Luận văn Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc Natsol (kháng sinh thực vật) lên vi khuẩn

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN BỘ MÔN SINH HỌC VÀ BỆNH THỦY SẢN DƯƠNG VÕ MỸ HẠNH XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU (MIC) CỦA THUỐC NATSOL (KHÁNG SINH THỰC VẬT) LÊN VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri VÀ Aeromonas hydrophila LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THUỶ SẢN CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2008 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN BỘ MÔN SINH HỌC VÀ BỆNH THỦY SẢN DƯƠNG VÕ MỸ HẠNH XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU (MIC) CỦA THUỐC NATSOL (KHÁNG SINH THỰC VẬT) LÊN VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri VÀ Aeromonas hydrophila CÁN BỘ HƯỚNG DẪN TỪ THANH DUNG NGUYỄN THỊ NHƯ NGỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THUỶ SẢN CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2008 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 1 MỤC LỤC MỤC LỤC ..................................................................................................... 1 DANH SÁCH HÌNH ..................................................................................... 3 DANH SÁCH BẢNG..................................................................................... 4 LỜI CẢM TẠ ................................................................................................ 5 TÓM TẮT...................................................................................................... 6 CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU........................................................................... 7 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................... 9 2.1 Bệnh do vi khuẩn E. ictaluri gây ra ..................................................................9 2.1.1 Một số đặc điểm của vi khuẩn E. ictaluri.......................................................9 2.1.2 Phân bố của vi khuẩn E. ictaluri ....................................................................9 2.2 Bệnh do vi khuẩn Aeromonas hydrophila .......................................................10 2.2.1 Một số đặc điểm về vi khuẩn Aeromonas hydrophila ...................................10 2.2.2 Hình dạng khuẩn lạc ....................................................................................10 2.2.3 Hình dạng tế bào .........................................................................................10 2.2.4 Phân bố của Aeromonas hydrophila.............................................................11 2.2.5 Bệnh xuất huyết do vi khuẩn A. hydrophila .................................................11 2.3 Cây thảo dược ................................................................................................12 2.3.1 Sơ lược về cây thảo dược.............................................................................12 2.3.2 Một vài cây thuốc thảo dược và công dụng phòng trị bệnh thủy sản.............12 2.3.3 Một số kết quả khoa học sử dụng cây thảo dược phòng và trị bệnh thủy sản 13 2.4 Natsol.............................................................................................................14 2.5 Chloramphenicol ............................................................................................14 2.6 Một số kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trên thuốc kháng sinh thảo dược .............................................................................................................14 CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .........................................16 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu...................................................................16 3.1.1 Thời gian nghiên cứu...................................................................................16 3.1.2 Địa điểm nghiên cứu ...................................................................................16 3.2 Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................16 3.2.1 Hoá chất và môi ttrường ..............................................................................16 3.2.2 Thuốc kháng sinh ........................................................................................16 3.2.3 Dụng cụ thí nghiệm .....................................................................................16 3.2.4 Vi khuẩn thí nghiệm ....................................................................................17 3.3 Phương pháp nghiên cứu ................................................................................17 3.3.1 Chuẩn bị nguyên liệu nghiên cứu.................................................................17 3.3.1.1 Chuẩn bị vi khuẩn.....................................................................................17 3.3.1.2 Chuẩn bị dung dịch thuốc kháng sinh ......................................................18 3.3.2 Thực hiện nghiên cứu ..................................................................................20 3.3.2.1 Nghiên cứu thăm dò .................................................................................20 3.3.2.1 Phương pháp lập kháng sinh đồ ................................................................21 3.3.2.2 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trên môi trường thạch (Lila Ruangpan, 2004): ........................................................................................22 3.3.2.3 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) bằng phương pháp pha loãng (Geert Huys, 2002):..............................................................................23 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN ......................................................25 4.1 Kết quả nghiên cứu thăm dò khoảng nồng độ ức chế của thuốc kháng sinh thực vật natsol lên vi khuẩn gây bệnh trên cá tra ..........................................................25 4.2 Xác định nồng độ MIC ...................................................................................26 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 2 4.2 Kết quả kiểm tra kháng sinh đồ của thuốc natsol lên vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila............................................................................................................27 4.3 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc Natsol lên vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila bằng phương pháp pha loãng.........................................28 4.3.1 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc Natsol lên vi khuẩn A. hydrophila............................................................................................................28 4.3.2 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc Natsol lên vi khuẩn E. ictaluri .................................................................................................................30 4.2.3 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc Natsol lên vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila bằng phương pháp thạch. ..............................................32 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ...................................................35 5.1 Kết luận .........................................................................................................35 5.2 Đề xuất...........................................................................................................35 TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................36 Phụ lục A: Pha dung dịch nhuộm gram vi khuẩn.......................................41 Phụ lục B: Phương pháp nhuộm Gram vi khuẩn .......................................42 Phụ lục C: Pha môi trường ..........................................................................43 Phụ lục D: Pha nước muối sinh lý và pha môi trường NB .........................44 Phụ lục E: Pha thuốc kháng sinh chloramphenicol và natsol ....................45 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 3 DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1: Kết quả nhuộm gram vi khuẩn E. ictaluri ở vật kính 40X (gram âm – hình que) ........................................... ............................................................10 Hình 2.2: Kết quả nhuộm gram vi khuẩn A. hydrophila ở vật kính 40X (gram âm – hình que)................................... ............................................................11 Hình 4.3: Kết quả MIC trên môi trường thạch của vi khuẩn A. hydrophila (Đĩa đối chứng (trái), đĩa môi trường chứa thuốc nồng độ 375ppm (phải)).............34 Hình 4.4: Kết quả MIC trên môi trường thạch của vi khuẩn A. hydrophila (Đĩa đối chứng (trái), đĩa môi trường chứa thuốc nồng độ 750ppm (phải)).............34 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 4 DANH SÁCH BẢNG Bảng 3.1: Pha loãng nồng độ thuốc natsol cho hai chủng vi khuẩn theo phương pháp pha loãng hai lần ...................... ............................................................18 Bảng 3.2: Pha loãng nồng độ thuốc chloramphenicol cho hai chủng vi khuẩn theo phương pháp pha loãng hai lần ............................................................19 Bảng 3.3: Nuôi vi khuẩn ở các hàm lượng thuốc khác nhau (cho 1 chủng vi khuẩn) .. ............................................ ............................................................19 Bảng 3.4: Nuôi vi khuẩn ở các hàm lượng thuốc khác nhau (cho 1 chủng vi khuẩn) .. ............................................ ............................................................20 Bảng 4.1: Kết quả nghiên cứu thăm dò nồng độ ức chế tối thiểu của thuốc Natsol trên vi khuẩn E. ictaluri......... ............................................................26 Bảng 4.2: Nồng độ ức chế tối thiểu của thuốc chloramphenicol trên E. coli ...27 Bảng 4.3: Kết quả kháng sinh đồ kiểm tra độ nhạy của thuốc natsol bằng đĩa kháng sinh tự chế .............................. ............................................................28 Bảng 4.4: Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc kháng sinh natsol trên vi khuẩn A. hydrophila ở chủng CAF2 .. ............................................................29 Bảng 4.5: Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của natsol trên vi khuẩn A. hydrophila ở chủng CAF133 ............. ............................................................29 Bảng 4.6: Đọc kết quả pha loãng ống MIC số 6 và 7 ở độ pha loãng 105 trên vi khuẩn A. hydrophila .......................... ............................................................30 Bảng 4.7: Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của natsol trên vi khuẩn E. ictaluri ở chủng vi khuẩn E.3B3 ....................... ............................................................31 Bảng 4.8: Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của natsol trên vi khuẩn E. ictaluri ở chủng vi khuẩn E.223 ........................ ............................................................31 Bảng 4.9: Đọc kết quả pha loãng ống MIC số 8 và 9 ở độ pha loãng 104 trên vi khuẩn E. ictaluri................................ ............................................................32 Bảng 4.10: Kết quả MIC trên môi trường thạch trên vi khuẩn A. hydrophila với các đĩa môi trường 5, 6, 7 ứng với các nồng độ 1500; 750; 375ppm ...............32 Bảng 4.11: Kết quả MIC trên môi trường thạch trên vi khuẩn E. ictaluri với các đĩa môi trường 6, 7, 8 ứng với các nồng độ 750; 375; 187,5ppm ....................33 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 5 LỜI CẢM TẠ Tôi đặc biệt biết ơn cô Từ Thanh Dung và Nguyễn Thị Như Ngọc đã ân cần hướng dẫn và giúp đỡ tôi thực hiện nghiên cứu và hoàn thành đề tài tốt đẹp. Chân thành cảm ơn cô cố vấn học tập – cô Nguyễn Thị Thu Hằng đã nhiệt tình dạy dỗ và dẫn dắt lớp và tôi thời gian qua. Tôi xin cảm ơn tất cả thầy cô của Khoa thuỷ sản nói chung và thầy cô của Bộ môn Sinh học và bệnh thuỷ sản nói chung đã truyền dạy cho tôi những kiến thức quý giá trong suốt 4 năm học vừa qua và tạo điều kiện cho tôi thực hiện đề tài này. Cảm ơn bạn bè trong lớp cũng như bạn bè khác lớp đã tận tình trao đổi với tôi những kiến thức khiếm khuyết và giúp đỡ tôi trong học tập cũng như trong quá trình thực hiện đề tài. Tôi gởi lời cảm ơn đến gia đình, người thân đã nuôi dạy tôi và tạo điều kiện cho tôi ăn học. Tôi có được thành quả như ngày hôm nay thì không thể kể hết công ơn trời biển của cha mẹ đã dành cho tôi. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 6 TÓM TẮT Thí nghiệm thăm dò nồng độ ức chế tối thiểu của thuốc kháng sinh thực vật natsol lên vi khuẩn E. ictaluri và xác định được khoảng nồng độ ức chế của natsol lên vi khuẩn E. ictaluri là 50-100ppm. Thực hiện nghiên cứu xác định nồng độ ức chế tối thiểu của thuốc kháng sinh thực vật natsol bằng ba phương pháp:  Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) bằng phương pháp lập kháng sinh đồ, nhưng qua thí nghiệm trên thuốc natsol không cho kết luận gì.  Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) bằng phương pháp pha loãng, xác định được nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của natsol lên vi khuẩn E. ictaluri là 93,75ppm và lên vi khuẩn A. hydrophila là 375ppm.  Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) bằng phương pháp thạch, xác định được nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của natsol lên vi khuẩn E. ictaluri là 187,5ppm và lên vi khuẩn A. hydrophila là 750ppm. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 7 CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) là loài cá da trơn nước ngọt được nuôi phổ biến ở Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL). Từ những năm 1998-2000 thành công trong nghiên cứu “Quy trình kỹ thuật sinh sản nhân tạo và ương nuôi cá tra thương phẩm” của Khoa Thuỷ sản - Đại học Cần Thơ, đẩy mạnh phong trào nuôi cá tra thương phẩm phát triển ở vùng ĐBSCL, năng suất và sản lượng nuôi không ngừng tăng. Theo Dương Nhật Long (2006) thì sản lượng cá tra năm 1994 đạt 30.000 tấn, năm 2001 đạt 150.000 tấn, năm 2002 đạt 200.000 tấn, năm 2003 đạt 220.000 tấn, năm 2004 đạt trên 300.000 tấn, năm 2005 đã vượt qua 500.000 tấn. Song bên cạnh mặt thuận lợi còn tồn tại những vấn đề khó khăn, đó là tình hình bệnh trên cá tra nuôi. Trong nhiều năm qua người nuôi cá tra bị thiệt hại khá lớn do dịch bệnh xảy ra, như bệnh đốm đỏ, trắng da, phù đầu phù mắt, bệnh do ký sinh trùng ngoại ký sinh(Ferguson & ctv, 2001). Theo Lương Trần Thục Đoan (2006) bệnh trắng gan (còn gọi là bệnh mủ gan) do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri (E. ictaluri) gây ra là bệnh phổ biến, xuất hiện hầu như quanh năm ở cá tra, gây thiệt hại nghiêm trọng trong nuôi cá tra thâm canh. Mặt khác, bệnh đốm đỏ (còn gọi là bệnh xuất huyết) do vi khuẩn Aeromonas hydrophila (A. hydrophila) gây ra trên nhiều loài cá nước ngọt trong đó có cá tra nuôi (Từ Thanh Dung, 2005). Từ Thanh Dung (1996) cho rằng bệnh vi khuẩn