Luận văn Nghiên cứu khả năng ứng dụng biện pháp kiểm tra kháng sinh đồ trực tiếp từ cơ quan bệnh phẩm mủ gan trên cá tra

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN TRẦN THỊ ĐAN THANH NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG BIỆN PHÁP KIỂM TRA KHÁNG SINH ĐỒ TRỰC TIẾP TỪ CƠ QUAN BỆNH PHẨM MỦ GAN TRÊN CÁ TRA LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN TRẦN THỊ ĐAN THANH NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG BIỆN PHÁP KIỂM TRA KHÁNG SINH ĐỒ TRỰC TIẾP TỪ CƠ QUAN BỆNH PHẨM MỦ GAN TRÊN CÁ TRA LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Ts. ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH ĐẶNG THỤY MAI THY 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version i LỜI CẢM TẠ Trong những năm tháng trên giảng đường đại học những kiến thức được tích lũy là hành trang quý báu cho tôi trên con đường phát triển nghề nghiệp tương lai. Vì thế thực hiện luận văn tốt nghiệp chính là sự lựa chọn tốt nhất để tổng hợp kiến thức trong những năm học của rất nhiều sinh viên trong đó có cá nhân tôi. Tuy nhiên để có thể hoàn thành luận văn ngoài phấn đấu bản thân còn được sự ủng hộ từ gia đình và sự tận tâm hướng dẫn của quý thầy cô. Do vậy đầu tiên tôi muốn gửi những lời biết ơn sâu sắc nhất đến gia đình đã luôn động viên tôi trong suốt thời gian qua. Tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô khoa Thủy sản trường Đại học Cần Thơ đã truyền đạt những kiến thức quý báu trong khoảng thời gian học tập. Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Đặng Thị Hoàng Oanh và cô Đặng Thụy Mai Thy đã tận tình hướng dẫn trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài. Xin chân thành cảm ơn cô Bùi Thị Bích Hằng, cô Trần Thị Tuyết Hoa đã quan tâm và động viên trong những thời gian qua. Xin gửi lời cảm ơn đến tập thể lớp Bệnh học thủy sản K31 đã giúp đỡ tôi trong thời gian học tập tại trường. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version ii TÓM TẮT Sau khi được phục hồi từ nguồn vi khuẩn trong bộ sưu tập 10 chủng 3B3, E3, E8, CAF260, T8, A1, CAF255, STL303, CAF258, E223 được kiểm tra kháng sinh đồ trên 2 loại kháng sinh ampicillin và chloramphenicol. Đồng thời vi khuẩn cũng được dùng cho thí nghiệm MTT. Kết quả thu được ở cả phương pháp kháng sinh đồ và MTT đều cho thấy tất cả các chủng vi khuẩn nhạy với 2 kháng sinh ngoại trừ chủng CAF258, E223 kháng ampicillin và chủng T8 kháng chloramphenicol. Đề tài cũng tiến hành nghiên cứu thí nghiệm MTT trên mô thận tươi. Kết quả thu được cho thấy sau khi sử dụng chloramphenicol mật độ tế bào tồn tại giảm từ 1-10% so với sử dụng ampicillin. Bên cạnh đó thực hiện thí nghiệm MTT trên mô đã giảm được thời gian (còn 1,5 ngày) và hạ giá thành từ 7-8 lần so với phương pháp kháng sinh đồ. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version iii MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ .................................................................................................. i TÓM TẮT ........................................................................................................ ii MỤC LỤC ....................................................................................................... iii DANH SÁCH BẢNG ...................................................................................... iv DANH SÁCH HÌNH ....................................................................................... v Chương I: GIỚI THIỆU .................................................................................. 1 Chuơng II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ........................................................... 2 2.1 Tình hình bệnh mủ gan trên cá tra ......................................................... 2 2.2 Bệnh mủ gan .......................................................................................... 2 2.2.1 Tác nhân gây bệnh ................................................................................. 