Luận văn Thu nhận Enzym Papain để ứng dụng vào phản ứng thủy phân Protein trong bánh dầu đậu phộng

Hiện nay vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm và ô nhiễm môi trường đang là vấn đề được quan tâm hàng đầu. Trong quá trình sản xuất nước chấm có hàm lượng đạm cao, người ta thường dùng các phương pháp thủy phân protein tạo thành các dung dịch amino acid. Có 3 phương pháp tiến hành phản ứng thủy phân protein: Phương pháp hóa học: thủy phân protein với xúc tác acid, thời gian tiến hành phản ứng là 24 giờ. Nhược điểm của phương pháp này là tạo thành sản phẩm phụ 3-MCPD, một chất độc gây ung thư. Phương pháp dùng men vi sinh: sử dụng chủng nấm Aspergillus oryzae để xúc tác phản ứng thủy phân protein. Nhược điểm của phương pháp này là thời gian thực hiện phản ứng khá dài khoảng từ 6 – 8 tháng. Phương pháp hóa sinh: sử dụng xúc tác là các enzyme protease có nguồn gốc động thực vật làm xúc tác. Phương pháp này có thời gian phản ứng ngắn và không tạo sản phẩm phụ có khả năng gây ung thư. Các phản ứng sử dụng xúc tác enzyme được ứng dụng rất rộng rãi trong lĩnh vực này vì chúng không những cho hiệu suất cao mà thời gian thực hiện phản ứng cũng ngắn hơn so với phản ứng được tiến hành theo phương pháp cổ điển. Hơn nữa các enzyme thường được phân bố rất rộng rãi trong tất cả các mô, cơ quan động vật và thực vật, tế bào vi sinh vật nên tương đối dễ tìm. Trong phạm vi luận văn này chúng tôi sẽ tiến hành thu nhận enzyme papain có trong nhựa đu đủ và ứng dụng tính chất thủy phân protein của enzyme papain để làm xúc tác cho phản ứng thủy phân protein trong bánh dầu đậu phộng đã được ép lấy dầu. Chúng tôi chọn enzyme papain vì đây là enzyme có hoạt tính protease cao, hiện diện nhiều trong nhựa trái đu đủ, một loại cây được trồng rất phổ biến ở nước ta.

pdf50 trang | Chia sẻ: tuandn | Ngày: 17/04/2013 | Lượt xem: 3734 | Lượt tải: 6download
Bạn đang xem nội dung tài liệu Luận văn Thu nhận Enzym Papain để ứng dụng vào phản ứng thủy phân Protein trong bánh dầu đậu phộng, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
30 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 KHẢO SÁT LƢỢNG NHỰA Ở QUẢ ĐU ĐỦ Chúng tôi đã tiến hành khảo sát lượng nhựa ở ba loại quả (quả non, quả già xanh, quả gần chín) ở trên cùng một loài và cùng một phương pháp làm khô. Kết quả được trình bày trong bảng 3.1 Bảng 3.1. Hàm lƣợng phần trăm của nhựa đu đủ trong các loại quả khác nhau. Loại quả Khối lượng quả (g) Khối lượng nhựa lấy (g) Tỉ lệ nhựa thô trên quả (%) Quả non (dưới 40 ngày tuổi) 120 0.2576 0.21 Quả già xanh (50-100 ngày tuổi) 580 1.5153 0.26 Quả gần chín (100-120 ngày tuổi) 1700 3.0292 0.18 Nhận xét: lượng papain thô thu được ở quả già xanh cao hơn so với quả non và quả gần chín đồng thời chiếm hàm lượng khá cao. Qua kết quả này, chúng tôi nhận thấy thời gian thích hợp để thu nhận nhựa thô là khi quả đu đủ được 50 – 100 ngày tuổi. 3.2 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SƠ CHẾ NHỰA TƢƠI Nhựa tươi được làm khô ngay, ở nhiệt độ nhỏ hơn 50oC bằng các phương pháp khác nhau. Kết quả được trình bày trong bảng 3.2 Bảng 3.2. Các phƣơng pháp làm khô nhựa đu đủ Phương pháp làm khô