Luận án Nghiên cứu thu nhận chế phẩm phytoestrogen từ phôi đậu tương

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Lê Minh Châu NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM PHYTOESTROGEN TỪ PHÔI ĐẬU TƯƠNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội – 2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Lê Minh Châu NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM PHYTOESTROGEN TỪ PHÔI ĐẬU TƯƠNG Ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 9420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS. TS. ĐỖ THỊ HOA VIÊN 2. PGS. TS. HỒ PHÚ HÀ Hà Nội - 2023 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án này là trung thực và chưa từng được các tác giả khác công bố. Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ trong việc hoàn thành luận án đã được cảm ơn và các thông tin trong luận án đã được ghi rõ nguồn gốc. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong luận án này. Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Nghiên cứu sinh Lê Minh Châu Tập thể giáo viên hướng dẫn PGS.TS Đỗ Thị Hoa Viên PGS.TS Hồ Phú Hà ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án Tiến sỹ này, bên cạnh sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận được sự giúp đỡ rất lớn của nhiều thầy, cô giáo, và tập thể. Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành và sâu sắc đến PGS.TS – Đỗ Thị Hoa Viên – Bộ môn Công nghệ Sinh học và PGS.TS – Hồ Phú Hà – Bộ môn Công nghệ Thực phẩm – Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm – Đại học Bách Khoa Hà Nội, là những người đã tận tình hướng dẫn, định hướng, đào tạo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn tới các thầy cô giáo, các cán bộ Bộ môn Công nghệ Sinh học – Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm – Đại học Bách Khoa Hà Nội đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các cán bộ, công nhân viên khoa Hóa Thực phẩm – Viện Dinh dưỡng Quốc gia, phòng Thử nghiệm sinh học – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ tôi thực hiện các nghiên cứu của mình. Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị em đồng nghiệp trong Khoa Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Kinh tế - Kỹ thuật Công nghiệp nơi tôi đang công tác và giảng dạy đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và thực hiện Luận án. Cuối cùng tôi xin gửi tới gia đình và bạn bè – những người thân luôn là nguồn động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu những lời cảm ơn chân thành nhất. Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Nghiên cứu sinh Lê Minh Châu iii MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ................................................................................ vi DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................... ix DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ................................................................ xi MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1 Chương 1: TỔNG QUAN .......................................................................................... 4 1.1. Cây đậu tương và phôi đậu tương .................................................................... 4 1.1.1. Tình hình sản xuất tiêu thụ đậu tương tại Việt Nam ................................. 4 1.1.2. Thành phần hóa học phôi đậu tương ......................................................... 5 1.1.3. Thành phần các chất có hoạt tính sinh học trong phôi đậu tương ............ 8 1.2. Phytoestrogen ................................................................................................... 9 1.2.1. Tổng quan về phytoestrogen ..................................................................... 9 1.2.2. Phytoestrogen trong phôi đậu tương ....................................................... 12 1.2.3. Khả dụng sinh học của phytoestrogen đậu tương ................................... 14 1.2.4. Lợi ích của phytoestrogen aglycone đậu tương và các chất chuyển hóa của chúng với sức khỏe con người .................................................................... 16 1.2.5. Tính an toàn của phytoestrogen đậu tương ............................................. 19 1.3. Các phương pháp chiết xuất phytoestrogen ................................................... 21 1.3.1. Các phương pháp truyền thống ............................................................... 21 1.3.2. Các phương pháp hiện đại ....................................................................... 22 1.3.3. Phương pháp chiết xuất phytoestrogen phôi đậu tương .......................... 26 1.4. Sự chuyển hóa phytoestrogen glucoside đậu tương thành aglycone ............. 28 1.4.1. Sự chuyển hóa phytoestrogen glucoside bằng enzyme ........................... 29 1.4.2. Sự chuyển hóa phytoestrogen glucoside bằng vi sinh vật ...................... 