2 2.2.2 Đường lây truyền ................................................................................... 3 2.2.3 Dấu hiệu bệnh lý .................................................................................... 3 2.3 Thuốc kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản ......................................... 3 2.3.1 Định nghĩa ............................................................................................. 4 2.3.2 Nguyên tắc phối hợp kháng sinh trong điều trị ..................................... 4 2.3.3 Tình hình sử dụng thuốc kháng sinh ..................................................... 5 2.3.4 Cơ chế của sự kháng thuốc .................................................................... 7 2.3.5 Những nghiên cứu về kháng sinh trên E.ictaluri................................... 7 2.4 Thí nghiệm MTT ................................................................................... 8 2.4.1 Định nghĩa ............................................................................................. 8 2.4.2 Những điểm đặc trưng của thí nghiệm MTT ......................................... 10 2.4.3 Các nghiên cứu về thí nghiệm MTT ...................................................... 10 CHƯƠNG III: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................................... 13 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu .......................................................... 13 3.2 Nội dung nghiên cứu .............................................................................. 13 3.3 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu................................................................ 14 3.3.1 Đối tượng thí nghiệm............................................................................. 14 3.3.2 Vật liệu .................................................................................................. 14 3.3.3 Thiết bị ................................................................................................... 14 3.3.4 Hóa chất ................................................................................................. 15 3.4 Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 15 3.4.1 Chuẩn bị vi khuẩn Edwardsiella ictaluri............................................... 15 3.4.2 Kháng sinh đồ ........................................................................................ 16 3.4.3 Thí nghiệm MTT ................................................................................... 17 3.4.4 Xử lý số liệu .......................................................................................... 21 CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................ 22 4.1 Kết quả thí nghiệm trên vi khuẩn .......................................................... 22 4.1.1 Kết quả kháng sinh đồ ........................................................................... 22 4.1.2 Kết quả thí nghiệm MTT trên vi khuẩn ................................................. 24 4.1.3 So sánh số lượng vi khuẩn tồn tại sau sử dụng kháng sinh giữa phương pháp kháng sinh đồ và thí nghiệm MTT ......................................................... 29 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version iv 4.1.4 So sánh thời gian xác định tính nhạy của kháng sinh giữa thí nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh đồ .............................................................. 33 4.2 Kết quả thí nghiệm trên mô tươi .......................................................... 34 4.2.1 Sự sai khác giữa mô bệnh và mô bệnh sử dụng kháng sinh .................. 34 CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ..................................................... 41 5.1 Kết luận .................................................................................................. 41 5.1.1 Sự mẫn cảm của kháng sinh trên vi khuẩn theo kháng sinh đồ ............. 41 5.1.2 Sự mẫn cảm của kháng sinh trên vi khuẩn theo thí nghiệm MTT ........ 41 5.1.3 Sự mẫn cảm của kháng sinh trên mô theo thí nghiệm MTT ................. 