Hình thức cảm quan Phơi nắng 1-2 nắng Vón cục,vàng nâu Sấy nóng, có quạt gió 24 giờ Vón cục, vàng nhạt Đông khô chân không 8 giờ Vẩy mỏng, óng ánh và trắng sáng Nhận xét: Chất lượng papain thô thu được từ các phương pháp xử lý khác nhau rất khác nhau. Hình thức cảm quan phản ánh rõ chất lượng của sản phẩm: màu càng thẫm chất lượng càng kém. 31 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM Tuy có nhiều phương pháp khác nhau để làm khô nhựa tươi nhưng phương pháp đông khô chân không là phương pháp hiệu quả nhất và ít ảnh hưởng đến chất lượng nhựa. Do đó, toàn bộ nhựa tươi được đông khô chân không để loại nước và nhựa sau đông khô được bảo quản trong tủ lạnh để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo. Từ 100ml dung dịch nhựa tươi, chúng tôi tiến hành đông khô trong 8 giờ và thu được 5 gam chế phẩm đông khô. 3.3 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN THU NHẬN PAPAIN TỪ NHỰA KHÔ Nhựa tươi sau khi đã đông khô chân không, chúng tôi tiến hành sơ chế bằng dung môi hữu cơ được làm lạnh để loại bỏ các tạp chất. Sản phẩm sau quá trình sơ chế được chạy điện di để phân tích sơ bộ thành phần protein. Kết quả chạy điện di của sản phẩm sau giai đoạn sơ chế được trình bày trong hình 3.1a: Hình 3.1a. Điện di đồ của nhựa khô ở trái non sơ chế bằng dung môi etanol 32 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM 1 – thang protein chuẩn 2 – nhựa đu đủ non đông khô sơ chế bằng etanol Nhận xét: quá trình sơ chế bằng dung môi còn lẫn khá nhiều protein tạp, do đó chúng tôi tiến hành qui trình tinh chế với các phân đoạn khác nhau để tinh sạch protein. Đồng thời, chúng ta cũng dễ dàng nhận thấy rằng trong vạch điện di của nhựa đu đủ non không có xuất hiện enzyme papain do đó chúng tôi tiến hành lấy nhựa trên trái trưởng thành để thu nhận papain. Điều này hoàn toàn phù hợp với các nghiên cứu trước đây về enzyme trong nhựa đu đủ: enzyme papain chỉ hình thành trong giai đoạn trưởng thành của trái. Tinh chế: Tiến hành tinh chế papain từ nhựa đông khô theo phương pháp đã trình bày trong phần thực nghiệm, từ 90 gam nhựa khô ban đầu chúng tôi thu được 1g papain. Kết quả điện di được trình bày trong hình 3.1b: Hình 3.1 b. Điện di đồ của chế phẩm Merk và papain tinh chế từ nhựa đu đủ đông khô. 1- Thang protein chuẩn 2- Chế phẩm Merck 3 - papain 33 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM 3.4 PHƢƠNG PHÁP LOWRY XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG PROTEIN Kết quả đo mật độ quang ∆OD ở bước sóng 750nm của các ống nghiệm có nồng độ albumin từ 50 – 250mg/ml được trình bày trong bảng 3.3 (phụ lục 1) Bảng 3.3. Mật độ quang của albumin ở bƣớc sóng 750nm Mẫu 01 02 03 04 05 Nồng độ Albumin (mg/ml) 50 100 150 200 250 Độ hấp thu quang OD (AU) 0.0432 0.0648 0.1192 0.135 0.1942 Từ kết quả trên, vẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang ∆OD (AU) theo nồng độ protein chuẩn (mg/ml) theo hình 3.2 với phương trình đường chuẩn là y = 0.0007x – 0.0004 Hình 3.2. Đƣờng chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ albumin. Cách tính Từ phương trình đường chuẩn so sánh mật độ quang của ống nghiệm chứa mẫu protein. Từ đó suy ra nồng