33 1.5. Phương pháp tinh sạch phytoestrogen aglycone ............................................ 35 1.6. Các sản phẩm có chứa phytoestrogen từ đậu tương ...................................... 36 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 38 2.1. Vật liệu ........................................................................................................... 38 2.1.1. Phôi đậu tương ........................................................................................ 38 2.1.2. Hóa chất .................................................................................................. 38 2.1.3. Động vật thực nghiệm ............................................................................. 39 2.1.4. Thiết bị thí nghiệm .................................................................................. 39 2.2. Bố trí thí nghiệm và phương pháp nghiên cứu .............................................. 39 2.2.1. Phương pháp đánh giá và xử lý nguyên liệu ........................................... 41 2.2.2. Xây dựng chế độ chiết xuất phytoestrogen ............................................. 44 iv 2.2.3. Phương pháp thu nhận phytoestrogen aglycone ..................................... 45 2.2.4. Phương pháp đánh giá khả năng chống oxy hóa của các cao chiết phytoestrogen .................................................................................................... 48 2.2.5. Phương pháp đánh giá hoạt tính phytoestrogen in vivo .......................... 49 2.3. Xử lý số liệu ................................................................................................... 51 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .................................................................. 53 3.1. Đánh giá và xử lý nguyên liệu ....................................................................... 53 3.1.1. Đánh giá hàm lượng tạp chất phôi đậu tương ......................................... 53 3.1.2. Đặc tính bột phôi đậu tương .................................................................... 53 3.1.3. Đặc tính bột phôi đậu tương đã loại lipid ............................................... 56 3.2. Xây dựng chế độ chiết xuất phytoestrogen .................................................... 58 3.2.1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất phytoestrogen . 58 3.2.2. Tối ưu hóa bằng phương pháp đáp ứng bề mặt....................................... 64 3.3. Thu nhận phytoestrogen aglycone ................................................................. 72 3.3.1. Thu nhận cao phytoestrogen tổng ........................................................... 72 3.3.2. Chuyển hóa phytoestrogen glucoside thành aglycone bằng enzyme β- glucosidase ........................................................................................................ 73 3.3.3. Chuyển hóa phytoestrogen glucoside thành aglycone bằng enzyme cellulase ............................................................................................................. 78 3.3.4. So sánh hiệu quả quá trình thủy phân glucoside bằng enzyme β- glucosidase và cellulase .................................................................................... 85 3.3.5. Tinh sạch phytoestrogen aglycone .......................................................... 88 3.4. Đánh giá khả năng chống oxy hóa của các cao chiết phytoestrogen ............. 92 3.4.1. Đánh giá khả năng quét gốc tự do DPPH các cao chiết phytoestrogen .. 93 3.4.2. Đánh giá năng lực khử sắt các cao chiết phytoestrogen ......................... 94 3.5. Đánh giá hoạt tính phytoestrogen in vivo ...................................................... 97 3.5.1. Thử nghiệm liều phytoestrogen an toàn trên chuột BALB/c .................. 97 3.5.2. Ảnh hưởng của cao chiết phytoestrogen đến trọng lượng chuột thí nghiệm ............................................................................................................... 97 3.5.3. Ảnh hưởng của cao chiết phytoestrogen đến khối lượng tử cung .......... 99 3.5.4. Ảnh hưởng của cao chiết phytoestrogen đến số lượng noãn trứng ....... 103 3.5.5. Ảnh hưởng của cao chiết phytoestrogen đến hàm lượng estradiol ....... 107 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................ 111 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN .............. 113 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................. 114 PHỤ LỤC ............................................................................................................... 1 v PHỤ LỤC Phụ lục 1. Sắc ký đồ HPLC của các chất chuẩn phytoestrogen ................................. 1 Phụ lục 2. Sắc ký đồ HPLC bột phôi đậu tương......................................................... 2 Phụ lục 3. Sắc ký đồ HPLC bột phôi đậu tương đã loại lipid .................................... 4 Phụ lục 4. Sắc ký đồ HPLC cao phytoestrogen tổng .................................................. 