41 5.2 Đề xuất ................................................................................................... 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 42 PHỤ LỤC ........................................................................................................ 46 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version v DANH SÁCH BẢNG Bảng 3.1: Nguồn gốc các chủng vi khuẩn sử dụng cho đề tài......................... 15 Bảng 3.2: Đường kính vòng tròn vô trùng một số thuốc kháng sinh .............. 16 Bảng 3.3: Sơ đồ bố trí mẫu vi khuẩn vào 7 hàng đầu của đĩa 96 giếng .......... 17 Bảng 3.4: Sơ đồ bố trí mẫu mô vào đĩa 96 giếng ............................................ 20 Bảng 4.1: Đường kính trung bình vòng vô trùng của 10 chủng vi khuẩn ....... 22 Bảng 4.2: Số lượng vi khuẩn tồn tại sau sử dụng kháng sinh qua phương pháp kháng sinh đồ ................................................................................................... 23 Bảng 4.3: Sự sai khác của vi khuẩn và vi khuẩn sử dụng kháng sinh qua thí nghiệm MTT .................................................................................................... 26 Bảng 4.4: Số lượng vi khuẩn tồn tại sau sử dụng kháng sinh trong thí nghiệm MTT trên vi khuẩn ........................................................................................... 27 Bảng 4.5: Sự sai khác giữa mô bệnh và mô bệnh sử dụng kháng sinh qua thí nghiệm MTT .................................................................................................... 36 Bảng 4.6: Số lượng tế bào tồn tại sau sử dụng kháng sinh trong thí nghiệm MTT trên mô ................................................................................................... 37 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version vi DANH SÁCH HÌNH Hình 4.1: Mẫu vi khuẩn & MTT ..................................................................... 25 Hình 4.2: Mẫu vi khuẩn & MTT sau khi ủ 4 giờ ........................................... 25 Hình 4.3: So sánh số lượng vi khuẩn ở mật độ 108 cfu/ml còn tồn tại sau khi sử dụng Ampicillin giữa thí nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh đồ ......... 29 Hình 4.4: So sánh số lượng vi khuẩn ở mật độ 108 cfu/ml còn tồn tại sau khi sử dụng Chloramphenicol giữa thí nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh đồ ......................................................................................................................... 29 Hình 4.5: So sánh số lượng vi khuẩn ở mật độ 107 cfu/ml còn tồn tại sau khi sử dụng Ampicillin giữa thí nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh đồ ......... 30 Hình 4.6: So sánh số lượng vi khuẩn ở mật độ 107 cfu/ml còn tồn tại sau khi sử dụng Chloramphenicol giữa thí nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh đồ ......................................................................................................................... 30 Hình 4.7: So sánh số lượng vi khuẩn ở mật độ 106 cfu/ml còn tồn tại sau khi sử dụng Ampicillin giữa thí nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh đồ ......... 31 Hình 4.8: So sánh số lượng vi khuẩn ở mật độ 106 cfu/ml còn tồn tại sau khi sử dụng Chloramphenicol giữa thí nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh đồ ..................................................................................................................... 31 Hình 4.9: So sánh số lượng vi khuẩn ở mật độ 105 cfu/ml còn tồn tại sau khi sử dụng Ampicillin giữa thí nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh đồ ......... 32 Hình 4.10: So sánh số lượng vi khuẩn ở mật độ 105 cfu/ml còn tồn tại sau khi sử dụng Chloramphenicol giữa thí nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh đồ ......................................................................................................................... 