Luận án Phân lập, tạo đột biến điểm ở gen P5CS liên quan đến tính chịu hạn và thử nghiệm chuyển vào cây đậu tương Việt Nam

DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT ABA Abcisis acid DNA Deoxyribonucleic acid RNA Ribonucleic acid ATP Adenozin triphosphata ATP-ase Enzym phân giải ATP cDNA Sợi DNA bổ sung được tổng hợp từ RNA thông tin nhờ enzym phiên mã ngược (Complementary DNA) AS Acetosyringone A. tumefaciens Agrobacterium tumefaciens BAP 6-benzyladenine bar gen mã hóa cho enzyme phosphinothricin acetyl transferase bp Base pair CCM Cocultivation medium - DEPC Diethyl pyrocarbonate đtg đồng tác giả dNTP deoxynucleoside triphosphate EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid E. coli Escherichia coli GA3 Gibberellic acid GM Germination medium – môi trường nảy mầm hạt GUS β –Glucuronidase gene = Gen mã hóa enzyme β-Glucuronidase HSP Heat shock protein (Protein sốc nhiệt) IAA Indoleacetic acid IBA Indole-3-butyric acid IPTG Isopropylthio-beta-D-galactoside kb kilo base LB Luria Bertani LSD Least significant difference = độ lệch chuẩn LEA Late embryogenesis abundant MES 2-[N-morpholino]ethanesulfonic acid MS Môi trường muối cơ bản theo Murashige và Skoog (1962) NAA α-Naphthaleneacetic acid nptII Neomycin phosphotransferase gene OD Optical density P5CS pyroline-5-carboxylate synthetase P5CDH Pyrroline 5 carboxylate dehydrogenase P5CR Pyrroline 5 carboxylate reductase PDH Pyrroline dehydrogenase 1 rd29A Responsive Dehydration PCR Polymerase Chain Reaction – phản ứng chuỗi polymerase RM Rooting medium – môi trường ra rễ SDS Sodium dodecylsulfat SIM Shoot induction medium – môi trường tạo đa chồi SEM Shoot elongation medium – môi trường kéo dài chồi Taq Thermus aquaticus DNA T-DNA Transfer –DNA = đoạn ADN được chuyển Ti- plasmid Tumor inducing plasmid = plasmid gây khối u TBE Tris - Boric acid - EDTA TAE Tris - Acetate - EDTA TE Tris - EDTA v/p vòng/phút X-gluc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide X-gal 5-brom- 4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosidase YEP Yeast extract peptone MỤC LỤC MỞ ĐẦU................................................................................................................ 0 1. Đặt vấn đề ........................................................................................................... 1 2. Mục tiêu nghiên cứu............................................................................................ 2 3. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................... 2 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................... 4 1.1. CÂY ĐẬU TƯƠNG (GLYCINE MAX (L.) MERRILL), GIÁ TRỊ KINH TẾ VÀ GIÁ TRỊ SỬ DỤNG ............................................................................................... 4 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại ................................................................................. 4 1.1.2. Đặc điểm sinh học ......................................................................................... 4 1.1.3. Giá trị kinh tế và giá trị sử dụng của cây đậu tương ....................................... 5 1.1.4. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và ở Việt Nam............................. 6 1.2. CƠ SỞ SINH LÝ, HÓA SINH CỦA ĐẶC TÍNH CHỐNG CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG ............................................................................................. 10 1.2.1. Khả năng thích nghi của bộ rễ trong điều kiện hạn ...................................... 11 1.2.1.1.Sự phát triển của bộ rễ............................................................................... 11 1.2.1.2. Khả năng cố định nitơ của cây đậu tương trong điều kiện hạn .................. 13 1.2.2. Các tính trạng liên quan đến sự thích ứng của lá cây đậu tương trong điều kiện hạn........................................................................................................................ 14 1.2.2.1. Cường độ thoát hơi nước của khí khổng ................................................... 