Luận văn So sánh kết quả phát hiện monodon baculovirus trên tômsú (penaeus monodon) bằng phương pháp nhuộm malachite green, nhuộm haematoxylin và eosin, polymerase chain reaction

Đề tài được thực hiện nhằm so sánhkết quả phát hiện Monodon Baculovirus trênmẫu tôm giống và tôm thịtbằng 3 phơng pháp nhuộm Malachite Green, nhuộm Haematoxylin và Eosin, Polymerase Chain Reaction. Đốivới 30mẫu tôm giống được phân tíchbằng 3 phơng pháp này thì có 8/30 mẫu (chiếm 27%) chokết quảdơng tính ởcả 3 phơng pháp và 22/30mẫu (chiếm 73%) cósự khác biệt ở 3 phơng pháp. Đốivới 11mẫu tôm thịt thì có 3/11mẫu chokết quảdơng tính ở 2 phơng pháp nhuộm Malachite Green và Polymerase Chain Reaction. Riêng ở phơng pháp nhuộm Haematoxylin và Eosin thì 11/11mẫu đều chokết quảtế bào gantụy bình thờng. Quakết quả này cho thấy ởphơngphápPolymerase Chain Reaction thì tiện lợihơn phơng pháp nhuộm Malachite Green và nhuộm Haematoxylin và Eosin trong việc phát hiện mầmbệnh trongbấtkỳ giai đoạn nào. Trong khi đó, ở phơng pháp nhuộm Malachite Green và nhuộm Haematoxylin và Eosin thìlại có ý nghĩa trong việc chẩn đoán nguyên nhân gâybệnh, nhưng ở phơng pháp nhuộm Malachite Green thì thời gian thực hiện ngắn và đơn giản nên chokết quả chẩn đoán nguyên nhân gâybệnh ởcơ quan đích nhanhhơn nhuộm Haematoxylin và Eosin. Do đó, tùy mục đích nghiêncứu mà chọn phơng pháp phát hiệnbệnh cho phùhợp.

pdf44 trang | Chia sẻ: lvbuiluyen | Ngày: 04/11/2013 | Lượt xem: 1722 | Lượt tải: 2download
Bạn đang xem nội dung tài liệu Luận văn So sánh kết quả phát hiện monodon baculovirus trên tômsú (penaeus monodon) bằng phương pháp nhuộm malachite green, nhuộm haematoxylin và eosin, polymerase chain reaction, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN QUẢNG THỊ MỸ DUYÊN SO SÁNH KẾT QUẢ PHÁT HIỆN MONODON BACULOVIRUS TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM MALACHITE GREEN, NHUỘM HAEMATOXYLIN VÀ EOSIN, POLYMERASE CHAIN REACTION LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version i LỜI CẢM TẠ Ø Trước tiên, tôi xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến Cô Đặng Thị Hoàng Oanh, Chị Trần Việt Tiên đã tận tình hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện luận văn. Ø Tôi xin cảm ơn đến tất cả các thầy, cô, anh chị cán bộ khoa Thủy Sản- Trường Đại học Cần Thơ đã tận tình chỉ bảo, tạo điều kiện cho tôi học tập và hoàn thành luận văn này. Ø Tôi cũng xin chân thành cảm ơn đến các bạn lớp Bênh Học Thủy Sản K31 và các bạn bè xung quanh đã quan tâm, giúp đở tôi trong suốt thời gian học tập tại đây. Ø Cuối cùng, tôi xin chân thành biết ơn sâu sắc đến những người thân trong gia đình đã hết lòng quan tâm, chăm sóc và động viên tôi trong suốt thời gian qua. Cần Thơ, ngày 14 tháng 05 năm 2009 Quảng Thị Mỹ Duyên PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version ii TÓM TẮT Đề tài được thực hiện nhằm so sánh kết quả phát hiện Monodon Baculovirus trên mẫu tôm giống và tôm thịt bằng 3 phương pháp nhuộm Malachite Green, nhuộm Haematoxylin và Eosin, Polymerase Chain Reaction. Đối với 30 mẫu tôm giống được phân tích bằng 3 phương pháp này thì có 8/30 mẫu (chiếm 27%) cho kết quả dương tính ở cả 3 phương pháp và 22/30 mẫu (chiếm 73%) có sự khác biệt ở 3 phương pháp. Đối với 11 mẫu tôm thịt thì có 3/11 mẫu cho kết quả dương tính ở 2 phương pháp nhuộm Malachite Green và Polymerase Chain Reaction. Riêng ở phương pháp nhuộm Haematoxylin và Eosin thì 11/11 mẫu đều cho kết quả tế bào gan tụy bình thường. Qua kết quả này cho thấy ở phương pháp Polymerase Chain Reaction thì tiện lợi hơn phương pháp nhuộm Malachite Green và nhuộm Haematoxylin và Eosin trong việc phát hiện mầm bệnh trong bất kỳ giai đoạn nào. Trong khi đó, ở phương pháp nhuộm Malachite Green và nhuộm Haematoxylin và Eosin thì lại có ý nghĩa trong việc chẩn đoán nguyên nhân gây bệnh, nhưng ở phương pháp nhuộm Malachite Green thì thời gian thực hiện ngắn và đơn giản nên cho kết quả chẩn đoán nguyên nhân gây bệnh ở cơ quan đích nhanh hơn nhuộm Haematoxylin và Eosin. Do đó, tùy mục đích nghiên cứu mà chọn phương pháp phát hiện bệnh cho phù hợp. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version iii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM TẠ .................................................................................................. i TÓM TẮT ........................................................................................................ ii MỤC LỤC ..................................................................................................... . iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .............................................................. .. v DANH SÁCH BẢNG .................................................................................... ..vi DANH SÁCH HÌNH ..................................................................................... vii CHƯƠNG1: ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................ 1 1.1 Giới thiệu ..................................................................................................... 1 1.2 Mục tiêu ...................................................................................................... 2 1.3 Nội dung ...................................................................................................... 2 CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ......................................................... 3 2.1 Tình hình nuôi tôm trên thế giới ................................................................... 3 2.2 Tình hình nuôi tôm ở Việt Nam ................................................................... 3 2.3 Tình hình dịch bệnh trên tôm và tác hại của nó ............................................ 4 2.4 Bệnh MBV .................................................................................................. 7 2.4.1 Tác nhân gây bệnh ............................................................................... 7 2.4.2 Dấu hiệu bệnh lý.................................................................................. 8 2.4.3 Phân bố ............................................................................................... 8 2.4.4 Loài và giai đoạn cảm nhiễm ............................................................... 9 2.4.5 Phương thức lây nhiễm ........................................................................ 9 2.4.6 Chẩn đoán bệnh ................................................................................... 9 2.4.7 Phòng bệnh .......................................................................................... 10 2.5 Phương pháp nhuộm Malachite Green ........................................................ 10 2.6 Phương pháp mô học (nhuộm Haematoxylin và Eosin) ................................ 10 2.6.1 Sơ lược về nghiên cứu mô học ............................................................. 10 2.6.2 Ứng dụng mô học bệnh học trong thủy sản .......................................... 11 2.7 Phương pháp PCR ...................................................................................... 12 2.7.1 Sơ lược về PCR ................................................................................... 