CÁC ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ............................. 5 1.2.1. Hy thiêm .................................................................................................... 5 1.2.1.1. Vị trí phân loại ........................................................................................ 5 1.2.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố ................................................................ 6 1.2.1.3. Thành phần hóa học ................................................................................ 6 1.2.1.4. Tác dụng sinh học ................................................................................. 10 1.2.1.5. Tiêu chuẩn hóa dược liệu Hy thiêm ..................................................... 11 1.2.1.6. Hợp chất darutosid ................................................................................ 12 1.2.2. Vối ........................................................................................................... 13 1.2.2.1. Vị trí phân loại ...................................................................................... 13 1.2.2.2. Đặc điểm thực vật và phân bố .............................................................. 13 1.2.2.3. Thành phần hóa học .............................................................................. 14 1.2.2.4. Tác dụng sinh học ................................................................................. 18 1.2.2.5. Tiêu chuẩn hóa dược liệu Vối .............................................................. 19 1.2.2.6. Hợp chất 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5' –dimethylchalcon (CO1) .. 20 1.3. TỔNG QUAN VỀ THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN HÓA HỌC................... 22 1.3.1. Định nghĩa, phân loại chất chuẩn hóa học ............................................... 22 1.3.2. Thiết lập chất chuẩn hóa học ................................................................... 23 1.3.2.1. Yêu cầu về hàm lượng với chất đánh dấu trong dược liệu ................... 23 1.3.2.2. Thiết lập chất chuẩn hóa học gốc ......................................................... 24 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1. ĐỐI TƯỢNG VÀ NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU ................................. 32 2.1.1. Dược liệu Hy thiêm ................................................................................. 32 2.1.2. Dược liệu nụ Vối và lá Vối...................................................................... 32 2.2. HÓA CHẤT VÀ TRANG THIẾT BỊ ........................................................ 33 2.2.1. Vật tư, hóa chất ........................................................................................ 33 2.2.2. Thiết bị ..................................................................................................... 34 2.3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................. 34 2.3.1. Chiết xuất, phân lập, tinh chế và xác định cấu trúc các hợp chất............ 36 2.3.2. Tiêu chuẩn chất lượng và phương pháp kiểm nghiệm nguyên liệu để thiết lập chuẩn ............................................................................................................ 36 2.3.2.1. Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng............................................................ 37 2.3.2.2. Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định tạp chất liên quan bằng HPLC/DAD ....................................................................................................... 37 2.3.2.3. Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng nguyên liệu thiết lập chuẩn gốc ....... 38 2.3.3. Thiết lập chất chuẩn gốc .......................................................................... 39 2.3.3.1. Đóng lọ ................................................................................................. 39 2.3.3.2. Kiểm tra độ đồng nhất của quá trình đóng gói ..................................... 40 2.3.3.3.Xác định giá trị ấn định công bố trên chứng chỉ với chuẩn gốc định lượng .................................................................................................................. 