14 1.2.2.2. Cường độ thoát hơi nước của biểu bì ........................................................ 15 1.2.2.3. Mật độ lông tơ của lá................................................................................ 16 1.2.2.4. Hiệu quả sử dụng nước............................................................................. 17 1.2.3. Đáp ứng về phương diện hóa sinh của cây đậu tương trong điều kiện hạn ... 18 1.2.4. Một số gen liên quan đến tính chịu hạn ................................................................... 19 1.3. PROLIN VÀ VAI TRÒ CỦA ENZYME P5CS TRONG CON ĐƯỜNG SINH TỔNG HỢP PROLIN ........................................................................................... 21 1.3.1. Quá trình sinh tổng hợp prolin..................................................................... 21 1.3.2. Điều hòa quá trình trao đổi prolin ở thực vật ............................................... 23 1.3.3. Vai trò của sự tích lũy prolin đối với tính chống chịu của cây...................... 25 1.3.4. Vai trò của enzym pyrroline-5-carboxylate synthetase đối với tính chống chịu của cây trồng .............................................................................................................................. 27 1.4. PROMOTER VÀ VAI TRÒ ĐIỀU KHIỂN HOẠT ĐỘNG CỦA GEN DƯỚI ĐIỀU KIỆN KHÔ HẠN 29 1.4.1. Cấu trúc và chức năng của promoter 29 1 1.4.2. Các loại promoter sử dụng trong công nghệ sinh học 30 1.4.3. Promoter rd29A 32 1.5. NGHIÊN CỨU NÂNG CAO KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG................................................................................................................ 32 1.5.1. Nâng cao khả năng chịu hạn của cây đậu tương bằng phương pháp đột biến thực nghiệm.................................................................................................................. 32 1.5.2. Sử dụng công nghệ tế bào thực vật trong chọn dòng đậu tương chịu hạn..... 33 1.5.3. Sử dụng kỹ thuật chuyển gen để nâng cao khả năng chịu hạn của cây đậu tương .............................................................................................................................. 35 1.5.3.1. Các phương pháp chuyển gen ở thực vật .................................................. 35 1.5.3.2. Tiềm năng của phương pháp chuyển gen ở thực vật trong nghiên cứu tạo cây đậu tương chịu hạn................................................................................................ 37 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................... 38 2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ ............................................................. 38 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................. 39 2.2.1. Phương pháp sinh lý, hoá sinh..................................................................... 39 2.2.1.1. Đánh giá nhanh khả năng chịu hạn ........................................................... 39 2.2.1.2. Định lượng protein, lipit, hàm lượng và thành phần axit amin trong hạt .... 39 2.2.1.3. Xác định hàm lượng prolin ....................................................................... 40 2.2.1.4. Phương pháp tính toán và xử lý số liệu..................................................... 40 2.2.2. Các phương pháp sử dụng nuôi cấy in vitro................................................. 40 2.2.2.1. Arabidopsis ............................................................................................. 40 2.2.2.2. Thuốc lá .................................................................................................. 40 2.2.2.3. Đậu tương ............................................................................................... 41 2.2.3. Phương pháp sinh học phân tử..................................................................... 44 2.2.3.1. Thiết kế mồi ............................................................................................. 