Luận văn Nghiên cứu nhân nhanh in vitro cây tràm ta (melaleuca cajuputi powell)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH Nguyễn Đăng Thùy NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH IN VITRO CÂY TRÀM TA (Melaleuca cajuputi Powell) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh - 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH Nguyễn Đăng Thùy NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH IN VITRO CÂY TRÀM TA (Melaleuca cajuputi Powell) Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. VƯƠNG ĐÌNH TUẤN Thành phố Hồ Chí Minh - 2014 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan luận văn này là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Kết quả tŕnh bày trong lu ận văn là trung thực và chưa được các tác giả công bố trong bất kì công trình nào. Các trích dẫn về bảng biểu, kết quả nghiên cứu của những tác giả khác; tài liệu tham khảo trong luận văn/ luận án đều có nguồn gốc rõ ràng và theo đúng quy định. Tác giả. LỜI CẢM ƠN Xin trân trọng cảm ơn TS. Vương Đình Tuấn đã tận tình hướng dẫn tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thiện luận văn này. Xin chân thành cảm ơn anh Nguyễn Xuân Cường và các anh chị ở viện Khoa học Lâm nghiệp Nam Bộ đã giúp đỡ, hỗ trợ và tạo điều kiện tốt nhất để tôi có thể học tập và thực hiện đề tài này. Xin cảm ơn các thầy cô ở trường Đại học Sư phạm và các bạn lớp Sinh học thực nghiệm - K23 đã giảng dạy, hỗ trợ và động viên tôi trong thời gian học tập tại trường. TP. Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2014 TÁC GIẢ LUẬN VĂN Nguyễn Đăng Thùy MỤC LỤC Trang Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục Danh mục các chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình MỞ ĐẦU ... ............................................................................................................... 1 I. Lí do chọn đề tài ....................................................................................... 1 II. Mục tiêu nghiên cứu .................................................................................. 2 III. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận văn ............................................ 2 Chương 1. TỔNG QUAN ......................................................................................... 3 1.1. Giới thiệu về cây Tràm ta ........................................................................ 3 1.1.1. Đặc điểm sinh học của cây Tràm ta ................................................. 3 1.1.1.1. Phân loại .................................................................................... 3 1.1.1.2. Đặc điểm hình thái ..................................................................... 3 1.1.1.3. Phân bố và đặc điểm sinh thái ................................................... 5 1.1.2. Giá trị sử dụng .................................................................................. 5 1.1.2.1. Bảo vệ môi trường sinh thái ...................................................... 5 1.1.2.2. Cung cấp gỗ cho xây dựng và một số ngành công nhiệp .......... 6 1.1.2.3. Sản phẩm ngoài gỗ..................................................................... 6 1.1.3. Tình hình trồng và khai thác gỗ cũng như các sản phẩm ngoài gỗ của cây Tràm ta ............................................................................... 8 1.2. Nuôi cấy mô tế bào thực vật và ứng dụng .............................................. 9 1.2.1. Sự phát sinh cơ quan trong nuôi cấy in vitro ................................... 9 1.2.1.1. Sự phát sinh chồi bất định ......................................................... 9 1.2.1.2. Sự phát sinh rễ bất định ........................................................... 10 1.2.1.3. Sự phát sinh mô sẹo ................................................................. 11 1.2.2. Vai trò của chất ĐHST thực vật trong phát sinh cơ quan .............. 11 1.2.2.1. Auxin ....................................................................................... 