32 Hình 4.11: Thời gian xác định tính nhạy cảm kháng sinh trên vi khuẩn giữa thí nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh đồ ................................................. 33 Hình 4.12: Mẫu mô &MTT ............................................................................. 35 Hình 4.13: Mẫu mô & MTT sau khi ủ 4 giờ ................................................... 35 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version vii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ĐBSCL Đồng Bằng Sông Cửu Long. Nafiquaved Cục Quản lý chất lượng, An toàn vệ sinh và Thú y thủy sản. MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide). NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards. ATCC American Type Culture Collection E.ictaluri Edwardsiella ictaluri. MIC Minimum Inhibitory Concentration. MBC Minimum Bactericidal Concentration. IC50 The half maximal inhibitory concentration. AM Ampicillin. CH Chloramphenicol. CK Cá khỏe. CB Cá bệnh. KS Kháng sinh PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 1 CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU Trong quá trình hội nhập WTO và đồng thời chịu ảnh hưởng do tình hình kinh tế khó khăn chung của thế giới nhưng xuất khẩu thủy sản Việt Nam vẫn có những bước đi vững chắc và ổn định. Tháng 7-2008, các doanh nghiệp chế biến xuất được trên 136.000 tấn thủy sản các loại, đạt kim ngạch gần 476 triệu USD. Đây là tháng có mức tăng trưởng cao nhất trong 3 năm qua về sản lượng lẫn giá trị, tạo đà cho xuất khẩu thủy sản về đích (www.atpvietnam.com, 18.11.2008). Theo Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu thủy sản Việt Nam (VASEP), 7 tháng đầu năm 2008 xuất khẩu thủy sản cả nước đạt khoảng 2,388 tỷ USD, tăng 20% so cùng kỳ năm ngoái, trong đó, sản phẩm cá tra- ba sa chiếm 31,9%. Riêng tháng 7- 2008, kim ngạch xuất khẩu cá tra, ba sa vào Nga tăng đến 64 lần so với tháng 7-2007. Song song với sự phát triển của nghề nuôi thì vấn đề dịch bệnh ngày càng trở nên trầm trọng, trong đó tỉ lệ xuất hiện bệnh mủ gan trên cá tra khá cao khoảng 61% (Trần Anh Dũng, 2005) và có xu hướng ngày càng tăng. Thiệt hại do bệnh rất lớn, tỷ lệ cá chết có thể lên đến 90% trên cá tra giống và 50% trên cá nuôi thương phẩm (Nguyễn Hữu Thịnh, 2007) Khi bệnh xảy ra, người dân thường sử dụng sản phẩm thuốc thú y- thủy sản chứa kháng sinh hoặc kháng sinh nguyên liệu để điều trị cho cá. Việc sử dụng kháng sinh bừa bãi, không đúng liều lượng, đôi khi sử dụng với liều lượng thấp để phòng bệnh dẫn đến dịch bệnh ngày càng diễn biến phức tạp, khó điều trị hơn, tỷ lệ sống của cá ngày càng thấp (Nguyễn Chính, 2005). Một phương pháp được sử dụng khá phổ biến hiện nay để xác định các loại kháng sinh và liều lượng thích hợp trong việc điều trị bệnh mủ gan trên cá tra là phương pháp lập kháng sinh đồ. Tuy nhiên phương pháp lập kháng sinh đồ truyền thống đòi hỏi nhiều thời gian để phân lập, nuôi cấy. Vì vậy đề tài “Nghiên cứu khả năng ứng dụng biện pháp kiểm tra kháng sinh đồ trực tiếp từ cơ quan bệnh phẩm mủ gan trên cá tra” nhằm đánh giá độ tin cậy của biện pháp kiểm tra kháng sinh đồ trực tiếp từ cơ quan bệnh phẩm mủ gan trên cá tra. Nhờ vào đó đề xuất việc sử dụng thuốc kháng sinh phù hợp, góp phần tăng năng suất và sản lượng, hướng đến nghề nuôi cá tra thâm canh bền vững. Nội dung: Dùng MTT để ước lượng mật độ vi khuẩn có trong dịch mô bệnh phẩm và dịch huyền phù từ khuẩn lạc. Kiểm tra tính nhạy của vi khuẩn trong 2 biện pháp trên với một số loại kháng sinh . PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 2 CHƯƠNG II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tình hình bệnh mủ gan trên cá tra Phong trào nuôi cá tra tại Việt Nam ngày càng được nhân rộng để phục vụ cho nhu cầu tiêu thụ trong nước và đặc biệt là xuất khẩu. Từ năm 1996-2006, diện tích nuôi cá tra, basa tăng gấp 7 lần; sản lượng tăng 36,2 lần. Tổng diện tích nuôi cá tra, cá ba sa trong toàn khu vực ĐBSCL hiện đã lên đến 5.000 ha. Năm 2001 tổng sản lượng cá tra, cá ba sa của toàn vùng mới chỉ được 110.000 tấn thì đến năm 2006 là 825.000 tấn và dự báo năm 2007 sẽ vượt quá 1 