44 2.2.3.2. Phương pháp tách chiết, tinh sạch DNA và RNA...................................... 44 2.2.3.3. Phương pháp tổng hợp cDNA................................................................... 45 2.2.3.4. Phản ứng PCR ......................................................................................... 45 2.2.3.5. Phương pháp OE - PCR ( Overlap Extention)........................................... 46 2.2.3.6. Phương pháp tách dòng ............................................................................ 46 2.2.3.7. Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR) ........................... 49 2.2.2.8. Thiết kế cấu trúc rd29A::GUS và rd29A::P5CSM……… ..……………49 2.2.3.9. Các phương pháp phân tích cây biến nạp.................................................. 52 2 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 53 3.1. KẾT QUẢ SƯU TẬP VÀ ĐÁNH GIÁ CÁC GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐỊA PHƯƠNG CỦA TỈNH SƠN LA ........................................................................... 53 3.1.1. Đặc điểm hình thái, hóa sinh của hạt đậu tương........................................... 53 3.1.2. Kết quả đánh giá khả năng chịu hạn của các giống đậu tương nghiên cứu ... 55 3.2. PHÂN LẬP GEN P5CS VÀ ĐỘT BIẾN ĐIỂM LOẠI BỎ ỨC CHẾ NGƯỢC ..... 58 3.2.1. Kết quả phân lập gen P5CS ......................................................................... 58 3.2.2. Kết quả khuếch đại, tách dòng và xác định trình tự gen P5CS ..................... 58 3.2.3. Tạo đột biến điểm loại bỏ hiệu ứng ức chế ngược P5CS phân lập từ cây đậu tương..... 69 3.3. PHÂN LẬP VÀ KIỂM TRA HOẠT ĐỘNG CỦA PROMOTER CẢM ỨNG KHÔ HẠN rd29A ................................................................................................. 72 3.3.1. Phân lập promoter rd29A............................................................................. 72 3.3.2. Phân tích trình tự promoter rd29A ............................................................... 73 3.3.3. Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc rd29A ........................................ 75 3.3.4. Tạo cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc rd29A :: GUS .......................... 75 3.4. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC rd29A::P5CSM .......................................... 78 3.4.1. Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc rd29A::P5CSM.......................... 78 3.4.2. Tạo cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc rd29A::P5CSM ....................... 81 3.4.3. Đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng thuốc lá chuyển gen ................... 82 3.5. KẾT QUẢ TẠO CÂY ĐẬU TƯƠNG CHUYỂN GEN.................................. 84 3.5.1. Kết quả tái sinh tạo đa chồi ở giống đậu tương DT84 .................................. 84 3.5.1.1. Tối ưu thời gian khử trùng hạt .................................................................. 84 3.5.1.2. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo đa chồi từ lá mầm hạt chín ........... 87 3.5.1.3. Ảnh hưởng của hocmon sinh trưởng GA3 tới khả năng kéo dài chồi ................... 89 3.5.1.4. Ảnh hưởng của IBA đến hiệu quả tạo rễ ................................................... 91 3.5.1.5. Xác định giá thể thích hợp cho ra cây in vitro.......................................... 93 3.5.2. Kết quả bước đầu chuyển gen GUS vào cây đậu tương DT84...................... 94 3.5.3. Kết quả chuyển cấu trúc gen chịu hạn vào đậu tương .................................. 96 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................. 