12 1.2.2.2. Cytokinin ................................................................................. 13 1.2.2.3. Gibberelin ................................................................................ 14 1.3. Tình hình nghiên cứu vi nhân giống cây Tràm ta trong nước và trên thế giới ................................................................................................. 14 1.3.1. Tình hình nghiên cứu vi nhân giống cây tràm ta trên thế giới ....... 14 1.3.2. Tình hình nghiên cứu vi nhân giống cây tràm ta trong nước ......... 15 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................. 16 2.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài .................................................. 16 2.2. Vật liệu .................................................................................................. 16 2.2.1. Vật liệu ban đầu .............................................................................. 16 2.2.2. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm ..................................................... 16 2.3. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 16 2.3.1. Khử trùng bề mặt mẫu cấy ............................................................. 16 2.3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp auxin và cytokinin, thành phần môi trường nuôi cấy lên khả năng tạo sẹo từ cây mầm ....... 17 2.3.2.1. Ảnh hưởng của sự kết hợp hoặc riêng lẻ giữa NAA và TDZ lên khả năng tạo sẹo từ cây mầm ............................................ 17 2.3.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy lên khả năng tạo sẹo từ cây mầm ............................................ 18 2.3.2.3. Ảnh hưởng của sự kết hợp giữa NAA và BA lên khả năng tạo sẹo ...................................................................................... 18 2.3.3. Nghiên cứu khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo ................................ 19 2.3.4. Nghiên cứu nhân nhanh tạo cụm chồi từ chồi phát sinh từ mô sẹo. ................................................................................................ 19 2.3.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất ĐHST thực vật lên khả năng kéo dài chồi Tràm ta. .................................................................... 19 2.3.6. Nghiên cứu ảnh hưởng của các auxin khác nhau ở nồng độ khác nhau lên khả năng ra rễ in vitro của cây Tràm ta.......................... 20 2.3.7. Nghiên cứu khả năng thích nghi của cây Tràm ta in vitro trong điều kiện vườn ươm. ..................................................................... 20 2.4. Xử lý thống kê ...................................................................................... 21 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................. 22 3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp auxin và cytokinin, thành phần môi trường nuôi cấy lên khả năng tạo sẹo từ cây mầm .............. 22 3.1.1. Ảnh hưởng của sự kết hợp auxin và cytokinin lên khả năng tạo sẹo từ cây mầm ............................................................................. 22 3.1.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy lên khả năng tạo sẹo từ cây mầm ........................................................ 27 3.1.3. Ảnh hưởng của sự kết hợp NAA và BA lên khả năng tạo sẹo từ cây mầm ........................................................................................ 28 3.2. Nghiên cứu khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo ....................................... 30 3.3. Nghiên cứu nhân nhanh tạo cụm chồi từ chồi phát sinh từ mô sẹo ...... 33 3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất ĐHST thực vật lên khả năng kéo dài chồi .......................................................................................... 36 3.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của auxin ở các nồng độ khác nhau lên khả năng ra rễ in vitro của cây Tràm ta ...................................................... 