12 2.7.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR ............................................ 13 2.7.3 Ứng dụng của phương pháp PCR trong thủy sản ................................. 14 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version iv CHƯƠNG 3:VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 15 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................................ 15 3.2 Vật liệu nghiên cứu ...................................................................................... 15 3.2.1 Đối tượng nghiên cứu .......................................................................... 15 3.2.2 Dụng cụ dùng trong nghiên cứu ........................................................... 15 3.2.2.1 Dụng cụ dùng trong phương pháp nhuộm Malachite Green............ 15 3.2.2.2 Dụng cụ dùng trong phương pháp nhuộm Haematoxylin và Eosin . 15 3.2.2.3 Dụng cụ dùng trong phương pháp PCR .......................................... 15 3.2.3 Hóa chất dùng trong nghiên cứu .......................................................... 16 3.2.3.1 Phương pháp nhuộm Malachite Green ........................................... 16 3.2.3.2 Phương pháp nhuộm Haematoxylin và Eosin ................................. 16 3.2.3.3 Phương pháp PCR .......................................................................... 16 3.3 Phương pháp nghiên cứu.............................................................................. 16 3.3.1 Phương pháp thu mẫu .......................................................................... 16 3.3.2 Phương pháp phân tích ........................................................................ 17 3.3.2.1 Phương pháp nhuộm Malachite Green ........................................... 17 3.3.2.2 Phương pháp nhuộm Haematoxylin và Eosin ................................. 17 3.3.2.3 Phương pháp PCR .......................................................................... 20 3.4 Phương pháp xữ lý số liệu ............................................................................ 20 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 23 4.1 Kết quả phát hiện MBV trên mẫu tôm giống bằng phương pháp nhuộm MG, nhuộmH&E và PCR. ......................................................................................... 23 4.1.1 Kết quả phát hiện MBV bằng phương pháp nhuộm MG ...................... 23 4.1.2 Kết quả phát hiện MBV bằng phương pháp nhuộm H&E .................... 25 4.1.3 Kết quả phát hiện MBV bằng phương pháp PCR. ................................ 26 4.2 So sánh kết quả phát hiện MBV trên mẫu tôm giống và tôm thịt bằng phương pháp nhuộm MG, nhuộm H&E và PCR.. .......................................................... 28 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ...................................................... 32 5.1 Kết luận ....................................................................................................... 32 5.2 Đề xuất ....................................................................................................... 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 33 PHỤ LỤC ......................................................................................................... 36 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ĐBSCL Đồng Bằng sông cửu Long NTTS Nuôi Trồng Thủy Sản NCTS Nghiên Cứu Thủy Sản PL Postlarvae MBV Monodon Baculovirus WSSV White Spot Syndrome Virus MG Malachite Green H&E Haematoxylin và Eosin PCR Polymerase Chain Reaction PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version vi DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 3.1: Thành phần và thể tích của dung dich Davidson’s AFA ..................... 