Luận văn Nghiên cứu khả năng sinh Aspergillus niger pectinmethylesterase trên cơ chất bã táo

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG NGUYỄN THỊ KIM NGÂN NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH ASPERGILLUS NIGER PECTIN METHYLESTERASE TRÊN CƠ CHẤT BÃ TÁO Luận văn tốt nghiệp Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Cần Thơ, 2009 Luâṇ văn tốt nghiêp̣ Đaị hoc̣ khóa 31 Trường Đaị hoc̣ Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang i Luận văn đính kèm theo đây, với tựa đề tài: “Nghiên cứu khả năng sinh Aspergillus niger pectinmethylesterase trên cơ chất bã táo” do Nguyễn Thị Kim Ngân thực hiện và báo cáo đã đƣợc hội đồng chấm luận văn thông qua. Cán bộ hƣớng dẫn Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2009 Chủ tịch hội đồng Luâṇ văn tốt nghiêp̣ Đaị hoc̣ khóa 31 Trường Đaị hoc̣ Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang ii LỜI CAM ĐOAN  Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân. Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ luận văn nào trƣớc đây. Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2009 Nguyễn Thị Kim Ngân Luâṇ văn tốt nghiêp̣ Đaị hoc̣ khóa 31 Trường Đaị hoc̣ Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang iii LỜI CẢM TẠ  Để hoàn thành tốt luận văn, ngoài những cố gắng của bản thân, thì sự giúp đỡ của quý thầy cô là động lực to lớn giúp tôi vƣợt qua tất cả những khó khăn. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy Nguyễn Văn Mƣời và cô Trần Thanh Trúc đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ dạy những kiến thức quý báu cho tôi, không chỉ trong quá trình thực hiện luận văn mà trong suốt thời gian học tập. Thầy cô đã chuẩn bị hành trang vững chắc cho tôi bƣớc vào con đƣờng tƣơng lai. Chân thành cảm ơn tất cả thầy, cô giảng dạy bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm đã tận tình giảng dạy, truyền đạt những kiến thức, những bài học quý báu trong suốt thời gian học tập tại trƣờng. Xin gửi lời cảm ơn thân thƣơng và chúc thành công đối với các bạn Công Nghệ Thực Phẩm khóa 31, những ngƣời sẵn sàng giúp đỡ và động viên tinh thần trong khi tôi thực hiện đề tài. Luâṇ văn tốt nghiêp̣ Đaị hoc̣ khóa 31 Trường Đaị hoc̣ Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang iv TÓM TẮT  Đề tài: “Nghiên cứu khả năng sinh Aspergillus niger pectinmethylesterase trên cơ chất bã táo”, được thực hiện nhằm khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy đến sự phát triển của nấm mốc Aspergillus niger trên cơ chất bã táo để thu được PME có hoạt tính cao. Trong đó, các điều kiện môi trường như độ ẩm (dựa trên tỉ lệ pha loãng giữa cơ chất bã táo và nước), pH môi trường, thành phần đạm bổ sung và thời gian ủ thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp PME hoạt tính cao được khảo sát. Kết quả nghiên cứu cho thấy ở tỉ lệ pha loãng 1:3, pH = 4,0, nuôi cấy nấm mốc trong 96 giờ và bổ sung thêm 0,2% (NH4)2SO4 là các điều kiện môi trường tối ưu để nấm mốc phát triển và sinh tổng hợp PME có hoạt tính cao nhất. Hoạt tính PME đạt 383,20 (U/mL). Luâṇ văn tốt nghiêp̣ Đaị hoc̣ khóa 31 Trường Đaị hoc̣ Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang v MỤC LỤC  LỜI CAM ĐOAN .................................................................................................................. ii LỜI CẢM TẠ ....................................................................................................................... iii TÓM TẮT ............................................................................................................................. iv MỤC LỤC ............................................................................................................................. v DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT .......................................................................................... vii DANH SÁCH HÌNH .......................................................................................................... viii DANH SÁCH BẢNG ........................................................................................................... ix Chƣơng 1 ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1 1.1 TỔNG QUAN ........................................................................................................ 