40 2.3.3.4. Xác định độ không đảm bảo đo ............................................................ 43 2.3.3.5. Dán nhãn và bảo quản ống chuẩn ......................................................... 44 2.3.3.6. Theo dõi độ ổn định của chất chuẩn đã thiết lập .................................. 44 2.3.4. Xây dựng quy trình định tính, định lượng đồng thời kirenol, darutosid bằng HPLC ................................................................................................................. 45 2.3.4.1. Khảo sát phương pháp chuẩn bị mẫu ................................................... 45 2.3.4.2. Xây dựng và thẩm định quy trình định tính, định lượng bằng HPLC .. 45 2.3.5. Xây dựng quy trình định tính, định lượng CO1 trong lá Vối và nụ Vối bằng HPLC ................................................................................................................. 46 2.3.5.1. Khảo sát phương pháp chuẩn bị mẫu ................................................... 46 2.3.5.2. Xây dựng và thẩm định quy trình định tính, định lượng bằng HPLC .. 46 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ......................................................... 47 3.1. CHIẾT XUẤT, TINH CHẾ VÀ KHẲNG ĐỊNH CẤU TRÚC ................. 47 3.1.1. Chiết xuất, tinh chế và xác định cấu trúc darutosid................................. 47 3.1.1.1. Chiết xuất, tinh chế ............................................................................... 47 3.1.1.2. Xác định cấu trúc, nhận dạng chất đã tinh chế ..................................... 49 3.1.2. Chiết xuất, tinh chế và xác định cấu trúc CO1 ........................................ 52 3.1.2.1. Chiết xuất, tinh chế ............................................................................... 52 3.1.2.2. Xác định cấu trúc, nhận dạng chất CO1 đã tinh chế ............................ 56 3.2. XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP CHUẨN ............................................................................................................. 59 3.2.1. Nguyên liệu darutosid để thiết lập chuẩn gốc định lượng ....................... 59 3.2.1.1. Xây dựng phương pháp xác định độ tinh khiết của nguyên liệu thiết lập chuẩn darutosid .................................................................................................. 59 3.2.1.2. Tiêu chuẩn chất lượng nguyên liệu darutosid để thiết lập chuẩn định lượng .................................................................................................................. 68 3.2.2. Nguyên liệu CO1 để thiết lập chuẩn gốc định lượng .............................. 70 3.2.2.1. Xây dựng phương pháp xác định độ tinh khiết của nguyên liệu CO1 . 70 3.2.2.2. Tiêu chuẩn chất lượng nguyên liệu CO1 để thiết lập chuẩn định lượng .................................................................................................................. 78 3.3. THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN ..................................................................... 80 3.3.1. Kiểm tra chất lượng, đóng lọ và đánh giá đồng nhất quá trình đóng gói 80 3.3.2. Xác định giá trị ấn định với chất chuẩn gốc định lượng ......................... 81 3.2.2.1 Xác định độ tinh khiết sắc ký ................................................................ 81 3.2.2.2. Xác định tạp chất bay hơi ..................................................................... 84 3.2.2.3. Xác định tạp chất vô cơ ........................................................................ 85 3.2.2.4. Giá trị ấn định và độ không đảm bảo đo .............................................. 85 3.3.3. Theo dõi độ ổn định của các chất chuẩn thiết lập được .......................... 86 3.3.3.1. Chất chuẩn darutosid ............................................................................ 87 3.3.3.2. Chất chuẩn CO1 .................................................................................... 88 3.4. XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG CHẤT ĐÁNH DẤU TRONG DƯỢC LIỆU HY THIÊM, NỤ VỐI VÀ LÁ VỐI ................... 89 3.4.1. Xây dựng và thẩm định quy trình định tính định lượng đồng thời kirenol và darutosid trong Hy thiêm bằng HPLC .......................................................... 