triệu tấn, bằng sản lượng quy hoạch cho đến năm 2010. Tại TP Cần Thơ, theo dự báo năm 2007 sẽ tăng thêm khoảng 10% sản lượng sản phẩm cá tra xuất khẩu (nguồn:www.nafiqaved.gov.vn,14/11/2008). Hiện nay, cá tra đã được xuất khẩu sang 80 quốc gia và vùng lãnh thổ. Để có sản lượng cao cung cấp cho xuất khẩu, bên cạnh tăng diện tích nuôi trồng thì còn nuôi thâm canh ở mật độ cao làm xuất hiện nhiều loại bệnh như đốm trắng nội tạng do Edwardsiella ictaluri, đốm đỏ do Pseudomonas , bệnh nhiễm huyết do Edwardsiella tarda, một số bệnh do nấm, ký sinh trùng gây ra. Theo Lý Thị Thanh Loan (2008) ở các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long tỉ lệ mủ gan là cao nhất so với các loại bệnh khác: 52,8%. Tại An Giang bệnh chiếm tỉ lệ cao nhất đạt 66,7%, kế đến là Cần Thơ: 54,89%; Vĩnh Long 53,8%; Đồng Tháp 36% (www.agriviet.com, 14/11/2008). Cao điểm dịch bệnh thường xảy ra từ tháng 9 đến tháng 12 hằng năm vào thời kỳ thời tiết chuyển mát (Nguyễn Hữu Thịnh và ctv, 2007); đặc biệt bệnh xuất hiện không phụ thuộc vào mùa vụ thả giống hay lứa tuổi cá. Theo Crumlish và ctv (2004) qua phân lập từ 181 mẫu cá tra bệnh thu được 108 dòng vi khuẩn gây bệnh mủ gan (Edwardsiella ictaluri). Càng nghiêm trọng hơn theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Hữu Thịnh và ctv (2007) trong 55 mẫu cá tra bệnh phân lập được 97 chủng vi khuẩn thì đã có 47 chủng vi khuẩn gây bệnh mủ gan. 2.2 Bênh mủ gan 2.2.1 Tác nhân gây bệnh Fugerson và ctv (2001) đã có công trình nghiên cứu đầu tiên mô tả về bệnh mủ gan trên cá tra nuôi xuất hiện đầu tiên vào cuối năm 1998 ở đồng bằng sông Cửu Long, Việt Nam. Nguyên nhân gây bệnh được xác định do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri (Crumlish và ctv, 2002). Vi khuẩn E. ictaluri lần đầu tiên được phân lập và định danh vào năm 1976 (Hawke, 1979 được trích dẫn bởi Valerie, 1993) thuộc họ Enterbacteriaceae là vi khuẩn gram âm, hình que, kích thước 1 x 2- 3μm, không sinh bào tử, phản PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 3 ứng catalase dương tính, oxidase âm tính, không oxy hoá, lên men trong môi trường glucose. Vi khuẩn E.ictaluri cho hầu hết các phản ứng âm tính chỉ có 2 phản ứng dương tính là Lysine và Glucose (Crumlish & ctv, 2004). Edwardsiella ictaluri phát triển chậm trên môi trường BHI, cần 36-48 giờ để hình thành các khuẩn lạc ở 28-30oC và kém phát triển hay hoàn toàn không ở 37oC (Valerie và ctv, 1993). Có 1 - 3 plasmid liên kết với E. ictaluri (Speyerer và Boyle, 1987; Newton và ctv, 1988 được trích dẫn bởi Valerie, 1993). Chức năng của những plasmid vẫn chưa được xác định rõ nhưng có thể chúng đóng vai trò quan trọng trong việc đề kháng với kháng sinh (Valerie và ctv, 1993). 2.2.2 Đường lây truyền Bệnh thường xảy ra nhiều vào mùa mưa lũ kéo dài đến mùa khô. Edwardsella ictaluri có thể nhiễm cho cá bằng hai đường khác nhau. Vi khuẩn trong nước có thể qua đường mũi của cá xâm nhập vào cơ quan khứu giác và di chuyển vào dây thần kinh khứu giác, sau đó vào não, bệnh lan rộng từ màng não đến sọ và da (Shotts và ctv, 1986). E. ictaluri cũng có thể xâm nhiễm qua đường tiêu hoá qua niêm mạc ruột vào máu gây nhiễm trùng máu. Bằng đường này thì vi khuẩn vào mao mạch trong biểu bì gây hoại tử và mất sắc tố của da. Cá còn nhiễm E. ictaluri qua đường miệng gây nhiễm khuẩn ruột (Shott và ctv, 1986). 2.2.3 Dấu hiệu bệnh lý Cá bệnh do nhiễm vi khuẩn E. ictaluri thường thể hiện kém ăn hoặc bỏ ăn, gầy yếu , bụng thường chướng to, xung quanh miệng có các đám xuất huyết, gốc vây xuất huyết, mắt lồi. Giải phẫu bên trong, một số cơ quan nội tạng như gan, lá lách, thận bị hoại tử tạo thành những đốm màu trắng đục đường kính 0,5- 2,5mm (Đỗ Thị Hòa và ctv, 2004). 2.3 Thuốc kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản Khi bệnh xảy ra trong ao, nông dân thường sử dụng các sản phẩm thuốc thú y- thủy sản chứa kháng sinh hoặc kháng sinh nguyên liệu để điều trị cho cá. Tuy nhiên theo Nguyễn Hữu Thịnh và ctv (2007) việc sử dụng kháng sinh còn tùy tiện, không đúng về liều lượng và