1 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU .................................................................................. 2 Chƣơng 2 LƢƠC̣ KHẢO TÀI LIÊỤ .................................................................................. 3 2.1 GIỚI THIỆU PECTIN METHYLESTERASE ...................................................... 3 2.1.1 Đặc tính sinh lý, sinh hóa .............................................................................. 3 2.1.2 Kiểu phản ứng ................................................................................................ 4 2.1.3 Nguồn tổng hợp PME .................................................................................... 5 2.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme PME ..................... 6 2.2 MỘT SỐ ỨNG DỤNG CỦA PME ..................................................................... 10 2.3 PECTIN ............................................................................................................... 11 2.3.1 Cấu tạo hóa học của pectin ......................................................................... 11 2.3.2 Mức độ ester hóa của pectin ........................................................................ 12 2.3.3 Vai trò chuyển hóa pectic trong sự thay đổi cấu trúc tế bào thực vật ......... 13 2.4 QUÁ TRÌNH TRÍCH LY ENZYME PME TỪ NẤM MỐC A. NIGER TRÊN CƠ CHẤT BÃ TÁO .............................................................................................................. 14 2.4.1 Khái quát về nguyên liệu táo ....................................................................... 14 2.4.2 Giống vi sinh vật .......................................................................................... 15 2.4.3 Môi trường nuôi cấy .................................................................................... 17 2.4.4 Thu nhận enzyme ......................................................................................... 18 2.4.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp PME ................................... 18 Luâṇ văn tốt nghiêp̣ Đaị hoc̣ khóa 31 Trường Đaị hoc̣ Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang vi 2.5 MỘT SỐ KẾT QUẢ ĐÃ NGHIÊN CỨU ........................................................... 19 Chƣơng 3 PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM .................................. 21 3.1 PHƢƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM .......................................................................... 21 3.1.1 Thời gian địa điểm ....................................................................................... 21 3.1.2 Dụng cụ - hóa chất ....................................................................................... 21 3.1.3 Nguyên liệu táo ............................................................................................ 21 3.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................................................... 22 3.2.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu ......................................................................... 22 3.2.2 Phương pháp xử lý số liệu ........................................................................... 22 3.3 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM ........................................................................................ 22 3.3.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng giữa tỉ lệ pha loãng của cơ chất và nước đến khả năng tổng hợp PME của A.niger ................................................................................. 22 3.3.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của thời gian ủ đến khả năng tổng hợp PME của nấm mốc Aspergillus niger .......................................................................................... 