17 Bảng 3.2: Hóa chất sử dụng trong quy trình xử lý mẫu ...................................... 18 Bảng 3.3: Các hóa chất sử dụng trong quy trình nhuộm mẫu ............................. 19 Bảng 4.1: Kết quả phát hiện nhiễm MBV trên tôm giống bằng phương pháp nhuộm MG, H&E và PCR ................................................................. 30 Bảng 4.2: Kết quả phát hiện nhiễm MBV trên tôm thịt bằng phương pháp pháp nhuộm MG, H&E và PCR ................................................................. 31 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version vii DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 4.1: Tôm giống bị nhiễm bệnh MBV có kích cở không đều nhau .............. 23 Hình 4.2: Cường độ nhiễm MBV trên tôm giống khi phát hiện bằng phương pháp nhuộm MG ................................................................................ 23 Hình 4.3: Tôm thịt bị nhiễm bệnh MBV ............................................................ 24 Hình 4.4: Kết quả phát hiện MBV trên tôm giống bằng MG .............................. 24 Hình 4.5: Kết quả phát hiện MBV trên tôm thịt bằng MG .................................. 25 Hình 4.6: Cường độ nhiễm MBV trên tôm giống khi phát hiện bằng phương pháp nhuộm H&E .............................................................................. 26 Hình 4.7: Kết quả phát hiện MBV trên tôm giống bằng phương pháp nhuộm H&E .................................................................................................. 26 Hình 4.8: Kết quả phát hiện MBV trên tôm giống bằng phương pháp nhuộm H&E .................................................................................................. 26 Hình 4.9: Kết quả phát hiện MBV trên tôm giống bằng phương pháp PCR ....... 27 Hình 4.10: Kết quả điện di phát hiện MBV trên tôm giống bằng phương pháp PCR ................................................................................................... 27 Hình 4.11: Kết quả phát hiện MBV trên tôm thịt bằng phương pháp PCR ......... 28 Hình 4.12: Kết quả điện di phát hiện MBV trên tôm thịt bằng phương pháp PCR ................................................................................................... 28 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 1 CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu Ngày nay, thủy sản là một trong những ngành có vai trò quan trọng và đem lại hiệu quả kinh tế đáng kể cho đất nước. Trong đó, nuôi trồng thủy sản ở Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) chiếm trên 70% sản lượng nuôi trồng và trên 60% tổng kim ngạch xuất khẩu thủy sản của cả nước (Nguyễn Chu Hồi, 2008). Trong các đối tượng nuôi chính thì tôm sú là đối tượng nuôi đã đem lại hiệu quả kinh tế rất cao trong công tác xóa đói giảm nghèo và góp phần nâng cao chất lượng cuộc sống cho người dân của vùng. Phong trào nuôi tôm sú thương phẩm ở ĐBSCL phát triển rầm rộ từ năm 2000 khi chính phủ ban hành nghị quyết 09. Diện tích tôm nuôi hiện nay đã tăng gấp đôi so với năm 2000 (từ 250.000 ha lên 540.000 ha và chủ yếu là tôm sú (538.800 ha) tập trung ở các tỉnh Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc Trăng, Kiên Giang, Trà Vinh, Tiền Giang, Bến Tre (Bộ NN&PTNN, 2008). Song song với việc gia tăng diện tích, sản lượng tôm nuôi thì tình hình dịch bệnh cũng đang diễn biến phức tạp và gây ra những tổn thất nghiêm trọng