là một vấn đề quan trọng trong nuôi trồng thuỷ sản, việc điều trị chủ yếu bằng hoá chất hoặc sử dụng thuốc kháng sinh penicillin, streptomycin, chloramphenicol, oxytetracylin, tetracylin.... Tuy nhiên sử dụng hoá chất phòng và trị bệnh vi khuẩn trong thời gian dài, đặc biệt là kháng sinh lại gặp nhiều khó khăn, như giá thành các loại thuốc kháng sinh cao, lại gây ra hiện tượng kháng thuốc của các tác nhân gây bệnh, làm giảm hiệu quả phòng và trị bệnh về sau. Thêm vào đó là vấn đề ô nhiễm môi trường nước, tích tụ dư lượng kháng sinh trong sản phẩm thuỷ sản ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm xuất khẩu, nhất là không tốt cho sức khoẻ người tiêu dùng. Theo Direkbusarakom (1995), một giải pháp phòng trị khác là sử dụng cây thảo dược điều trị bệnh vi khuẩn trong thuỷ sản, tuy hiệu quả không nhanh chóng nhưng khắc phục được những khó khăn đã gặp khi sử dụng hóa chất và thuốc kháng sinh. Vì vậy, ở Thái Lan, Trung Quốc, Ấn Độ kể cả Việt Nam, một vài cây thảo dược có sẵn trong tự nhiên được dùng làm dược phẩm cho người và gia súc, cũng được thử nghiệm làm thuốc trị bệnh trong ngành thuỷ sản (Sivarajan, 1994). Chất chiết cây đậu (Clinacanthus nutans) ức chế bệnh Yellowhead Baculovirus trên tôm sú (Penaeus monodon) Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 8 (Direkbusarakom & ctv, 1995). Theo Kamei (1988) cho rằng chiết suất thảo dược từ cây ổi (Psidium guajava) phòng trị được bệnh vi rút như IHNV, IPNV, OMV trên cá. Từ Thanh Dung (1996) đã nghiên cứu thành công ảnh hưởng của cây thảo dược lên vi khuẩn A. hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá trê lai (Clarias macrocephalus x C.gariepinus). Hiện nay vẫn chưa có nhiều tài liệu khoa học đề cập đến cách phòng trị bệnh cá tra bằng thảo dược. Vì vậy, để làm phong phú thêm cho phương pháp điều trị cũng như làm đa dạng danh mục thuốc phòng trị bệnh cho cá là lý do chính để đề tài “Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc Natsol (kháng sinh thực vật) lên vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila” được thực hiện. Mục tiêu nghiên cứu Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc Natsol lên vi khuẩn A. hydrophila và E. ictaluri. Nội dung nghiên cứu Kiểm tra nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) bằng phương pháp pha loãng và môi trường thạch trên vi khuẩn A. hydrophila và E. ictaluri. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 9 CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Bệnh do vi khuẩn E. ictaluri gây ra 2.1.1 Một số đặc điểm của vi khuẩn E. ictaluri Theo Hawke & ctv (1981) E. ictaluri là loài thuộc Enterobacteriaceace, gram âm, hình que ngắn, kích thước 0,75x1,5-2,5µm, di động yếu ở 25-300C, không di động khi nhiệt độ cao hơn. Catalase dương tính, cytochrom oxidase âm tính và lên men glucose. Không sinh H2S và indole âm tính. Vi khuẩn E. ictaluri phát triển trên môi trường TSA (trypton soya agar) chậm 36-48 giờ tại 18-280C. Giống vi khuẩn Edwardsiella còn phát triển tốt trên môi trường BHI (brain heart infusion) và môi trường TSA, vi khuẩn có dạng khuẩn lạc nhỏ màu xanh có nhân đen trên môi trường EIA (E. ictaluri agar) (Từ Thanh Dung, 2005). Hình 2.1: Kết quả nhuộm gram vi khuẩn E. ictaluri ở vật kính 40X (gram âm – hình que) 2.1.2 Phân bố của vi khuẩn E. ictaluri E. ictaluri có thể truyền bệnh qua môi trường nước, đất và các động vật khác. Vi khuẩn E. ictaluri là mầm bệnh nguyên thuỷ trong ngành nuôi cá nheo Mỹ. Bệnh do vi khuẩn E. ictaluri được chuẩn đoán ở vùng nuôi cá da trơn tại Mississippi, Arkanas, Alabana, Louisiana, Georgia và Florida. Theo Hawke & ctv (1998), bệnh cũng thường xuyên xảy ra ở Virginia, Texas, Idaho, Kentucky, California, Arizona và Maryland. Ở Việt Nam, vùng ĐBSCL bệnh mủ gan xuất hiện đầu tiên vào mùa lũ năm 1998 ở các tỉnh nuôi cá tra thâm canh phát triển mạnh như An Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ. Sau đó, bệnh lây lan sang các Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 10 vùng lân cận. Đặc biệt, những năm gần đây bệnh này cũng xuất hiện ở một số tỉnh ven biển mới phát triển nuôi cá tra như Trà Vinh, Bến Tre và Sóc Trăng (Từ Thanh Dung & ctv, 2004). Bệnh mủ gan chủ yếu xuất hiện trên cá tra (ở tất cả các giai đoạn phát triển), thỉnh thoảng xuất hiện trên cá basa. Tỷ lệ hao hụt cao ở cá tra giống, nhưng gây thiệt hại lớn nhất về kinh tế ở giai đoạn cá tra thịt cỡ 300-500g (Từ Thanh Dung & ctv, 2004). 2.2 Bệnh do vi khuẩn Aeromonas hydrophila 2.2.1 Một số đặc điểm về vi khuẩn Aeromonas hydrophila A. hydrophila là vi khuẩn gram âm hình que, được tìm thấy trong môi trường nước, gây bệnh trên động vật có xương sống máu lạnh và động vật hữu nhũ, tồn tại tự do trong nước (Ho & ctv, 1990). A. hydrophila là mầm bệnh chủ yếu của động vật thủy sản vùng nước ngọt, động vật trên cạn và kể cả con người (Bùi Quang Tề, 2006). Hình 2.2: Kết quả nhuộm gram vi khuẩn A. hydrophila ở vật kính 40X (gram âm – hình que) 2.2.2 Hình dạng khuẩn lạc A. hydrophila có thể sống đơn độc trong hầu hết các môi trường. Khuẩn lạc của vi khuẩn A