89 3.4.1.1. Xây dựng quy trình chuẩn bị mẫu ........................................................ 89 3.4.1.2. Thẩm định quy trình định tính, định lượng đồng thời kirenol và darutosid bằng HPLC ........................................................................................................ 90 3.4.1.3. Khảo sát hàm lượng kirenol và darutosid trong Hy thiêm ................. 100 3.4.2. Xây dựng và thẩm định quy trình định tính định lượng CO1 trong nụ Vối và lá Vối bằng HPLC ....................................................................................... 100 3.4.2.1. Xây dựng quy trình chuẩn bị mẫu ...................................................... 100 3.4.2.2. Thẩm định quy trình định tính, định lượng CO1 bằng HPLC ........... 102 3.4.2.3. Khảo sát hàm lượng CO1 trong nụ Vối và lá Vối .............................. 109 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN .............................................................................. 111 4.1. VỀ CHIẾT XUẤT, TINH CHẾ CÁC CHẤT ĐỂ LÀM NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP CHUẨN ...................................................................................... 111 4.1.1. Lựa chọn hợp chất trong cây Vối và cây Hy thiêm cần phân lập ......... 111 4.1.1.1. Lựa chọn hợp chất trong cây Hy thiêm .............................................. 111 4.1.1.2. Lựa chọn hợp chất trong cây Vối ....................................................... 112 4.1.2. Về chiết xuất và tinh chế các chất ......................................................... 113 4.1.3. Về xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng ........................................................ 115 4.2. VỀ XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP CHUẨN . 116 4.2.1. Định tính, xác định cấu trúc chất chuẩn gốc ......................................... 116 4.2.2. Xác định độ tinh khiết của chất chuẩn gốc định lượng ......................... 116 4.2.2.1. Xác định tạp chất bay hơi ................................................................... 117 4.2.2.2. Xác định tạp chất vô cơ ...................................................................... 117 4.2.2.3. Xác định tạp chất hữu cơ .................................................................... 118 4.3. VỀ THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN............................................................. 121 4.3.1. Đóng lọ và đánh giá đồng nhất .............................................................. 121 4.3.1.1. Đóng lọ ............................................................................................... 121 4.3.1.2. Đánh giá đồng nhất ............................................................................. 122 4.3.2. Xác định giá trị ấn định ......................................................................... 123 4.3.3. Theo dõi độ ổn định ............................................................................... 125 4.4. VỀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG CHẤT ĐÁNH DẤU TRONG DƯỢC LIỆU NỤ VỐI, LÁ VỐI VÀ HY THIÊM ..... 126 4.4.1. Định tính, định lượng đồng thời kirenol, darutosid trong Hy thiêm bằng HPLC ............................................................................................................... 126 4.4.2. Định tính, định lượng CO1 trong nụ Vối và lá Vối bằng HPLC .......... 128 4.5. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN ......................................... 129 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................................... 