cho người nuôi. Những bệnh chính thường xuất hiện trên tôm sú nuôi ở ĐBSCL gồm bệnh do vi khuẩn như bệnh phát sáng, bệnh đen mang, nghiêm trọng hơn là các bệnh do virus như White Spot Syndrome Virus (WSSV), Monodon Baculovirus (MBV), Yellow Head Disease (YHD),… Trong đó, Monodon Baculovirus là một trong những tác nhân gây bệnh nguy hiểm trên tôm sú, đặc biệt là gây tỷ lệ chết cao cho ấu trùng, đối với tôm trưởng thành sự nhiễm ít nghiêm trọng hơn. Tuy nhiên, khả năng gây bệnh của Monodon Baculovirus còn tùy thuộc vào độc lực của từng chủng virus ở từng vùng địa lý khác nhau (Liao et al., 1992 được trích dẫn từ Nguyễn Văn Hảo, 1997). Do hiện nay chưa có thuốc đặc trị nên công tác phòng ngừa và chẩn đoán bệnh sớm là điều rất cần thiết. Các phương pháp như nhuộm Malachite Green, nhuộm Haematoxylin và Eosin giúp cho việc chẩn đoán bệnh dựa trên những biến đổi bệnh lý dưới mức độ vi thể của tổ chức cơ quan. Bên cạnh đó, phương pháp Polymerase Chain Reaction chẩn đoán bệnh ở cấp độ phân tử, giúp phát hiện kịp thời nhằm hạn chế rũi ro do dịch bệnh ở mức thấp nhất. Do đó đề tài “So sánh kết quả phát hiện Monodon Baculovirus trên tôm sú (Penaeus monodon) bằng phương pháp nhuộm Malachite Green, nhuộm Haematoxylin và Eosin và Polymerase Chain Reaction” được thực hiện. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 2 1.2 Mục tiêu So sánh kết quả phát hiện Monodon Baculovirus trên tôm sú bằng 3 phương pháp nhuộm Malachite Green, nhuộm Haematoxylin và Eosin và Polymerase Chain Reaction. 1.3 Nội dung Đề tài được thực hiện với các nội dung sau: (i) Phát hiện Monodon Baculovirus trên mẫu tôm giống bằng phương pháp nhuộm Malachite Green, nhuộm Haematoxylin và Eosin, Polymerase Chain Reaction. (ii) Phát hiện Monodon Baculovirus trên mẫu tôm thịt bằng phương pháp nhuộm Malachite Green, nhuộm Haematoxylin và Eosin, Polymerase Chain Reaction. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 3 CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tình hình nuôi tôm trên thế giới Hiện nay, trên thế giới hai khu vực nuôi tôm lớn nhất là Đông Nam Á và Châu Mỹ. Sản lượng tôm nuôi ở Châu Á chiếm khoảng 80% sản lượng toàn cầu. Các nước chiếm sản lượng tôm nuôi cao là: Trung Quốc, Ấn Độ, Nhật Bản, Philippin, In-đô-nê-xi-a, Thái Lan, Hàn Quốc, Bănglađet, Việt Nam, Nauy...; có khoảng 20 loài tôm được nuôi trên thế giới. Trong đó, các loài tôm được nuôi nhiều nhất là tôm sú (Penaeus monodon), tôm nương (Penaeus chinensis), tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei). Riêng 3 loài tôm này chiếm trên 86% sản lượng tôm nuôi của thế giới. Sản lượng tôm nuôi năm 2000 của thế giới là 1.087.111 tấn chiếm khoảng 66% giáp xác nuôi, giá trị 6,880 tỷ USD, chiếm 73,4% trong giá trị nuôi giáp xác. Năm 2001 sản lượng đạt 1.270.875 tấn, giá trị 8,432 tỷ USD. Tổng sản lượng tôm nuôi chiếm 25% sản lượng tôm nói chung của thế giới ( trích dẫn từ Bộ Thủy Sản, 2006). 2.2 Tình hình nuôi tôm ở Việt Nam Theo Ling (1973) và Rabanal (1974) thì nghề nuôi tôm ở Việt Nam đã tồn tại từ thập niên 70 với hình thức nuôi tôm quảng canh. Trong đó, diện tích tôm nuôi ở ĐBSCL ở thời kì này đạt khoảng 70.000 ha. Nghề nuôi tôm ở Việt Nam thật sự phát triển từ sau năm 1987 và nuôi tôm thương phẩm phát triển mạnh vào những năm đầu thập kỹ 90. Tuy nhiên, sự bùng nổ của nghề nuôi tôm thương phẩm được đánh dấu vào năm 2000 khi chính phủ ban hành nghị quyết 09, cho phép chuyển đổi một phần diện tích trồng lúa, làm muối năng suất thấp, đất hoang hóa sang nuôi trồng thủy sản. Diện tích nuôi tôm đã tăng từ 250.000 ha năm 2000 lên đến 478.000 