23 3.3.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng tổng hợp PME của nấm mốc ............................................................................................................... 25 3.3.4 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của tỉ lệ amonium sulfate (NH4)2SO4 bổ sung đến khả năng sinh PME từ nấm mốc A.niger .................................................................... 26 Chƣơng 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN ................................................................................ 28 4.1 ẢNH HƢỞNG CỦA TỈ LỆ PHA LOÃNG GIỮA CƠ CHẤT VÀ NƢỚC ........ 28 4.2 ẢNH HƢỞNG CỦA THỜI GIAN ĐẾN KHẢ NĂNG SINH PME CỦA NẤM MỐC A. NIGER ............................................................................................................... 30 4.3 ẢNH HƢỞNG CỦA SỰ THAY ĐỔI pH MÔI TRƢỜNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH PME TỪ ASPERGILLUS NIGER ......................................................................... 31 4.4 ẢNH HƢỞNG CỦA AMONIUM SULFATE (NH4)2SO4 BỔ SUNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH A. NIGER PME ......................................................................................... 33 Chƣơng 5 KẾT LUẬN-KIẾN NGHỊ ................................................................................ 35 5.1 KẾT LUẬN .......................................................................................................... 35 5.2 KIẾN NGHỊ ......................................................................................................... 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................... 36 PHỤ LỤC .............................................................................................................................. x Luâṇ văn tốt nghiêp̣ Đaị hoc̣ khóa 31 Trường Đaị hoc̣ Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang vii DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT  β-GALase: β-galactosidase DE: degree of esterification DP: degree of polymerization FDA: food and drug administration GalA: acid polygalacturonic HG: homogalacturonan PE: pectinesterase PG: polygalacturonase PGL: exopolygalacturonate lyase PI: pink PL: pectate lyase PME: pectin methyl esterase PMEI: pectin methyl esterase inhibitor PVP: polyvinylpyrrolidone RG: rhamnose RGI: rhamnogalacturonan I RGII: rhamnogalacturonan II VI: vacuum infusion Luâṇ văn tốt nghiêp̣ Đaị hoc̣ khóa 31 Trường Đaị hoc̣ Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang viii DANH SÁCH HÌNH  Hình 1: Mô tả vị trí thủy phân của PME đối với nhóm methoxyl ......................................... 5 Hình 2: Ảnh hƣởng của nồng độ c ơ chất đến hoạt tính enzyme .......................................... 7 Hình 3: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến đến tốc độ phản ứng của enzyme ............................. 7 Hình 4: Ảnh hƣởng của pH đến hoạt động của enzyme ....................................................... 8 Hình 5: Cấu tạo phân tử pectin ............................................................................................ 12 Hình 6: Cấu tạo phức chất calci pectate............................................................................... 13 Hình 7: Trái táo (Ziziphus nummularia) .............................................................................. 15 Hình 8: Hình dạng nấm mốc Aspergillus niger ................................................................... 16 Hình 9: Sơ đồ thí nghiệm ảnh hƣởng giữa tỉ lệ pha loãng của cơ chất và nƣớc đến khả năng tổng hợp PME của nấm mốc ................................................................................................ 23 Hình 10: Sơ đồ thí nghiệm ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng tổng hợp PME của nấm mốc ........................................................................................................................ 