38 3.6. Nghiên cứu khả năng thích nghi của cây Tràm ta in vitro trong điều kiện vườn ươm ..................................................................................... 41 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................................... 43 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ .................................... 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 45 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Chú giải 1/2MS Thành phần môi trường MS giảm một nửa đa lượng và vi lượng. 2,4-D 2,4- Dichlorophenoxyacetic Acid BA N6 - Benzyladenine ĐHST Điều hòa sinh trưởng GA3 Gibberellic Acid IAA Indol - 3 - Acetic Acid IBA Indole - 3 - Butyric Acid MS Thành phần môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) NAA Naphthaleneacetic Acid TDZ Thidiazuron DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1.Thành phần môi trường nuôi cấy trong thí nghiệm ............................................ 17 Bảng 2.2. Ảnh hưởng của sự kết hợp hay riêng lẻ giữa NAA và TDZ lên khả năng tạo sẹo ...................................................................................................................... 18 Bảng 2.3. Ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy trong cảm ứng tạo mô sẹo .... 18 Bảng 2.4. Ảnh hưởng của BA và NAA lên khả năng tạo sẹo ............................................ 19 Bảng 2.5. Ảnh hưởng của chất ĐHST lên khả năng kéo dài chồi ...................................... 20 Bảng 3.1. Ảnh hưởng của sự kết hợp NAA và TDZ trong cảm ứng tạo mô sẹo ............... 22 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của sự kết hợp NAA và BA trong cảm ứng tạo mô sẹo ................. 29 Bảng 3.3. Phát sinh cơ quan chồi từ mô sẹo sau 2 tháng nuôi cấy ..................................... 31 Bảng 3.4. Số chồi và chiều cao chồi sau 2 tháng trên môi trường nhân chồi .................... 34 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của chất ĐHST thực vật lên khả năng kéo dài chồi ........................ 36 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng thực vật lên khả năng tạo rễ của chồi Tràm ta sau 3 tuần nuôi cấy ....................................................................... 40 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Cây Tràm ta Melaleuca cajuputi Powell ............................................................ 4 Hình 3.1. Cảm ứng tạo mô sẹo từ cây mầm Tràm ta ở nồng độ TDZ 0 mg/l + NAA từ 0 đến 3 mg/l sau 3 tháng nuôi cấy ..................................................................... 23 Hình 3.2. Cảm ứng tạo mô sẹo từ cây mầm Tràm ta với TDZ từ 0,5 đến 5 mg/l sau 3 tháng nuôi cấy ................................................................................................... 24 Hình 3.3. Cảm ứng tạo mô sẹo từ cây mầm Tràm ta ở NAA 0 đến 2 mg/l kết hợp với TDZ 1 đến 1,5 mg/l sau 3 tháng ....................................................................... 25 Hình 3.4. Cảm ứng tạo mô sẹo từ cây mầm Tràm ta ở nồng độ NAA 3 mg/l kết hợp với TDZ từ 1,5 đến 5 mg/l sau 3 tháng ................................................................... 26 Hình 3.5. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên khả năng tạo sẹo ................................ 27 Hình 3.6. Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến khả năng tạo sẹo từ mầm sau 3 tháng với NAA 2 + TDZ 1,5 mg/l ..................................................................... 28 Hình 3.7. Ảnh hưởng của NAA kết hợp với BA trong cảm ứng tạo sẹo ........................... 29 Hình 3.8. Ảnh hưởng của NAA và 2,4-D 0,05 mg/l lên khả năng cảm ứng tạo chồi từ mô sẹo sau 2 tháng nuôi cấy .............................................................................. 31 Hình 3.9. Ảnh hưởng của TDZ từ 0 đến 0,1 mg/l lên khả năng cảm ứng tạo chồi từ mô sẹo sau 2 tháng nuôi cấy .................................................................................... 