độ của protein trong nguyên liệu là x (mg/ml) Hàm lượng protein M (có trong 1g nguyên liệu được tính theo công thức): 34 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM m nx M *001.0*  (mg/g) với x: là nồng độ protein trong dung dịch đã pha loãng (mg/ml). n: hệ số pha loãng m: khối lượng nguyên liệu lấy phân tích (g) 3.5 PHƢƠNG PHÁP ANSON XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH PROTEASE Kết quả đo mật độ quang ∆OD ở bước sóng 720nm của các ống nghiệm có lượng tyrosin tương ứng từ 0.2 – 1.0M được trình bày trong bảng 3.4 (phụ lục 2) Bảng 3.4. Mật độ quang của tyrosin ở bƣớc sóng 720nm Mẫu 02 03 04 05 06 Lượng tyrosin tương ứng (M) 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Độ hấp thu quang OD(AU) 0.1059 0.1812 0.3138 0.3464 0.4688 Ống số 1 là ống thử không (TK), các ống còn lại là ống thí nghiệm (TT). Vẽ đường chuẩn Tyrosin tương quan giữa lượng Tyrosin (M) và biến thiên độ hấp thu quang ở bước sóng 720nm như hình 3.3 với phương trình đường chuẩn là y = 0.4454x + 0.016. Đường chuẩn Anson y = 0.4454x + 0.016 0 0.05 0.1 0. 5 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 Lượng Tyrosin (mM) M ật đ ộ qu an g (A U) Hình 3.3. Đƣờng chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ tyrosin. 35 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM Cách tính Định nghĩa đơn vị Anson: một đơn vị Anson là lượng enzyme tối thiểu trong điều kiện chuẩn (35.5oC, pH 7.6 …) thủy phân casein trong 1 phút tạo thành sản phẩm hòa tan trong TCA, phản ứng với thuốc thử Folin cho ta độ hấp thu OD ở bước sóng 660nm tương ứng với 1M Tyrosin trong đường chuẩn. Hñ P = Tyrosin*V*L t*m*v (UI) với Hđ P: hoạt tính protein (UI) V: tổng thể tích hỗn hợp trong ống nghiệm 1 hoặc 2 (ml). v: thể tích dịch lọc đem phân tích (ml). t: thời gian thủy phân (phút) m: khối lượng mẫu enzyme đem xác định hoạt tính (g) L: độ pha loãng mẫu enzyme. M Tyrosin: lượng M Tyrosin trong v (ml) suy ra từ đường chuẩn. 3.6 KHẢO SÁT LƢỢNG ENZYME THU ĐƢỢC SAU CÁC GIAI ĐOẠN TINH CHẾ. Trong quá trình tinh chế enzyme chúng tôi tiến hành khảo sát lượng protein thu được sau mỗi phân đoạn bằng cách lấy ra 0,1g dung dịch enzyme, sau đó định mức thành100ml bằng nước cất để xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry. Kết quả được trình bày trong bảng 3.5 với cách tính như sau: Thế giá trị mật độ quang ∆OD ở mỗi phân đoạn vào phương trình đường chuẩn xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry là y = 0.0007x – 0.0004 ta suy ra được nồng độ protein trong dung dịch đã pha loãng là x. Sau đó, áp dụng công thức m nx M *001.0*  (mg/g) với x: là nồng độ protein trong dung dịch đã pha loãng (mg/ml). n: hệ số pha loãng m: khối lượng nguyên liệu lấy phân tích (g) 36 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM để tính lượng protein trong nguyên liệu là M (mg/g). Bảng 3.5. Lƣợng protein thu đƣợc ở các phân đoạn tinh chế khác nhau. 247.71 199.14 184.86 179.14 174.86 162.00 0 50 100 150 200 250 300 pH 5.7 pH 9 (NH4)2SO4 NaCl Kết tinh Tái kết tinh Các giai đoạn tinh chế Lư ợn g p ro tei n ( mg /g) Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn sự biến thiên lƣợng protein