24 Hình 11: Sơ đồ thí nghiệm ảnh hƣởng của pH đến khả năng tổng hợp PME của nấm mốc 25 Hình 12: Sơ đồ thí nghiệm ảnh hƣởng của amonium sulfate (NH4)2SO4 bổ sung đến khả năng tổng hợp PME của nấm mốc ....................................................................................... 27 Hình 13: Ảnh hƣởng của tỉ lệ pha loãng giữa nƣớc và cơ chất đến hoạt tính PME ............ 29 Hình 14: Ảnh hƣởng của thời gian ủ đến hoạt tính PME sinh ra ........................................ 30 Hình 15: Ảnh hƣởng của pH đến khả năng tổng hợp PME của nấm mốc ........................... 32 Hình 16: Ảnh hƣởng của tỉ lệ (NH4)2SO4 bổ sung đến hoạt tính của PME ......................... 34 Luâṇ văn tốt nghiêp̣ Đaị hoc̣ khóa 31 Trường Đaị hoc̣ Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang ix DANH SÁCH BẢNG  Bảng 1: Hiệu quả xử lý nƣớc táo và nƣớc vải bằng chế phẩm enzyme pectinase ............... 10 Bảng 2: Hàm lƣợng pectin và mức độ ester hóa pectin ở một số loại trái cây .................... 12 Bảng 3: Thành phần pectin của táo và một số loại trái cây ................................................. 15 Bảng 4: Ảnh hƣởng của tỉ lệ pha loãng giữa cơ chất và nƣớc đến khả năng sinh PME ...... 28 Bảng 5: Ảnh hƣởng của thời gian ủ đến hoạt tính của PME sinh ra từ A. niger ................ 30 Bảng 6: Ảnh hƣởng của sự thay đổi pH môi trƣờng đến khả năng tổng hợp PME của A. niger ..................................................................................................................................... 32 Bảng 7: Ảnh hƣởng của tỉ lệ (NH4)2SO4 bổ sung đến khả năng tổng hợp PME của A. niger ............................................................................................................................................. 33 Luâṇ văn tốt nghiêp̣ Đaị hoc̣ khóa 31 Trường Đaị hoc̣ Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 1 CHƢƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 TỔNG QUAN Công nghệ enzyme đƣợc phát triển rất mạnh từ đầu thế kỷ XX đến nay, đem lại những thuận lợi lớn và mở ra sự phát triển mạnh mẽ hơn nữa cho ngành công nghệ thực phẩm. Enzyme pectinmethylesterase (PME) ngày càng đƣợc ứng dụng rộng rãi trong ngành sản xuất thực phẩm nhất là đối với các sản phẩm từ rau quả. Nghiên cứu dùng PME để cải thiện độ cứng của sản phẩm rau quả bằng cách kích hoạt PME nội bào hay bổ sung PME ngoại bào đã thu đƣợc nhiều kết quả khả quan. Nghiên cứu và sử dụng chế phẩm enzyme pectinase (bao gồm PME, PG, cellulase…) có những tiến bộ trong chế biến nhằm làm tăng hiệu suất thu hồi nƣớc quả, làm trong và ổn định chất lƣợng nƣớc quả (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004). Việc trích ly và ứng dụng PME vào trong quá trình chế biến thực phẩm đã đƣợc phát triển khá rộng rãi ở nhiều quốc gia, tuy nhiên khả năng sử dụng của enzyme này vẫn chƣa đƣợc quan tâm ở Việt Nam. Hiện nay không có PME thƣơng mại đƣợc sản xuất ở nƣớc ta, nhập khẩu PME từ nƣớc ngoài thƣờng có giá rất cao. Điều này gây khó khăn cho việc ứng dụng PME vào trong quá trình chế biến thực phẩm. Chính vì thế, nghiên cứu trích ly PME trong điều kiện hiện tại ở Việt Nam là việc hết sức cần thiết. Hai nguồn đối tƣợng nghiên cứu và sản xuất PME là vi sinh vật và thực vật. Ngày nay do ƣu thế về nhiều mặt nhƣ hiệu suất thu hồi cao, khả năng sản xuất trên quy mô công nghiệp và tốc độ sinh sản nhanh, vi sinh vật là nguồn thu enzyme chủ yếu. Pectinase có thể đƣợc sản xuất từ nhiều loại vi khuẩn và nấm mốc, nhƣng Aspergillus là nguồn chủ yếu (Polizeli et al., 1991). Trong đó, việc trích ly enzyme PME từ Aspergillus niger đƣợc ƣu tiên chọn lựa nhiều nhất. Aspergillus niger đƣợc sử dụng phổ biến từ nhiều thập kỷ qua trong ngành công nghệ thực phẩm và không có tác động xấu đến sức khỏe con ngƣời. Sản phẩm từ Aspergillus niger cũng đƣợc Cục Quản lý Thực phẩm và Dƣợc phẩm Hoa Kỳ (FDA) chứng nhận là sản phẩm an toàn. Ngoài ra, Aspergillus niger còn là một nấm mốc có khả năng phát triển nhanh chóng trên các cơ chất rẻ tiền và tiết ra enzyme vào trong môi trƣờng, dễ dàng thu hồi. Việc lựa chọn nguồn rau quả cho trích ly PME không chỉ quan tâm hoạt tính của enzyme này trong nguyên liệu, hiệu suất trích ly, mà còn phụ thuộc vào tính kinh