6 Phụ lục 5. Sắc ký đồ HPLC cao phytoestrogen aglycone thô .................................... 8 Phụ lục 6. Sắc ký đồ HPLC cao phytoestrogen aglycone thô ................................. 10 Phụ lục 7. Sắc ký đồ HPLC cao phytoestrogen aglycone tinh sạch ......................... 12 Phụ lục 8. Khả năng quét gốc tự do DPPH của các cao chiết .................................. 14 Phụ lục 9. Năng lực khử sắt của các cao chiết ......................................................... 14 Phụ lục 10. Dạng mô hình tương quan của khả năng quét gốc DPPH của acid ascorbic ..................................................................................................................... 15 Phụ lục 11. Dạng mô hình tương quan khả năng quét gốc DPPH của cao phytoestrogen tổng ................................................................................................... 16 Phụ lục 12. Dạng mô hình tương quan khả năng quét gốc DPPH của cao phytoestrogen aglycone thô ...................................................................................... 17 Phụ lục 13. Dạng mô hình tương quan khả năng quét gốc DPPH của cao phytoestrogen aglycone tinh sạch ............................................................................. 18 Phụ lục 14. Dạng mô hình tương quan năng lực khử sắt của acid ascorbic ............. 19 Phụ lục 15. Dạng mô hình tương quan năng lực khử sắt của cao phytoestrogen tổng .................................................................................................................................. 20 Phụ lục 16. Dạng mô hình tương quan năng lực khử sắt của cao phytoestrogen aglycone thô .............................................................................................................. 21 Phụ lục 17. Dạng mô hình tương quan năng lực khử sắt của cao phytoestrogen aglycone tinh sạch .................................................................................................... 22 Phụ lục 18. Kiểm tra pair T-Test với cân nặng các nhóm thí nghiệm ...................... 23 Phụ lục 19. Kiểm tra phân bố chuẩn và số liệu ngoại lai khối lượng tử cung .......... 26 Phụ lục 20. Kiểm tra T-Test khối lượng tử cung với các nhóm nghiên cứu ............ 27 Phụ lục 21. Kiểm tra phân bố chuẩn và số liệu ngoại lai số nang sơ cấp ................. 32 Phụ lục 22. Kiểm tra T-Test với số lượng các nang sơ cấp ...................................... 33 Phụ lục 23. Kiểm tra phân bố chuẩn và số liệu ngoại lai hàm lượng estradiol trong huyết thanh ............................................................................................................... 38 Phụ lục 24. Kiểm tra T-Test với hàm lượng estradiol các nhóm nghiên cứu .......... 39 vi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt ADN Acid deoxyribonucleic ANOVA Analysis of variance Phân tích phương sai ASE Accelerated solvent extraction Phương pháp chiết xuất chất lỏng có áp suất AUC Area under the curve Vùng dưới đường cong BMP-2 Bone morphogenetic protein 2 CK Chất khô DPPH 2,2-diphenyl-picrylhydrazyl ĐCSL Đối chứng sinh lý đvC Đơn vị carbon E2 17-β-estradiol ELISA Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay Kỹ thuật enzyme liên kết kháng thể ER Estrogen receptor Thụ thể estrogen FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên hợp quốc FDA Food and Drug Administration Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ HDL-C High density lipoprotein cholesterol Lipoprotein cholesterol tỉ trọng cao HER Human epidement growth factor receptor Thụ thể yếu tố tăng trưởng thượng bì HPLC High-performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPR Horseradish Peroxidase LAB Lactic acid bacteria Vi khuẩn sinh acid lactic vii LD0 Lethal dose 0% Liều an toàn LDL-C Low density lipoprotein cholesterol Lipoprotein cholesterol tỉ trọng thấp LOF Lack of fit MAE Microwave-asissted extraction Phương pháp chiết xuất có hỗ trợ vi sóng mARN Acid ribonucleic thông tin MSPD Matrix solid-phase dispersion Phương pháp chiết xuất phân tán pha rắn ma trận NAMS North American Menopause Society Hiệp hội mãn kinh Bắc Mỹ NPCE Negative pressure cavitation extraction Phương pháp chiết xuất xâm thực áp suất âm OD Optical density Phép đo mật độ quang PCNA Proliferating cell nuclear antigen Kháng nguyên nhân tế bào tăng sinh PLE Pressurized liquid extraction Phương pháp chiết xuất lỏng cao áp PR Progesterone PSE Pressurized solvent extraction Phương pháp chiết xuất dung môi cao áp SD Standard deviation Độ lệch chuẩn SC-CO2 Carbon dioxide siêu tới hạn SFE Supercritical fluid extraction Phương pháp chiết xuất chất lỏng siêu tới hạn SLE Solid liquid extraction Phương pháp chiết xuất rắn - lỏng SPE Solid phase extraction Phương pháp chiết xuất pha rắn SPSS Statistical package for the Social Phần mềm máy tính phục vụ công tác phân tích thống kê viii TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam Topo Topoisomerase UAE Ultrasonication-asissted extraction Phương pháp chiết xuất có hỗ trợ siêu âm UNU University of united nation Đại học Liên hợp quốc US United nation of states Hoa Kỳ UV Ultra violet Tia cực tím UVB Ultra violet-B Tia cực tím loại B VCD 4-vinylcyclohexene diepoxide VLDL-C Very low density lipoprotein cholesterol Lipoprotein cholesterol tỉ trọng rất thấp WHO World Health Organization Tổ chức Y tế thế giới ix DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Diện tích năng suất và sản lượng đậu tương ở Việt Nam từ năm 2015- 2020 ........................................................................................................................... 