sau mỗi giai đoạn tinh chế. Nhận xét: Từ bảng số liệu và biểu đồ trên ta nhận thấy rằng, trong quá trình tinh chế enzyme bằng phương pháp tủa muối thì hàm lượng protein trong mẫu giảm dần. Điều này có thể được giải thích như sau: lượng protein ban đầu cao là do trong nhựa khô chưa tinh chế ngoài papain còn có nhiều protein khác, sau mỗi giai đoạn tinh chế thì protein tạp được loại bỏ dần làm cho hàm lượng protein cũng giảm theo. Các phân đoạn ∆OD M (mg/g) Phụ lục Phân đoạn pH 5.7 0.173 247.71 3 Phân đoạn pH 9.0 0.139 199.14 4 Phân đoạn tủa với ammonium sulfat 0.129 184.86 5 Phân đoạn bằng NaCl 0.125 179.14 6 Phân đoạn kết tinh 0.123 174.86 7 Phân đoạn tái kết tinh 0.113 162.00 8 37 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM 3.7 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CỦA ENZYME SAU CÁC GIAI ĐOẠN TINH CHẾ Trong quá trình tinh chế enzyme ngoài việc khảo sát lượng protein thu được sau mỗi phân đoạn, chúng tôi cũng tiến hành đồng thời việc khảo sát hoạt tính protein ở mỗi giai đoạn tinh chế với cách thực hiện như sau: Cân 0.1g mẫu protein ở mỗi giai đoạn tinh chế định mức thành 100ml dung dịch bằng nước cất. Cho vào mỗi ống nghiệm 1ml dung dịch protein đã pha loãng và các dung dịch khác như sau Dung dịch hóa chất Ống nghiệm 1 2 Dung dịch casein 1% (ml) 5 5 Dung dịch TCA 5% (ml) 0 10 Dung dịch enzyme mẫu (ml) 1 1 Lắc đều và giữ ở 35.5oC Dung dịch TCA 5% (ml) 10 0 Để yên 30 phút, lọc lấy dịch bên dưới Lấy 2 ống nghiệm mới, sạch đánh dấu A và B. Cho vào ống A 5ml dịch lọc từ ống nghiệm 1 và ống B 5ml dịch lọc từ ống nghiệm 2. Thêm vào mỗi ống 10ml dung dịch NaOH 0.5N và 3ml thuốc thử Folin, lắc mạnh, sau 10 phút, đo ∆OD1 và ∆OD2 ở bước sóng 720nm từ đó dựa vào đồ thị chuẩn để suy ra được M Tyrosin. Hoạt tính protein được xác định theo phương pháp Anson. Kết quả được trình bày trong bảng 3.6 với cách tính như sau: Thế giá trị y = (∆OD1 - ∆OD2) vào phương trình đường chuẩn xác định hoạt tính theo Anson y = 0.4454x + 0.016 ta suy ra được x chính là lượng tyrosin. Từ giá trị của x ta tính được hoạt tính protease theo công thức: Hñ P = Tyrosin*V*L t*m*v (UI) với 38 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM Hđ P: hoạt tính protein (UI) V: tổng thể tích hỗn hợp trong ống nghiệm 1 hoặc 2 (ml). v: thể tích dịch lọc đem phân tích (ml). t: thời gian thủy phân (phút) m: khối lượng mẫu enzyme đem xác định hoạt tính (g) L: độ pha loãng mẫu enzyme. M Tyrosin: lượng M Tyrosin trong v (ml) suy ra từ đường chuẩn. Bảng 3.6. Hoạt tính protease của enzyme sau các giai đoạn tinh chế Các phân đoạn ∆OD1 ∆OD2 P(UI/ml) Tỉ lệ hoạt tính sau mỗi giai đoạn tinh chế (%) Phụ lục Nhựa khô ban đầu 0.308 0.012 70.353 9 Phân đoạn pH 5.7 0.264 0.063 66.46 94.47 10 Phân đoạn pH 9.0 0.150 0.035 57.39 81.57 11 Phân đoạn tủa với ammonium sulfat 0.372 0.185 49.30 70.08 12 Phân đoạn bằng NaCl 0.240 0.074 45.60 64.81 13 Phân đoạn kết tinh 0.115 0.055 36.36 51.68 14 Phân đoạn tái kết tinh 0.097 0.062 36.78 55.34 15 39 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM 66.46 57.39 49.30 45.60 36.36 36.78 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 pH 5.7 pH 9 (NH4)2SO4 NaCl Kết tinh