Luận văn Xác định sự hoạt hóa của Phosphatidylinositol 4-Phosphate 5-Kinase (PIP5K) A và C661 trên dòng tế bào Hela chuyển gene

Từnhững kết quảthu được, chúng tôi kết luận nhưsau: 1. Đã dòng hóa thành công cDNA mã hóa cho protein KIF2A-GD và β2-Adaptin-ear vào vector biểu hiện pVenus (1-173) N1 vàpVenus (155-238) N1. 2. Hệthống Split Venus được sửdụng đểxác định tương tác giữa các protein cho kết quả: tương tác giữa protein KIF2A-GD và PIP5KA chỉxảy ra khi PIP5KA được hoạt hóa. 3. Trong tếbào HeLa clone 3: - PIP5KA và PIP5KC661 khi được hoạt hóa bởi protein ARF6QL sẽthay đổi vịtrí biểu hiện và dẫn đến sựtái sắp xếp actin trong tếbào. - Nhân tốtăng trưởng biểu mô EGF không có khảnăng hoạt hóa PIP5KA và PIP5KC661. Nhưng nhân tốnày cảm ứng hình thành nếp gấp trên màng khi tếbào biểu hiện protein PIP5KA. Protein PIP5KC661 không tham gia quá trình hình thành nếp gấp trên màng tếbào.

pdf37 trang | Chia sẻ: tuandn | Ngày: 17/04/2013 | Lượt xem: 1355 | Lượt tải: 1download
Bạn đang xem nội dung tài liệu Luận văn Xác định sự hoạt hóa của Phosphatidylinositol 4-Phosphate 5-Kinase (PIP5K) A và C661 trên dòng tế bào Hela chuyển gene, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Chương 3: Kết quả và thảo luận. 39 Theo những kết quả nghiên cứu trước đây của phòng thí nghiệm, KIF2A và AP-2 là protein partner tương ứng của PIP5KA và PIP5KC661. Trong luận văn này, chúng tôi sử dụng vùng hình cầu của KIF2A và vùng ear của β2-AP2 như “mẫu dò” để phát hiện PIP5KA và PIP5KC661 hoạt hóa trong tế bào COS-7, HeLa clone 3. Nội dung thí nghiệm bao gồm: Tạo dòng cDNA vùng hình cầu của protein KIF2A và vùng ear của β2-AP2 vào vector pVenus (1-173) N1 và pVenus (155-238). Sau đó, kiểm tra sự biểu hiện của các protein và hiệu quả hoạt động của hệ thống Split Venus. Và xác định sự hoạt hóa của PIP5KA, PIP5KC661 và những biến đổi kiểu hình trên dòng tế bào HeLa clone 3. 3.1. Tạo dòng và kiểm tra trình tự cDNA vùng hình cầu của protein KIF2A (KIF2A-GD) và vùng ear của protein β2-Adaptin (β2-Adaptin-ear) Đầu tiên, chúng tôi tiến hành dòng hóa hai cDNA mã hóa cho hai “mẫu dò” này vào hệ thống vector biểu hiện pVenus và kiểm tra kết quả tạo dòng bằng phương pháp giải trình tự. 3.1.1. Thu nhận cDNA của KIF2A-GD và β2-Adaptin-ear bằng phương pháp PCR. 1 2 3 Hình 3.1. Kết quả điện di sản phẩm PCR cDNA của KIF2A-GD và β2-Adaptin ear từ DNA plasmid. Giếng 1: Thang 1kb (kích thước các vạch tương ứng từ trên xuống: 10 kb, 8 kb, 6 kb, 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1,5 kb, 1 kb và 500 bp); Giếng 2: sản phẩm PCR cDNA của β2-Adaptin ear; Giếng 3: sản phẩm PCR cDNA của KIF2A-GD Chương 3: Kết quả và thảo luận. 40 Để thu nhận được một lượng lớn cDNA của KIF2A-GD và β2-Adaptin-ear cần thiết cho quá trình tạo dòng, chúng tôi sử dụng phương pháp PCR nhân bản trình tự cDNA vùng hình cầu của protein KIF2A và vùng ear của protein β2- Adaptin từ hai plasmid tương ứng là pCMV5-Flag-Kif2a full length (100 ng/µl) và pDNA3-Myc- β2-Adaptin (100 ng/µl). Phản ứng PCR được thực hiện bằng enzyme