ha năm 2001. Song song, với việc mở rộng diện tích, sản lượng tôm nuôi cũng tăng mạnh từ những năm 90 và đặc biệt là từ sau năm 2000 Việt Nam đã trở thành một trong năm nước có sản lượng tôm nuôi cao nhất thế giới (Bộ thủy sản, 2006). Năm 2003 tổng diện tích tôm nuôi khoảng 518.557 ha đạt sản lượng hơn 258.034 tấn. Theo báo cáo sơ bộ của tổng cục thống kê năm 2007 tổng diện tích nuôi tôm của cả nước khoảng 625.600 ha đạt sản lượng khoảng 315.435 tấn. Trong đó, ĐBSCL là vùng có diện tích và sản lượng tôm chiếm khoảng 60-80% diện tích và sản lượng cả nước (Nguyễn Thanh Phương và Trần Ngọc Hải, 2004). Các loài tôm được nuôi chính ở Việt Nam là Tôm sú (Penaeus monodon), tôm he mùa (Penaeus merguiensis), tôm nương (Penaeus orientalis), tôm đất PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 4 (Metapenaeus ensis), trong đó tôm sú là loài nuôi chủ đạo, đóng góp sản lượng cao nhất. Gần đây tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) cũng được nhập về nuôi ở nước ta (trích dẫn từ Bộ Thủy sản, 2006). 2.3 Tình hình dịch bệnh trên tôm và tác hại của nó Cùng với sự phát triển, tốc độ gia tăng diện tích và sản lượng tôm nuôi là tình hình dịch bệnh không ngừng bùng phát. Đây cũng là một trong những nguyên nhân quan trọng làm giảm đáng kể sản lượng tôm nuôi. Tại Thái Lan nghề nuôi tôm năm 1992 bị thiệt hại 30 triệu USD (Nash et al., 1995); năm 1993 bệnh dịch đã làm cho những người nuôi tôm tại Trung Quốc thiệt hại 400 triệu USD (Wei Qi, 2001); năm 1994 Ấn Ðộ thiệt hại 17,6 triệu USD (Subasinghe et al., 1995); năm 1997 nghề nuôi tôm ở Thái Lan thiệt hại 600 triệu USD (Chanratchakool et al., 2001); năm 1999 bệnh tôm đã làm Ecuador thiệt hại 280 triệu USD (Alday de Graindorge and Griffith 2001). Theo Lightner (1996) thì virus là tác nhân chủ yếu và đã gây thiệt hại đáng kể cho nghề nuôi tôm. Chẳng hạn như bệnh do virus đốm trắng (WSSV), đầu vàng (YHD), hội chứng Taura đã gây thiệt hại nghiêm trọng cho nghề nuôi tôm ở Châu Mỹ La tinh hoặc bệnh MBV cũng đã gây thiệt hại không nhỏ cho nghề nuôi tôm sú ở Đài Loan năm 1987 và 1988 (Chen et al., 1988). Thiệt hại hàng năm do bệnh dịch thủy sản gây ra cho thế giới là khoảng 3 tỷ USD (Rosenberry, 1996) (trích dẫn từ Bộ Thủy Sản, 2006) Năm 1989 lần đầu tiên ở Thái Lan tìm thấy một số lượng lớn thể ẩn của MBV trong cơ quan gan tụy của Postlarvae (PL) ở tôm sú (đây là loài tôm nuôi chủ yếu ở Thái Lan và các nước châu Á) (Rosenberry, 1997). Theo kết quả nghiên cứu của Liao (1999) thì quần đàn tôm mẹ bắt từ biển của Đài Loan 1987 nhiễm MBV 33%, đến năm 1989 nhiễm 100%, thường gặp nhiễm 85%. Loài virus này được công bố là loài gây bệnh trên tôm nuôi công nghiệp ở Đài Loan năm 1987-1988 (Liao et al., 1992). Natividad (1992) cho biết, ở Philippine đến năm 1992 rất khó tìm được một đàn PL của tôm sú không nhiễm MBV (trích dẫn từ Nguyễn Văn Hảo,1997). MBV cũng được xem là tác nhân gây bệnh làm ảnh hưởng đến năng suất thu hoạch ở Úc. MBV hiện diện phổ biến ở các Châu lục, gây bệnh cho tôm nuôi và tôm tự nhiên (Lightner và Redman, 1981). Virus này gây tỷ lệ chết cao cho ấu trùng và đối với tôm trưởng thành sự nhiễm ít nghiêm trọng hơn (Liao et al., 1992). Còn theo Lightner (1996) thì MBV có thể nhiễm ở hầu hết các giai PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 5 đoạn khác nhau của tôm, bắt đầu từ giai đoạn Zoea 2, riêng giai đoạn Nauplius có tính trơ với virus. Tuy nhiên, khả năng gây bệnh của MBV còn tùy thuộc vào độc lực của từng chủng virus ở từng vùng địa lý khác nhau (trích dẫn từ Đỗ Thị Hòa và ctv, 2004). Theo Phan Lương
Luận văn liên quan