Tái kết tinh Các giai đoạn tinh chế Ho ạt tín h p ro tea se (U I) Series1 Hình 3.5. Sự biến thiên hoạt tính của protein sau các giai đoạn tinh chế. Qua bảng số liệu và đồ thị, ta nhận thấy rằng trong quá trình tinh chế enzyme bằng phương pháp tủa muối thì hoạt tính protein trong mẫu giảm dần. Nguyên nhân có thể là do ban đầu nhựa khô ngoài chứa enzyme papain ra còn chứa những enzyme khác có chức năng bảo vệ papain nên hoạt tính cao, sau khi qua những giai đoạn tinh chế tiếp theo đã loại bỏ hầu hết những protein tạp chỉ còn lại papain tinh khiết nên dẫn đến hoạt tính protein cũng giảm theo. Sau phân đoạn kết tinh, sản phẩm đem đi kết tinh lại thì độ tinh sạch của sản phẩm cao hơn dẫn đến hoạt tính protein tăng lên đôi chút. 3.8 KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỔI LƢỢNG PROTEIN TRONG CÁC CHẾ PHẨM PROTEASE THU ĐƢỢC THEO THỜI GIAN Nhằm đánh giá tính ổn định của mỗi chế phẩm, chúng tôi tiến hành khảo sát sự biến đổi hàm lượng protein của mỗi chế phẩm theo thời gian. Cân chính xác 0.10 gam các chế phẩm thu được bằng các phương pháp khác nhau sau khi đã đông khô, cho vào bình định mức 100ml. Thêm nước cất đến vạch định mức, sau đó lắc đều đến khi chế phẩm tan hoàn toàn. Các chế phẩm này được bảo quản ở 4oC để dùng dần. Hút 0,4ml dung dịch protein đã pha ở trên để tiến hành xác định lượng protein cho mỗi lần thí nghiệm Thời gian tiến hành thí nghiệm là 5 ngày. Kết quả được trình bày trong bảng 3.7 (phụ lục 16 -19): 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM Bảng 3.7. Hàm lƣợng protein của các chế phẩm theo thời gian Ngày ∆OD Hàm lượng protein (mg/g) M0 M1 M2 M3 M0 M1 M2 M3 1 0.155 0.112 0.115 0.110 222.00 160.57 164.86 157.71 2 0.136 0.141 0.101 0.109 199.14 202.00 144.86 156.29 3 0.142 0.124 0.162 0.131 203.43 177.71 232.00 187.71 4 0.135 0.116 0.133 0.122 193.43 166.29 190.57 174.86 5 0.125 0.106 0.133 0.116 179.14 147.71 190.57 169.14 100 0 160 190 220 250 1 2 3 4 5 Ngày khảo sát Lư ợn g p ro tei n ( mg /g) M0 M1 M2 M3 Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn sự biến thiên hàm lƣợng protein theo thời gian Trong đó: M0: mẫu nhựa đu đủ tươi được đem đông khô M1: mẫu enzyme thu được bằng phương pháp tủa với ammonium sulfate sau khi đông khô. M2: mẫu enzyme thu được bằng phương pháp tủa bằng ethanol sau khi đông khô. 41 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM M3: mẫu enzyme thu được bằng phương pháp tủa bằng dung môi aceton sau khi đông khô. Nhận xét: Qua biểu đồ trên chúng ta thấy rằng hàm lượng protein của các chế phẩm hầu như không thay đổi nhiều theo thời gian chúng tôi khảo sát. Chế phẩm M0 có hàm lượng protein cao nhất còn M1 có hàm lượng protein nhỏ nhất. Như vậy phương pháp kết tủa bằng muối đã loại bỏ hầu hết các protein tạp có trong mẫu nghiên cứu, còn lại chủ yếu là papain nên có hàm lượng protein nhỏ nhất trong các phương pháp. Phương pháp đông khô giữ lại hầu hết những protein trong chế phẩm M0 vì quá trình đông khô giúp cố định mẫu nên có hàm lượng protein cao nhất. Còn hai phương pháp còn lại dùng dung môi để tủa enzyme đã loại bỏ một số protein có trong chế phẩm nhưng không thể loại bỏ hoàn toàn các protein khác nên có hàm lượng protein trung bình nằm giữa chế phẩm M0 và M1. 