99 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 102 3 DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1 Diện tích sản xuất đậu tương ở một số quốc gia trên thế giới 7 Bảng 1.2 Sản lượng đậu tương ở một số quốc gia trên thế giới 7 Bảng 1.3 Năng suất đậu tương ở một số quốc gia trên thế giới 8 Bảng 1.4 Sản lượng đậu tương tại các tỉnh và thành phố 9 Bảng 1.5 Cây chuyển gen mang gen P5CS 29 Bảng 2.1 Thành phần dung dịch đệm tách chiết 45 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 46 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng OE -PCR 46 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng gắn gen/promoter vào vector tách dòng 47 Bảng 2.5 Thành phần hoá chất tách plasmid 48 Bảng 2.6 Thành phần phản ứng colony - PCR 49 Bảng 2.7 Thành phần phản ứng cắt rd29A và vector pBI 101 bằng BamHI và HindII 50 Bảng 2.8 Thành phần phản ứng ghép nối rd29A :: pBI 101 50 Bảng 2.9 Thành phần phản ứng cắt rd29A:: P5CSM bằng BamHI và SacI 50 Bảng 2.10 Thành phần phản ứng ghép nối rd29A:: pBI 101 51 Bảng 2.11 Thành phần phản ứng cắt plasmid rd29A :: pBI101 ::P5CSM 52 Bảng 3.1 Các giống đậu tương địa phương sưu tập tại tỉnh Sơn La 53 Bảng 3.2 Chỉ số chịu hạn và tỷ lệ tăng hàm lượng prolin của 7 giống đậu tương nghiên cứu 57 Bảng 3.3 Vị trí và trình tự nucleotid của các mồi đặc hiệu gen P5CS 58 Bảng 3.4 Vị trí sai khác trong trình tự nucleotid của gen P5CS ở 3 giống đậu tương 64 Bảng 3.5 Vị trí sai khác trong trình tự axit amin của gen P5CS ở 3 giống đậu tương 65 Bảng 3.6 Vị trí và trình tự nucleotid của các mồi đặc hiệu gen P5CS 69 Bảng 3.7 Hàm lượng prolin tích lũy trong các dòng thuốc lá nghiên cứu (µmol/g) 82 4 Bảng 3.8 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng javen đến khả năng nảy mầm đậu tương DT84 85 Bảng 3.9 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng khí clo đến khả năng nảy mầm đậu tương DT84 86 Bảng 3.10 Ảnh hưởng của BAP tới khả năng tạo đa chồi 88 Bảng 3.11 Ảnh hưởng của GA3 đến khả năng kéo dài chồi 90 Bảng 3.12 Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ 92 Bảng 3.13 Tỷ lệ tái sinh/ sống sót của các mẫu qua các giai đoạn 97 5 DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Chu trình sinh tổng hợp prolin ở thực vật bậc cao 22 Hình 1.2 Cơ chế và các tác nhân điều hòa quá trình trao đổi prolin ở thực vật 23 Hình 1.3 Vai trò của prolin đối với tính chống chịu của cây 25 Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm tái sinh cây đậu tương 42 Hình 2.2 Hình 2.3 Sơ đồ chuyển gen vào cây đậu tương qua nách lá mầm Tạo vector chuyển gen mang promoter rd 29A 43 49 Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn khả năng chịu hạn tương đối của một số giống đậu tương địa phương và giống DT84 56 Hình 3.2 Sản phẩm tách RNA 59 Hình 3.3 Kết quả nhân hai đoạn gen P5CS từ 2 giống đậu tương DT84 và SL5 59 Hình 3.4 Kết quả PCR ghép nối hai đoạn gen P5CS từ 2 giống đậu tương DT84 và SL5 60 Hình 3.5 Kết quả tách dòng gen P5CS từ 2 giống đậu tương DT84 và SL5 62 Hình 3.6 Trình tự nucleotid của gen P5CS ở 3 giống đậu tương 64 Hình 3.7 Trình tự axit amin của Protein do gen P5CS mã hóa ở 3 giống đậu tương 67 Hình 3.8 Mức độ tương đồng của các axit amin gen P5CS mã hóa của các giống đậu tương. 68 Hình 3.9 Sơ đồ cây phát sinh chủng loại so sánh mức độ tương đồng của các axit amin của protein do gen P5CS của các giống đậu 68 Hình 3.10 Điện di sản phẩm PCR 70 Hình 3.11 Phản ứng nối hai đoạn gen theo phương pháp OE-PCR với cặp mồi BamHI-P5CS và Sacl -P5CS 70 Hình 3.12 Điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp bằng enzym cắt giới hạn BamHI 71 Hình 3.13 Phân tích, so sánh trình tự nucleotid và phát hiện đột biến tại vị trí nucleotid 374 của gen P5CS 71 6 Hình 3.14 Kết quả nuôi cấy invitro cây Arabidopsis thaliana 72 Hình 3.15 Điện di sản phẩm PCR và cắt hạn chế vector pBT/rd29A 73 Hình 3.16 Phân tích trình tự promoter rd29A 74 Hình 3.17 Sơ đồ thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc rd29A 75 Hình 3.18 Điện di sản phẩm PCR và cắt hạn chế vector pBI101/rd29A 75 Hình 3.19 Một số hình ảnh chuyển cấu trúc promoter rd29A vào thuốc lá 76 Hình 3.20 Biểu hiện gen GUS trên cây chuyển gen 77 Hình 2.21 Hoạt tính của enzym GUS ở các dòng cây thuốc lá chuyển gen mang promoter rd29A dưới điều kiện hạn nhân tạo 78 Hình 3.22 Các sản phẩm cắt đồng thời bằng enzym BamHI và SacI 79 Hình 