PrimeSTAR (Takara), là một polymerase có tính trung thực cao và hiệu quả nhân bản lớn để hạn chế những đột biến xảy ra trong quá trình sao chép [41]. Kết quả điện di (hình 3.1- giếng 3) cho thấy sản phẩm PCR với cặp mồi KIF2A-01F và KIF2A-02B có kích thước khoảng 586 bp tương ứng với kích thước cDNA của KIF2A-GD. Giếng (2) là sản phẩm PCR có kích thước khoảng 733 bp phù hợp với kích thước cDNA của β2-Adaptin ear. Như vậy, bằng phương pháp PCR, chúng tôi đã thu nhận được hai sản phẩm cDNA của KIF2A-GD và β2-Adaptin-ear có kích thước đúng như dự đoán. 3.1.2. Dòng hóa cDNA của KIF2A-GD và β2-Adaptin-ear vào vector pVenus (1-173) N1 và pVenus (155-238) N1. Trong khuôn khổ luận văn này, chúng tôi sử dụng vector pVenus (1-173) N1 và pVenus (155-238) N1 làm vector biểu hiện trình tự mã hóa cho KIF2A-GD và β2-Adaptin-ear. Đối với vector pVenus (1-173) N1, protein được biểu hiện dưới dạng dung hợp vào đầu N của mảnh Venus gồm trình tự amino acid thứ 1 đến amino acid thứ 173 (gọi là mảnh N-Venus). Đối với vector pVenus (155-238) N1, protein được biểu hiện dưới dạng dung hợp vào đầu N của mảnh Venus gồm amino acid thứ 155 đến amino acid 238 (gọi là mảnh C-Venus). Sản phẩm PCR nói trên và plasmid pVenus (1-173) N1, pVenus (155-238) N1 được xử lí với enzyme cắt giới hạn XhoI/EcoRI và tiến hành phản ứng nối để tạo plasmid tái tổ hợp. Các plasmid tái tổ hợp được biến nạp vào chủng Ecoli DH5α, sau đó được sàng lọc trên môi trường LB có bổ sung Kanamycin (50 µg/ml). Tách chiết plasmid và sàng lọc các plasmid tái tổ hợp có mang đoạn cDNA mục tiêu Chương 3: Kết quả và thảo luận. 41 bằng phản ứng cắt với cặp enzyme XhoI/EcoRI. Đối với plasmid pVenus (1-173)- KIF2A-GD (hoặc pVenus (1-173)-β2-Adaptin-ear), khi điện di sản phẩm cắt sẽ có hai vạch có kích thước khoảng 4596 bp và 567 bp (hoặc 714 bp). Tương tự, với plasmid tái tổ hợp pVenus(155-238) có mang cDNA β2-Adaptin-ear (hoặc cDNA KIF2A-GD), kết quả sản phẩm cắt sẽ có một vạch 4313 bp tương ứng với kích thước của plasmid và một vạch 714 bp (hoặc 567 bp). Kết quả hình 3.2 cho phép xác định plasmid tái tổ hợp (2); (3); (4); (5) và (6) có mang trình tự cDNA của KIF2A-GD, các plasmid tái tổ hợp (7); Hình 3.2. Kết quả điện di phản ứng cắt sàng lọc plasmid tái tổ hợp. Giếng 1: Thang 1 kb(kích thước các vạch tương ứng từ trên xuống: 10 kb, 8 kb, 6 kb, 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1,5 kb, 1 kb và 500 bp), Giếng 2, 3, 4 và 5: các plasmid tái tổ hợp pVenus (1-173)-KIF2A-GD được xử lí với cặp enzyme XhoI/EcoRI. Giếng 6: plasmid tái tổ hợp pVenus (155-238)-KIF2A-GD được xử lí với cặp enzyme XhoI/EcoRI. Giếng 7, 8, 9 và 10: các plasmid tái tổ hợp pVenus (1-173)-β2Adaptin-ear được xử lí với cặp enzyme XhoI/EcoRI. Giếng 11, 12 và 13: các plasmid tái tổ hợp pVenus (155-238)-β2Adaptin-ear được xử lí với cặp enzyme XhoI/EcoRI 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1 Chương 3: Kết quả và thảo luận. 42 (8); (9); (10); (11); (12) và (13) có mang trình tự cDNA của β2-Adaptin-ear. Bốn plasmid tái tổ hợp (2); (6); (8) và (12) được tiến hành giải trình tự để kiểm tra. 3.1.3. Kết quả giải trình tự Chúng tôi sử dụng mồi pEGFP #F bao ngoài vùng KIF2A-GD và β2- Adaptin-ear trên plasmid pVenus (1-173) N1 và pVenus (155-238) N1 để giải trình tự các plasmid tái tổ hợp nói trên. Kết quả so sánh trình tự thu được với trình tự trên ngân hàng gene (NCBI) bằng phần mềm ClustalX như sau: Hình 3.3. Kết quả giải trình tự plasmid pVenus (1-173) KIF2A-GD và so sánh với trình tự NM 00844.2 trên ngân hàng dữ liệu NCBI bằng phần mềm ClustalX. Linker Venus (1-173) Chương 3: Kết quả và thảo luận. 43 Dựa vào kết quả so sánh trên hình 3.3 và 3.4, chúng tôi kết luận trình tự gene KIF2A-GD thu được tương đồng hoàn toàn (99,9 %) với trình tự NM 00844.2 trên ngân hàng dữ liệu NCBI. Tại vị trí Nucleotide thứ 142 xuất hiện một đột biến A thành G, tuy nhiên đột biến này không làm thay đổi trình tự amino acid của protein KIF2A-GD vì cả hai codon GTA và GTG đều mã hóa cho Valine. Hình 3.4. Kết quả so sánh trình tự plasmid pVenus (155-238) KIF2A-GD và so sánh với trình tự NM 00844.2 trên ngân hàng dữ liệu NCBI bằng phần mềm ClustalX. Linker Venus (155-238) Chương 3: Kết quả và thảo luận. 44 Như vậy, cDNA KIF2A-GD đã được gắn chèn đồng khung vào plasmid pVenus (1-173) N1 và pVenus (155-238) N1. Hình 3.5 và 3.6 là kết quả giải trình tự plasmid pVenus (1-173) và pVenus (155-238) tái tổ hợp có mang đoạn chèn β2-Adaptin-ear. Kết quả so sánh sắp gióng cột cho thấy cDNA của β2-Adaptin-ear chúng tôi thu nhận hoàn toàn tương đồng Linker Hình 3.5. Kết quả giải trình tự plasmid pVenus (1-173) β2Adaptin-ear và so sánh với trình tự M34175.1 trên ngân hàng dữ liệu NCBI bằng phần mềm ClustalX. Chương 3: Kết quả và thảo luận. 45 (99,9 %) với trình tự mang mã số M34175.1 trên ngân hàng gene và đã được gắn chèn đồng khung. Khi so sánh trình tự linker (là trình tự nằm giữa gene mục tiêu của chúng tôi và gene mã hóa cho mảnh N-Venus) của plasmid pVenus (1-173) tái tổ hợp (hình 3.3 và hình 3.5) với trình tự linker của plAasmid pVenus (1-173) N1 [phụ lục], Hình 3.6. Kết quả giải trình tự plasmid pVenus (155-238) β2Adaptin-ear và so sánh với trình tự M34175.1trên ngân hàng dữ liệu NCBI bằng phần mềm ClustalX. Linker Chương 3: Kết quả và thảo luận. 46 chúng tôi nhận thấy có sự thay đổi ở codon thứ 2 (CCG thành CCT). Vì hai codon CCG và CCT đều mã hóa cho acid amin Proline nên đột biến này không ảnh hưởng đến khung dịch mã của linker và mảnh N-Venus. Tóm lại, chúng tôi đã dòng hóa thành công lần lượt cDNA KIF2A-GD và β2-Adaptin-ear vào hai vector biểu hiện pVenus (1-173) N1 và pVenus (155-238). Hai cDNA này được thu nhận chính xác và tạo dòng vào đúng vị mong muốn là gắn vào đầu 5’của trình tự mã hóa cho protein mảnh N-Venus và mảnh C-Venus thông qua một linker. 