3.9 KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỔI HOẠT TÍNH CỦA CÁC CHẾ PHẨM THEO THỜI GIAN. Nhằm đánh giá tính ổn định của chế phẩm, chúng tôi đã tiến hành khảo sát sự biến đổi hoạt tính của chế phẩm theo thời gian. Cân 0.1 gam các chế phẩm thu được bằng các phương pháp khác nhau sau khi đã đông khô, cho vào bình định mức 100ml. Thêm nước cất đến vạch định mức, sau đó lắc đều đến khi chế phẩm tan hoàn toàn. Chế phẩm được bảo quản ở 4oC để dùng dần, thời gian tiến hành thí nghiệm là 5 ngày. Hút 1ml dung dịch trong bình định mức tiến hành xác định hoạt tính protease theo phương pháp Anson. Thí nghiệm được lặp lại mỗi ngày và kết quả được thể hiện trong bảng 3.8: 42 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM Bảng 3.8. Hoạt tính protein của các chế phẩm theo thời gian Ngày ∆OD P(UI/ml) M0 M1 M2 M3 M0 M1 M2 M3 1 0.296 0.212 0.144 0.116 70.353 49.286 32.187 25.146 2 0.197 0.158 0.192 0.124 65.081 51.010 63.224 38.797 3 0.125 0.107 0.081 0.080 54.728 45.766 32.690 32.187 4 0.265 0.071 0.064 0.087 44.702 9.879 8.621 12.753 5 0.264 0.059 0.044 0.033 26.749 4.634 3.018 1.832 Kết quả này được biểu diễn bằng đồ thị như hình 3.7 0 10 0 30 40 50 60 70 80 1 2 3 4 5 Thời gian (ngày) Ho ạt tín h ( UI /m l) M0 M1 M2 M3 Hình 3.7. Sự biến đổi hoạt tính của các chế phẩm theo thời gian Trong đó: M0: mẫu nhựa đu đủ tươi được đem đông khô M1: mẫu enzyme thu được bằng phương pháp tủa với ammonium sulfate sau khi đông khô. M2: mẫu enzyme thu được bằng phương pháp tủa bằng ethanol sau khi đông khô. M3: mẫu enzyme thu được bằng phương pháp tủa bằng dung môi aceton sau khi đông khô. 43 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM Nhận xét: Nhựa đu đủ là hỗn hợp các protease có tính thủy phân mạnh, trong đó papain là một trong những enzyme có hoạt tính mạnh và chiếm hàm lượng cao nhất, thủy phân protein tới oligopeptide. Papain ở dạng tự nhiên, nhóm –SH tự do bị bao vây, có tính ổn định cao hơn papain dạng hoạt động trong dung dịch. Không chỉ là proteza có tính chất đặc hiệu cơ chất rộng, papain còn có khả năng tự thủy phân do một phân tử papain xúc tác cho sự thủy phân một phân tử khác. Do trong thời gian tiến hành thí nghiệm, dung dich enzyme chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố khách quan như chịu ảnh hưởng của 2 yếu tố oxy trong không khí và sự tự thủy phân của papain, nên hoạt tính của các chế phẩm sẽ giảm dần theo thời gian. Theo kết quả ở bảng, hoạt tính của các chế phẩm giảm dần mỗi ngày. Sạu 5 ngày chúng tôi khảo sát thì hoạt tính của các chế phẩm giảm đi rất nhiều so với ngày đầu tiên (M0 còn 47.91%, M1: 9.4%, M2: 9.37 %, M3:7.29 %). Chế phẩm M0 giữ hoạt tính tốt hơn là do trong nhựa đu đủ còn có một số chất khác đã góp phần bảo vệ papain. Các phương pháp kết tủa thu nhận papain đã loại bỏ một số chất có trong nhựa nên độ bền của những chế phẩm còn lại kém hơn so với M0. Trên hình biểu diễn sự biến động hoạt tính của các chế phẩm theo thời gian đã cho chúng ta thấy rằng hoạt tính của chế phẩm M1 có hoạt tính cao hơn hẳn các chế phẩm khác. Lý do có thể là do phương pháp tủa muối