3.23 Điện di sản phẩm cloning PCR và cắt hạn chế vector pBT rd29A::/P5CSM 80 Hình 3.24 Kết quả colny PCR chọn dòng trong A. tumefaciens 81 Hình 3.25 Kết quả PCR các dòng chuyển gen bằng cặp mồi rd29A for/rd29Arev 82 Hình 3.26 Hàm lượng prolin tích lũy trong các thời gian gây hạn nhân tạo 83 Hình 3.27 Các dòng cây thuốc lá sau 20 ngày hạn nhân tạo (A) và sau phục hồi (B) 84 Hình 3.28 Hạt nảy mầm bằng các phương pháp khử trùng khác nhau 87 Hình 3.29 Cụm chồi hình thành trên môi trường có nồng độ BAP khác nhau 89 Hình 3.30 Chồi kéo dài trên môi trường có nồng độ GA3 khác nhau 90 Hình 3.31 Ảnh hưởng của IBA tới việc hình thành rễ cây in vitro 93 Hình 3.32 Huấn luyện cây, trồng ở nhà lưới và thu hoạch quả 94 Hình 3.33 Hình 3.34 Biểu hiện của gen GUS Sơ đồ hoàn chỉnh chuyển gen vào cây đậu tương qua nách lá mầm 95 96 Hình 3.35 Hình ảnh minh họa quá trình chuyển gen 97 Hình 3.36 Kiểm tra cây đậu tương T0 chuyển gen bằng PCR 98 Hình 3.37 Cây đậu tương T0 chuyển gen 98 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Cây đậu tương (Glycine max L. Merrill) là một trong những cây trồng quan trọng không chỉ ở Việt Nam mà còn đối với nhiều quốc gia trên thế giới. Hạt đậu tương có thể được dùng làm nguồn thức ăn giàu đạm cho con người và là nguồn nguyên liệu quan trọng cho nhiều ngành công nghiệp chế biến. Đậu tương là loại cây trồng ngắn ngày, có giá trị kinh tế cao khi sử dụng làm thương phẩm, và được sử dụng cho mục đích cải tạo đất. Bên cạnh đó, đậu tương rất dễ canh tác, có khả năng thích nghi với nhiều vùng sinh thái, khí hậu khác nhau và được trồng ở nhiều vùng quốc gia và vùng lãnh thổ với sản lượng năm 2009 là trên 222 triệu tấn [107]. Tại Việt Nam, cây đậu tương cũng giữ vai trò rất quan trọng trong cơ cấu cây trồng ở nhiều địa phương, với sản lượng trung bình từ 2001 - 2009 là 239,1 nghìn tấn. Theo thống kê năm 2009 cho thấy, cây đậu tương được canh tác có hệ thống trên diện tích là 146,2 nghìn ha ở 28 tỉnh thành trải đều từ Bắc vào Nam, nhưng tập trung chủ yếu vẫn là ở miền Bắc với sản lượng của cả nước là 213,6 nghìn tấn [107]. Trong khu vực ASEAN, năng suất đậu tương năm 2009 của Việt Nam đứng thứ 3 trong số 6 nước trồng đậu tương là Campuchia, Lào, Myanmar, Philipin, Thái Lan và Việt Nam. Tuy nhiên so với các trung tâm sản xuất đậu tương của thế giới là Argentina, Brazil và Hoa Kỳ thì sản lượng đậu tương của nước ta còn khá thấp [107]. Vì thế, để đáp ứng đủ nhu cầu trong nước nên chúng ta phải nhập khẩu đậu tương với số lượng lớn từ các quốc gia bên ngoài đặc biệt là Hoa Kỳ. Tình trạng hạn hán ảnh hưởng tới tình hình sản xuất đậu tương không chỉ ở Việt Nam mà ngay cả những nước sản xuất đậu tương hàng đầu thế giới như Argentina. Thống kê cho thấy, sản lượng đậu tương của Argentina vào vụ mùa năm 2009 giảm từ 34,5 triệu tấn so với cùng thời điểm năm 2008 là 46,2 triệu tấn. Ở Việt Nam, tình hình thiếu nước trầm trọng tại các địa phương làm cho sản lượng đậu tương của năm 2009 giảm xuống chỉ còn 213,6 nghìn tấn so với năm 2007 là 275,2 nghìn tấn và năm 2008 là 267,6 nghìn tấn [106]. Đậu tương là cây trồng thuộc nhóm cây có khả 2 năng chịu hạn kém. Chính vì vậy nghiên cứu tạo giống đậu tương có khả năng sống trong điều kiện bất lợi về nước đang là hướng nghiên cứu rất được quan tâm của các nhà chọn giống. Ở Việt Nam, nhiều giống đậu tương có khả năng chống chịu hạn đã được chọn tạo thành công và đang được triển khai canh tác ở một số địa phương. Có thể kể đến các giống DT96, DT2008 do các nhà khoa học tại Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam chọn tạo. Dòng đậu tương ML48, ML61 do tác giả Chu Hoàng Mậu chọn tạo có khả năng chịu hạn cao [15]. Tuy nhiên các phương pháp chọn giống truyền thống tốn nhiều thời gian, phức tạp và cần phải có quần thể đủ lớn và không ổn định. Những nhược điểm của phương pháp truyền thống có thể được khắc phục bằng việc áp dụng các kỹ thuật mới của công nghệ sinh học. Kỹ thuật chuyển gen ở thực vật thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens đã