3.2. Kiểm tra sự biểu hiện của các protein và hiệu quả hoạt động của hệ thống Split Venus. COS-7 là dòng tế bào nguyên bào sợi thận khỉ xanh Châu Phi mang trình tự DNA của virus SV40, được sử dụng như là tế bào chủ trong quá trình chuyển gene vào tế bào động vật [43]. Trong khuôn khổ đề tài này, chúng tôi sử dụng phương pháp chuyển gene tạm thời, plasmid sau khi được chuyển vào trong tế bào sẽ không sáp nhập vào bộ gene của tế bào chủ mà tồn tại ở dạng episome, có thể tự sao chép và biểu hiện độc lập, tuy nhiên thời gian tồn tại của những gene này ngắn. Chúng tôi đồng chuyển các plasmid tái tổ hợp nói trên và plasmid pVenus (1-173); pVenus (155-238) mang gene mã hóa cho protein PIP5KA và PIP5KC661 vào tế bào COS-7 để kiểm tra sự biểu hiện của protein dựa vào tín hiệu huỳnh quang. Sơ đồ đồng chuyển các plasmid được trình bày ở bảng 2.1 và bảng 2.2 (chương 2-Vật liệu và phương pháp). 3.2.1. Kết quả kiểm tra sự biểu hiện bằng kính hiển vi huỳnh quang. Protein Venus có bước sóng kích thích tối ưu là 515 nm và bước sóng phát ra tương ứng là 528 nm [32]. Tuy nhiên do điều kiện của phòng thí nghiệm, chúng tôi chỉ có thể quan sát tín hiệu huỳnh quang của protein Venus ở bước sóng kích thích là 488 nm và phát ra ở bước sóng 507 nm. Hai bước sóng này vẫn nằm trong ngưỡng kích thích và phát ra của protein Venus. Chương 3: Kết quả và thảo luận. 47 Các plasmid đồng chuyển pVenus (1-173) và pVenus (155-238) hoạt động theo nguyên tắc của hệ thống BIFC, nghĩa là tín hiệu huỳnh quang phát ra khi hai protein dung hợp vào mảnh N và mảnh C của protein Venus tương tác với nhau. Kết quả hình 3.7 cho thấy vùng hình cầu của protein KIF2A chỉ tương tác với protein PIP5KA mà không tương tác với protein PIP5KC661. Điều này phù hợp với kết quả trước đó của nhóm chúng tôi khi sử dụng lai kép hai hệ thống (two-hybrid system) trên hai protein này (Nakano và cs). Và tương tác này chỉ xảy ra trong môi trường có bổ sung huyết thanh (FBS 10 %) hoặc có sự hiện diện của protein ARF6 QL (hình 3.7 A1, A3, A4, B1, B3 và B4) [21][30]. Thành phần chính của huyết thanh là hormone, nhân tố tăng trưởng. Những nhân tố này đã được chứng minh tham gia vào quá trình hoạt hóa phân tử PIP5K, làm tăng mức độ PIP2 tại màng tế bào [24]. Protein ARF6 cũng là nhân tố trực tiếp hoạt hóa PIP5K [21]. Như vậy, chúng tôi có thể kết luận KIF2A-GD chỉ gắn lên protein PIP5KA khi protein này được hoạt hóa. Tín hiệu huỳnh quang cũng được ghi nhận khi biểu hiện đồng thời vùng ear của tiểu phần β2-Adaptin và protein PIP5KC trong tế bào COS-7 (hình 3.8) nhưng không được ghi nhận trong trường hợp đồng biểu hiện KIF2A-GD và PIP5KC661; hay β2-Adaptin-ear và PIP5KA (hình 3.7 C và 3.8 C). Như đã nói trên, protein KIF2A chỉ tương tác với PIP5KA, tiểu phần β2 của AP-2 tương tác đặc hiệu với PIP5KC661. Vì vậy, kết quả hình 3.7 và 3.8 cho thấy hệ thống hai plasmid pVenus của chúng tôi hoạt động ổn định và 4 plasmid tái tổ hợp được tạo dòng ở trên được biểu hiện trong tế bào COS-7. Ngoài ra, kết quả hình 3.7 và 3.8 cho phép xác định vị trí biểu hiện của PIP5KA và PIP5KC661. PIP5KA chủ yếu tập trung ở nhân và khu vực quanh nhân, PIP5KC661 biểu hiện trong nhân và rải rác trong tế bào chất của COS-7. Trường hợp tế bào COS-7 được chuyển gene mã hóa cho protein ARF6 QL, chúng tôi nhận thấy có sự thay đổi vị trí biểu hiện của