không có ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme, phương pháp này chỉ loại đi nhiều proteaza tạp, còn lại phần lớn là papain. Cồn và aceton cũng là một dung môi hữu cơ được sử dụng rộng rãi để kết tủa proteaza nhưng phương pháp này có nhược điểm làm giảm hoat tính proteolytic, nhiều khi dẫn đến mất hoạt tính hoàn toàn. Từ những số liệu thực nghiệm cho ta có thể đánh giá rằng chế phẩm papain được tách bằng muối có hoạt tính cao hơn so với các phương pháp sử dụng dung môi hữu cơ và khá bền khi tồn tại ở dạng hoạt động. 44 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM 3.10 KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA ENZYME PAPAIN. 3.10.1. Khảo sát ảnh hƣởng của pH Tiến hành thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme ở các pH khác nhau từ 7.5 đến 9.0. Xác định hoạt tính theo phương pháp Anson, mẫu được đo độ hấp thu quang ở bước sóng 720nm. Kết quả được trình bày trong bảng 3.9 (phụ lục 20) Bảng 3.9. Hoạt tính của protein P(UI) biến đổi theo pH pH ∆OD1 ∆OD2 ∆OD P(UI/ml) 7.0 0.355 0.087 O.268 72.34 7.5 0.295 0.030 0.265 71.65 8.0 0.232 0.067 0.228 60.80 8.5 0.275 0.064 0.211 56.01 9.0 0.271 0.072 0.200 52.77 50.00 5 .00 60.0 65.00 70.00 75.00 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 pH Ho ạt tín h P (U I/m l) Hình 3.8 Hoạt tính của protein P(UI/ml) trong nhựa khô biến đổi theo pH Nhận xét: 45 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM Khi tăng dần giá trị pH lên thì đồng thời hoạt tính protein cũng tăng lên sau đó giảm xuống rất nhanh, đều này chứng tỏ rằng pH đóng một vai trò rất quan trọng cho sự tồn tại của enzyme trong môi trường do pH ảnh hưởng đến mức độ ion hóa của các enzyme và phần nào quyết định dạng tồn tại và hoạt tính của chúng. Và khi pH = 7 – 7.5 thì hoạt tính protein trong nhựa khô đạt giá trị cao nhất so với các giá trị còn lại. 3.10.2 Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ Cân 0.0224 g nhựa khô hòa tan trong 100ml nước cất. Sau đó tiến hành thí nghiệm xác định hoạt tính protein trong nhựa khô theo phương pháp Anson ở các khoảng nhiệt độ khác nhau từ nhiệt độ t = 40OC đến 90oC (với ∆t = 5OC), pH dung dịch đệm được giữ cố định ở pH = 7.6. Kết quả được trình bày trong bảng 3.10: Bảng 3.10. Hoạt tính của protein P(UI) trong nhựa khô biến đổi theo nhiệt độ t O C ∆OD1 ∆OD2 P(UI/ml) 45 0.1053 0.0646 17.728 50 0.1108 0.0652 21.276 55 0.1619 0.0559 25.844 60 0.2731 0.0659 54.957 65 0.2525 0.0718 59.178 70 0.4136 0.0702 70.560 75 0.1678 0.0415 23.758 80 0.1993 0.0532 28.059 85 0.1697 0.0559 21.075 90 0.1366 0.0486 15.524 46 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM 0 10 20 30 40 50 60 70 80 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 Nhiệt độ ( o C) Ho ạt tí nh P (U I/m l) Hình 3.9:Hoạt tính của protein trong nhựa khô theo nhiệt độ Nhận xét: Khi nhiệt độ thay đổi thì hoạt tính cũng thay đổi đáng kể theo nhiệt độ, tăng dần khi nhiệt độ tăng và đạt giá trị cực đại khi l

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdf8.pdf
  • pdf1.pdf
  • pdf2.pdf
  • pdf3.pdf
  • pdf4.pdf
  • pdf5.pdf
  • pdf6.pdf
  • pdf7.pdf
  • pdf9.pdf
  • pdf10.pdf
Luận văn liên quan