4 Bảng 1.2 Thành phần hóa học phôi đậu tương so với các bộ phận khác .................. 6 Bảng 1.3 Thành phần các acid amin trong phôi đậu tương so với toàn hạt ............... 6 Bảng 1.4 Tính chất hóa lý của lipid từ phôi đậu tương ............................................. 8 Bảng 1.5 Tổng hợp các chuyển hóa isoflavone glucsoside nhờ LAB ...................... 34 Bảng 3.1 Kết quả đánh giá lượng tạp trong phôi đậu tương .................................... 53 Bảng 3.2 Đặc tính bột phôi đậu tương ...................................................................... 53 Bảng 3.3 Hàm lượng các phytoestrogen trong bột phôi đậu tương ......................... 54 Bảng 3.4 Thành phần các dạng phytoestrogen liên hợp trong bột phôi đậu tương .. 55 Bảng 3.5 Đặc tính bột phôi đậu tương đã loại lipid ................................................. 56 Bảng 3.6 Hàm lượng các phytoestrogen trong bột phôi đậu tương đã loại lipid ..... 57 Bảng 3.7 Thành phần các dạng phytoestrogen liên hợp trong bột phôi đậu tương đã loại lipid .................................................................................................................... 58 Bảng 3.8 Bảng tổng hợp các yếu tố ảnh hưởng đến khối lượng dịch chiết phytoestrogen tổng ................................................................................................... 63 Bảng 3.9 Bảng giá trị mã hóa và thực nghiệm của các yếu tố ................................. 64 Bảng 3.10 Khối lượng dịch chiết phytoestrogen tổng trong các phương án thí nghiệm ...................................................................................................................... 65 Bảng 3.11 Phân tích ANOVA cho mô hình hồi quy ................................................ 66 Bảng 3.12 Bảng tổng hợp các giá trị R2 mô hình ..................................................... 67 Bảng 3.13 Hàm lượng các phytoestrogen trong dịch chiết phytoestrogen tổng ...... 72 Bảng 3.14 Hàm lượng các phytoestrogen trong cao chiết trước thủy phân ............. 73 Bảng 3.15 So sánh chế độ thủy phân và hiệu suất thủy phân các dạng glucoside của enzyme β-glucosidase hạnh nhân và enzyme cellulase ............................................ 87 Bảng 3.16 Hàm lượng các phytoestrogen trong các cao chiết theo các giai đoạn thu nhận .......................................................................................................................... 90 Bảng 3.17 Độ tinh sạch của các cao chiết phytoestrogen theo các giai đoạn thu nhận .................................................................................................................................. 91 Bảng 3.18 Bảng tổng hợp khả năng chống oxy hóa của các cao chiết phytoestrogen .................................................................................................................................. 96 Bảng 3.19 Tình trạng sinh lý chung chuột ............................................................... 97 Bảng 3.20 Trọng lượng trung bình cơ thể chuột trước và sau điều trị ..................... 97 Bảng 3.21 Khối lượng tử cung chuột các nhóm thí nghiệm (g/10g thể trọng) ...... 100 Bảng 3.22 Hệ số p giữa tỷ lệ khối lượng tử cung/thể trọng các nhóm nghiên cứu 100 Bảng 3.23 Số lượng nang sơ cấp các nhóm nghiên cứu ......................................... 104 x Bảng 3.24 Hệ số p giữa số lượng nang sơ cấp các nhóm nghiên cứu .................... 104 Bảng 3.25 Hệ số p giữa hàm lượng estradiol trong huyết thanh các nhóm nghiên cứu .......................................................................................................................... 107 xi DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Phôi đậu tương khô giống Đ8 Việt Nam (độ phóng đại 3 lần) ................... 5 Hình 1.2 Công thức cấu tạo tổng quát các phytoestrogen ....................................... 10 Hình 1.3 Công thức tổng quát các phytoestrogen trong phôi hạt đậu tương ........... 12 Hình 1.4 Con đường chuyển hóa phytoestrogen β-glucoside trong hệ tiêu hóa ..... 15 Hình 1.5 Vị trí cắt của enzyme β-glucosidase ......................................................... 30 Hình 1.6 Quá trình thủy phân của các enzyme trong hệ enzyme cellulase ............. 33