32 Hình 3.10. Kéo dài chồi phát sinh từ cụm mô sẹo trên môi trường 1/2MS sau 3 tháng nuôi cấy .............................................................................................................. 33 Hình 3.11. Cụm chồi từ đoạn thân chồi sau 2 tháng trên từng nghiệm thức ...................... 33 Hình 3.12. Cảm ứng tạo chồi trên môi trường 1/2MS + 0.5 mg/l BA sau 2 tháng ............ 35 Hình 3.13. Cảm ứng tạo chồi từ thân chồi của cây Tràm ta sau 2 tháng............................ 35 Hình 3.14. Ảnh hưởng của chất ĐHST thực vật lên khả năng kéo dài chồi ...................... 37 Hình 3.15. Cụm chồi ở thí nghiệm 3 khi chuyển sang môi trường 1/2MS để kéo dài sau 2 tháng nuôi cấy ................................................................................................. 38 Hình 3.16. Ảnh hưởng của IBA lên khả năng ra rễ của chồi Tràm ta sau 4 tuần .............. 39 Hình 3.17. Ảnh hưởng của NAA lên khả năng ra rễ của Tràm ta sau 4 tuần.................... 39 Hình 3.18. Cây Tràm ta sau 2 tuần cấy ra bầu đất trong điều kiện vườn ươm .................. 41 Hình 3.19. Cây Tràm ta sau 3 tuần cấy ra bầu đất trong điều kiện vườn ươm .................. 41 Hình 3.20. Sự tăng trưởng của Tràm ta sau 1, 2, 3, 4, 5, 6 tuần trong điều kiện vườn ươm .................................................................................................................... 42 1 MỞ ĐẦU I. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI Cây Tràm ta (Melaleuca cajuputi Powell) là cây bản địa có khả năng thích nghi tốt ở những vùng đất ngập nước, nghèo chất dinh dưỡng với độ phèn cao như ở các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long. Do đó, bên cạnh chức năng phòng hộ, hạn chế xói mòn và điều hòa khí hậu như các loại rừng khác, rừng Tràm có vai trò đặc biệt quan trọng trong việc điều hòa mực nước, cải tạo đất, ngăn cản quá trình sinh phèn của đất (Nguyễn Quang Trung, 2008). Ngoài vai trò to lớn về mặt sinh thái, cây Tràm còn là cây đa tác dụng. Gỗ Tràm được sử dụng làm “cừ” (một loại cọc gia cố nền móng trong các công trình xây dựng) và là nguồn nguyên liệu tiềm năng đối với ngành công nghiệp chế biến gỗ như gỗ xẻ (xẻ nan, ván ghép thanh, ghép khối); băm dăm (làm ván dăm, ván MDF) ở vùng đồng bằng sông Cửu Long (Bùi Duy Ngọc, 2009). Tinh dầu Tràm được dùng để chữa trị bệnh ho và cảm lạnh, chống co thắt dạ dày, đau bụng và hen suyễn. Người ta còn dùng xoa bên ngoài cơ thể chống đau thần kinh và đau khớp, chống côn trùng và hữu ích trong việc tẩy giun (Nguyễn Việt Cường và cộng sự, 2007). Dầu Tràm còn được dùng làm hương liệu trong sản xuất xà phòng, mỹ phẩm, chất tẩy, nước hoa (Sellar, 1992; Lawless, 1995). Với những đặc điểm sinh thái và có giá trị kinh tế như trên cây Tràm được xếp vào danh mục các loài cây bản địa được ưu tiên cho trồng rừng sản xuất, trồng rừng phòng hộ chắn sóng, bảo vệ môi trường ngập nước (Nguyễn Ngọc Bình, 2004). Song do gỗ Tràm có đường kính nhỏ, độ co rút, độ cong rất lớn, tỷ lệ vỏ cao, hàm lượng tinh dầu trong lá Tràm còn thấp nên giá trị kinh tế của cây Tràm chưa cao (Bùi Duy Ngọc, 2009). Nhằm làm tăng năng suất, chất lượng của gỗ và các sản phẩm ngoài gỗ cũng như góp phần bảo vệ rừng tự nhiên hiện có và cải thiện môi trường sinh thái của các loài cây bản địa, công tác trồng rừng quan tâm đến việc kết hợp của 3 yếu tố đó là cải thiện giống, lựa chọn khu vực sinh thái phù hợp và áp dụng đầy đủ các biện pháp kỹ thuật thâm canh phù hợp. Trong đó, vấn đề cải thiện giống có thể chiếm đến 50 - 2 60% năng suất rừng trồng (Davidson, 1996). Việc nghiên cứu về sinh thái và vận dụng các biện pháp kỹ thuật thâm canh trên đối tượng cây Tràm đã được tiến hành và thu được nhiều kết quả tốt nhưng vẫn chưa đáp ứng được nhu cầu về giống có năng suất cao, chất lượng gỗ tốt Với trình độ phát triển của khoa học kỹ thuật hiện nay, thế giới và trong nước đã có không ít nghiên cứu thành công trong cải thiện giống cây lâm nghiệp trên nhiều đối tượng khác nhau bằng kỹ thuật chuyển gene hay gây đa bội hóa Để phát triển được quy trình cải tạo giống bằng các phương pháp đó, khâu quan trọng đầu tiên là phải xây dựng được hệ thống tái sinh cây hoàn chỉnh từ những tế bào đơn lẻ (Castellanos - Hernández, 2011). Do đó, đề tài “Nghiên cứu nhân nhanh in vitro cây Tràm ta (Melaleuca cajuputi Powell)” được thực hiện để tạo cơ sở tiền đề cho quy trình cải tạo giống cây Tràm. II. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Tìm được chất điều hòa sinh trưởng (ĐHST) thực vật, nồng độ và sự phối hợp các chất ĐHST để tái sinh cây Tràm ta từ mô sẹo trong điều kiện in vitro. III. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA LUẬN VĂN Đây là nghiên cứu tái sinh in vitro thông qua mô sẹo trên đối tượng cây Tràm ta (Melaleuca cajuputi Powell). Quá trình chuyển gene và gây đa bội hóa ở thực vật là một quá trình phức tạp trong đó đoạn gene sẽ được chèn vào bộ gene của tế bào nhận. Quá trình tái sinh cây sau khi chuyển gene hay gây đa bội hóa thường là biệt hóa mô sẹo (organogenesis) hay từ quá trình phát sinh phôi soma (somatic embryogenesis). Do đó, mục tiêu của đề tài này đặt ra là tìm ra các chất ĐHST thực vật, nồng độ và sự phối hợp thích hợp các chất ĐHST để tái sinh in vitro cây Tràm ta thông qua mô sẹo có nguồn gốc từ cây mầm. Đề tài này không chỉ phục vụ cho công tác nhân giống thông thường mà còn là bước đầu tiên và được xem là khâu quan trọng nhất trong việc nghiên cứu ứng dụng phương pháp chuyển gene hay gây đa bội hóa trong cải thiện giống trên đối tượng là cây Tràm ta. 3 Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÂY TRÀM TA 1.1.1. Đặc điểm sinh học của cây Tràm ta 1.1.1.1. Phân loại Tràm là tên gọi chung cho các loài trong chi thực vật Melaleuca thuộc họ Sim (Myrtaceae) với hơn 250 loài (Brophy và Doran, 1996). Trong đó, có khoảng 220 loài được tìm thấy ở Úc và Tasmania (Southwell và Lowe, 1999), một số ít tìm thấy ở các nước như Indonesia, Guinea, New Caledonia, Malaysia, Thái Lan và Việt Nam. Vị trí phân loại: Giới: Plantae – Thực vật Ngành: Angiospermae – Thực vật hiển hoa Lớp: Eudicots – Song tử diệp Bộ: Myrtales Họ: Myrtaceae – Họ Sim Chi: Melaleuca Loài: Melaleuca cajuputi Powell Ở một số nước như Malaysia, Thái Lan, Indonesia cây Tràm ta được gọi bằng “gelam”, “kayu putih”, “samet” hay “met”. Tên tiếng Anh được biết đến ở một số nơi khác như “swamp tea-tree”, “paperback tea-tree” và “cajeput”. (Tanit Nuyim, 2008) Ở Việt Nam cây Tràm được biết đến với tên gọi Tràm ta, Tràm cừ hay Tràm gió (Nguyễn Ngọc Bình, 2004). 1.1.1.2. Đặc điểm hình thái Tràm ta là cây bụi hay cây gỗ, có kích thước trung bình cao tới 25 m (Phạm Xuân Quí, 2010), đường kính 25 - 30 cm. Vỏ màu trắng xám, nhiều lớp mỏng. Tán lá thưa. Lá đơn, mọc cách, gân song song xuất phát từ gốc (Nguyễn Ngọc Bình, 2004), đôi khi có nhiều rễ bất định. Tán cây tương đối dày rậm và rộng, hơi có màu bạc. Cành nhỏ, cành con mảnh nhưng không rủ. Chồi non mọc dày và mềm mượt. 4 Lá đơn mọc cách, phẳng, từ mềm mượt đến láng nhẵn. Phiến lá mỏng dài, hình trứng hay mũi mác, có khi hình lưỡi liềm, tù và nhọn dần về phía đầu, có khi khoanh lại ở đuôi, màu xanh xám, kích thước 10 có khi đến 12 cm x 1 đến 2,5 có khi đến 6 cm. Bề mặt lá lấm chấm những tuyến dầu lớn mờ, gân lá tạo hình mắt lưới, với 5 - 7 đường gân nổi rõ (Phạm Xuân Quí, 2010). Hình 1.1. Cây Tràm ta Melaleuca cajuputi Powell Hoa nhỏ, màu trắng vàng nhạt, hợp thành bông, dài 5 - 15 cm ở đầu cành. Hoa không cuống. Cành dài hình trụ hoặc hình trứng, đầu chia 5 thùy ngắn. Nhị đực nhiều hợp thành 5 bó, chỉ nhị hình sợi, bao phấn gần như vuông, thò ra ngoài bao hoa. Đĩa mật chia thùy, có lông. Bầu dính gần hết với ống dài, đỉnh có lông, 3 ô, nhiều noãn, vòi nhụy hình sợi, hình đĩa. Quả nang hình bán cầu hoặc gần tròn, đường kính 3 - 4mm, mở 3 lỗ. Hạt tròn hay có mũi nhọn (Trần Hợp, 2002). Ở nước ta Tràm tồn tại cả 2 hoặc 3 dạng sống trên các lập địa khác nhau. Ở đồng bằng sông Cửu Long có dạng Tràm cừ, Tràm lùn và Tràm bụi, trong đó Tràm cừ là chiếm phần lớn. Ở Nam Trung Bộ có dạng Tràm cừ và Tràm bụi. Ở Bắc Trung Bộ có dạng Tràm cừ, Tràm lùn và Tràm bụi nhưng nhiều nhất là ở 2 dạng sau.