131 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt AOAC Association of Official Analytical Chemists Hiệp hội các nhà phân tích hóa học ASEAN Association of South East Asian Nations Hiệp hội các quốc gia Đông Nam Á CO1 2′,4′-dihydroxy-6′-methoxy- 3′,5′-dimethylchalcone 2′,4′-dihydroxy-6′-methoxy-3′,5′- dimethylchalcon CRS Chemical Reference Standard Chất chuẩn hóa học DAD Diode Array Detector Đầu dò dãy diod quang DĐVN Dược điển Việt Nam DMSO Dimethyl sulfoxide Dimethyl sulfoxid DSC Differential Scanning Calorimetry Phương pháp quét nhiệt vi sai EP European Pharmacopoeia Dược điển Châu Âu ESI-MS Electrospray Ionisation Mass Spectrum Khối phổ ion hóa tia điện GACP Good Agricultural and Collection Practices Thực hành tốt trồng trọt và thu hái GC Gas Chromatography Sắc ký khí GMP Good manufacturing practice Thực hành sản xuất tốt GTAĐ Giá trị ấn định HL Hàm lượng HPLC High-Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao HR-LC- ESI-MS High Resolution Liquid Chromatography Electrospray Ionisation Mass Spectrum Sắc ký lỏng khối phổ ion hóa tia điện phân giải cao ICH International Conference on Harmonisation Hội nghị quốc tế về hòa hợp Int’P International Pharmacopeia Dược điển Quốc tế IR Infrared spectroscopy Quang phổ hồng ngoại ISO International Standard Organization Tổ chức tiêu chuẩn quốc tế KL Khối lượng KHCN Khoa học và Công nghệ KNV Kiểm nghiệm viên KTCL Kiểm tra chất lượng LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiện LOQ Limit of Quantitation Giới hạn định lượng NIST National Institute of Standard and Technology Viện Quốc gia về Tiêu chuẩn và Công nghệ Hoa Kỳ NSX Nhà sản xuất PCRS Primary Chemical Reference Standard Chất chuẩn hóa học gốc PHPLC Preparative High-Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng điều chế PTN Phòng thí nghiệm RS Reference Substance Chất chuẩn đối chiếu RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối SCRS Secondary Chemical Reference Standard Chất chuẩn hóa học thứ cấp S/N Signal/Noise Tín hiệu/Nhiễu đường nền Spic Diện tích pic TCCL Tiêu chuẩn chất lượng TCLQ Tạp chất liên quan TGA Thermogravimetric Analysis Phân tích nhiệt trọng lượng TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký lớp mỏng TKSK Tinh khiết sắc ký USP United State Pharmacopeia Dược điển Mỹ UV-VIS Ultravioliet – Visible Spectrophotometer Quang phổ tử ngoại – khả kiến WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1 Vị trí phân loại của chi Sigesbeckia 5 Bảng 1.2 Một số hợp chất phân lập từ Hy thiêm 9 Bảng 1.3 Vị trí phân loại của chi Cleistocalyx 13 Bảng 1.4 Một số hợp chất phân lập từ Vối 17 Bảng 2.1 Mẫu Dược liệu Hy thiêm dùng trong nghiên cứu 32 Bảng 2.2 Mẫu Dược liệu nụ Vối và lá Vối dùng trong nghiên cứu 33 Bảng 3.1 Dữ liệu phổ 1H-NMR (600 MHz) và 13C-NMR (150 MHz) của chất darutosid và tài liệu tham khảo 51 Bảng 3.2 Dữ liệu phổ 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) của chất CO1 và tài liệu tham khảo 58 Bảng 3.3 Khảo sát phương pháp HPLC xác định TCLQ trong nguyên liệu darutosid 60 Bảng 3.4 Kết quả khảo sát tính thích hợp hệ thống với pic darutosid 63 Bảng 3.5 Kết quả tiêm lặp lại dung dịch LOD và LOQ của darutosid 64 Bảng 3.6 Khoảng tuyến tính darutosid 65 Bảng 3.7 Độ lặp lại dung dịch darutosid 66 Bảng 3.8 Độ chính xác trung gian dung dịch darutosid trên KNV 2 66 Bảng 3.9 Tổng hợp độ chính xác trung gian dung dịch darutosid 67 Bảng 3.10 Khảo sát phương pháp xác định TCLQ trong nguyên liệu CO1 70 Bảng 3.11 Kết quả khảo sát tính thích hợp hệ thống với pic CO1 74 Bảng 3.12 Kết quả tiêm lặp lại dung dịch LOD và LOQ của CO1 74 Bảng 3.13 Khoảng tuyến tính CO1 75 Bảng 3.14 Độ lặp lại dung dịch CO1 76 Bảng 3.15 Độ chính xác trung gian dung dịch CO1 trên KNV 2 76 Bảng 3.16 Tổng hợp độ chính xác trung gian dung dịch CO1 77 Bảng 3.17 Kết quả đánh giá đồng nhất trong quá trình đóng gói 80 Bảng 3.18 Kết quả đánh giá hàm lượng TKSK chất chuẩn darutosid 82 Bảng 3.19 Kết quả đánh giá hàm lượng TKSK chất chuẩn CO1 83 Bảng 3.20 Tổng hợp hàm lượng TKSK chất chuẩn darutosid và CO1 84 Bảng 3.21 Hàm lượng tạp chất bay hơi trong chất chuẩn CO1 và darutosid 85 Bảng 3.22 Hàm lượng tạp chất vô cơ trong chất chuẩn CO1 và darutosid 85 Bảng 3.23 Theo dõi độ ổn định chất chuẩn darutosid 87 Bảng 3.24 Theo dõi độ ổn định chất chuẩn CO1 88 Bảng 3.25 Kết quả đánh giá phương pháp chiết Hy thiêm 89 Bảng 3.26 Kết quả khảo sát tính thích hợp hệ thống với pic kirenol 93 Bảng 3.27 Kết quả khảo sát tính thích hợp hệ thống với pic darutosid 94 Bảng 3.28 Khoảng tuyến tính kirenol và darutosid 94 Bảng 3.29 Kết quả đánh giá độ đúng với kirenol 96 Bảng 3.30 Kết quả đánh giá độ đúng với darutosid 96 Bảng 3.31 Kết quả khảo sát độ lặp lại trên mẫu Hy thiêm 97 Bảng 3.32 Kết quả khảo s