tế. Táo là loại trái cây đƣợc trồng rộng rãi ở đồng bằng sông Cửu Long, và đƣợc dùng Luâṇ văn tốt nghiêp̣ Đaị hoc̣ khóa 31 Trường Đaị hoc̣ Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 2 để sản xuất nƣớc ép, đồ hộp, rƣợu táo,…Phần phụ phẩm còn lại sau khi ép là bã táo ép – đây là một nguồn giàu pectin nên có thể đƣợc dùng làm cơ chất cho quá trình sản xuất PME. Điều này giúp làm giảm giá thành sản phẩm enzyme, đồng thời là một phƣơng pháp hữu hiệu để tận dụng nguồn phụ phẩm nhƣ bã. Với những thuận lợi và sự cần thiết sản xuất enzyme pectinmethylesterase, đề tài “Nghiên cứu khả năng sinh Aspergillus niger pectinmethylesterase trên cơ chất bã táo” đƣợc thực hiện. 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Mục tiêu nghiên cứu chính của đề tài là khảo sát ảnh hƣởng của các điều kiện môi trƣờng đến khả năng sinh PME của nấm mốc Aspergillus niger. Luâṇ văn tốt nghiêp̣ Đaị hoc̣ khóa 31 Trường Đaị hoc̣ Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 3 CHƢƠNG 2 LƢƠC̣ KHẢO TÀI LIÊỤ 2.1 GIỚI THIỆU PECTIN METHYLESTERASE Pectinmethylesterase (PME) (pectin pectylhydrolase, EC 3.1.1.11) là enzyme xúc tác sự thủy phân các polymer pectin. PME thƣờng tấn công vào các nhóm estermethyl của đơn vị galacturonate nằm kề đơn vị không bị ester hóa, phân cắt các nhóm methoxyl (–OCH3) đứng cạnh các nhóm –COOH tự do, tạo thành acid pectinic hoặc acid pectic và methanol. Hiệu suất thủy phân pectin của enzyme này rất cao, có thể đạt 98%. Enzyme này còn có tên khác là pectinesterase (PE). PME cũng đƣợc ứng dụng nhiều trong quá trình chế biến thực phẩm đặc biệt là khả năng làm trong nƣớc quả. Việc kiểm soát hoạt động của enzyme này cũng có thể điều chỉnh đƣợc độ nhớt của sản phẩm (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004). 2.1.1 Đặc tính sinh lý, sinh hóa PME từ những nguồn khác nhau có những đặc trƣng không giống nhau. Nhiều loại PME khác nhau về phân tử khối, pI và hoạt tính sinh hóa đƣợc tìm thấy ở các thực vật 2 lá mầm (Bordenave et al., 1996). Thông thƣờng các enzyme PME có chung nguồn gốc có cùng khối lƣợng phân tử (MW), điểm đẳng điện (pIs) và các đặc điểm động học phản ứng. Chúng có kích thƣớc trung bình và phân tử khối vào khoảng 25 ÷ 54 kDa (Benen et al., 2003). Tuy nhiên, việc đo lƣờng hoạt tính đã chỉ ra có sự khác biệt giữa các loại PME lấy từ các bộ phận khác nhau hoặc trong giai đoạn phát triển khác nhau. Nhìn chung, PME rất nhạy cảm đối với môi trƣờng chứa ion và chịu tác động lớn bởi pH. Hầu hết PME thực vật có pH tối ƣu từ 6 ÷ 8, trong khi giá trị pH tối ƣu của PME vi sinh vật nằm trong khoảng từ 4 ÷ 9 (Bordenave, 1996). Giá trị pH tối thích cho hoạt động của enzyme PME cà chua là 8,0 trong khi đó giá trị 4,5 là phù hợp cho Aspergillus PME (Duvetter, 2006). PME thƣờng đƣợc hoạt hóa bởi các ion Ca 2+ và Mg2+. Điểm đẳng điện của PME thay đổi từ 3,1 đối với enzyme từ nấm mốc đến 11 đối với PME cà chua. Hầu hết PME chiết xuất từ thực vật có pI trung tính đến kiềm, chỉ một vài trƣờng hợp có PME có tính acid (Bordenave, 1996). Hai nguồn đƣợc dùng sản xuất PME là từ thực vật (cà chua, cam, táo, cà rốt…) và vi sinh vật (nấm mốc Aspergillus aculeatus, Aspergillus niger…). Trong vi sinh vật thì không có sự đa dạng lớn về PME ngoại trừ Erwinia chrysanthemi, một PME duy nhất đƣợc tìm thấy trong tất cả các nghiên cứu (Benen et al., 2003). Luâṇ văn tốt nghiêp̣ Đaị hoc̣ khóa 31 Trường Đaị hoc̣ Cần Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 4 2.1.2 Kiểu phản ứng Phản ứng thủy phân pectin đƣợc thực hiện ở đơn vị galacturonic chứa ester bên cạnh nhóm carboxyl tự do hoặc từ cuối chuỗi pectin (Rexova–Benkova et al., 2004). Kết quả là hình thành methanol và chất pectin có độ methoxyl thấp hơn (pectinic acid hoặc pectic acid). Điều này dẫn đến sự thay đổi thuộc tính tạo keo của pectin nên làm tăng độ nhớt của rau quả và làm giảm pH. Phối hợp với các enzyme pectinase khác, PME có trách nhiệm trong việc điều khiển sự thoái hóa của pectin và sự mềm đi của mô thực vật trong quá trình chín và là enzyme đầu tiên tác dụng lên pectin trên vách tế bào. Động học phản ứng của