PIP5KA và PIP5KC661, hai protein này tập trung chủ yếu tại những khu vực gần màng tế bào. Chương 3: Kết quả và thảo luận. 48 Hình 3.7. Kết quả tương tác của protein KIF2A-GD và protein PIP5KA trong tế bào COS-7 với các điều kiện khác nhau A1, A2, A3 và A4: tế bào được đồng chuyển plasmid (1-173) N1- KIF2A-GD-(155-238) C1- PIP5KA. B1, B2, B3 và B4: tế bào được đồng chuyển plasmid (155-238) N1- KIF2A-GD-(1-173) C1- PIP5KA. C: tế bào được đồng chuyển plasmid (1-173) N1- KIF2A-GD-(155-238) C1- PIP5KC661. A1, A3, B1, B3 và C: hai protein tương tác trong điều kiện có huyết thanh FBS 10 %. A2, A4, B2 và B4: hai protein tương tác trong điều kiện không có huyết thanh FBS 10 %. A3, A4, B3 và B4: hai protein tương tác trong điều kiện có protein ARF6 QL. Thanh tỉ lệ kích thước: 5 µm + ARF6 QL A1 A2 A3 B1 B2 B3 B4 C A4 Chương 3: Kết quả và thảo luận. 49 Hình 3.8. Kết quả tương tác của protein β2 AP2-ear và protein PIP5KC661 trong tế bào COS-7 với các điều kiện khác nhau A1, A2, A3 và A4: tế bào được đồng chuyển plasmid (1-173) N1- β2 AP2-ear -(155-238) C1- PIP5KC661. B1, B2, B3 và B4: tế bào được đồng chuyển plasmid (155-238) N1- β2 AP2-ear -(1-173) C1- PIP5K C661. C: tế bào được đồng chuyển plasmid (1-173) N1- β2 AP2-ear -(155-238) C1- PIP5KA. A1, A3, B1, B3 và C: hai protein tương tác trong điều kiện có huyết thanh FBS 10 %. A2, A4, B2 và B4: hai protein tương tác trong điều kiện không có huyết thanh FBS 10 %. A3, A4, B3 và B4: hai protein tương tác trong điều kiện có protein ARF6 QL. Thanh tỉ lệ kích thước: 5 µm. + ARF6 QL A1 A3 A4 A2 B1 B3 B2 B4 C Chương 3: Kết quả và thảo luận. 50 3.2.2. Kết quả xác định hiệu quả biểu hiện của các cặp plasmid Bên cạnh đó, chúng tôi xác định phần trăm (%) tế bào phát huỳnh quang nhằm so sánh hiệu quả biểu hiện của các cặp plasmid. Đồ thị hình 3.9 cho thấy trong cùng một điều kiện (trong môi trường có 10 % FBS hoặc có sự hiện diện của ARF6 QL), trường hợp đồng chuyển plasmid pVenus (1-173) N1-KIF2A-GD và pVenus (155-238) C1-PIP5KA có số lượng tế bào phát huỳnh quang cao hơn trường hợp chuyển hai plasmid pVenus (155-238) N1-KIF2A-GD và pVenus (1- 173) C1-PIP5KA. Chúng tôi thu được kết quả tương tự (hình 3.10) đối với trường hợp biểu hiện đồng thời protein β2-Adaptin-ear và PIP5KC661 trong tế bào COS-7. Khi có sự hiện diện của protein ARF6 QL số lượng protein PIP5KA và PIP5KC661 được hoạt hóa nhiều hơn thể hiện qua phần trăm tế bào phát huỳnh quang. Hình 3.9. Đồ thị thể hiện phần trăm tế bào phát huỳnh quang khi đồng chuyển các plasmid mang trình tự mã hóa cho PIP5KA và KIF2A-GD vào tế bào COS-7 ST: kí hiệu tế bào được nuôi trong môi trường D’MEM 0 % FBS Chương 3: Kết quả và thảo luận. 51 Dựa vào kết quả đồ thị 3.9 và 3.10, chúng tôi chọn cặp plasmid tương ứng sau để xác định PIP5KA và PIP5KC661 tương ứng được hoạt hóa ở tế bào HeLa clone 3: 3.3. Xác định sự hoạt hóa của PIP5KA và PIP5KC661 trên dòng tế bào HeLa clone 3. Chúng tôi tiến hành xác định ảnh hưởng của nhân tố tăng trưởng biểu mô EGF và protein ARF6 QL đối với sự hoạt hóa PIP5KA, PIP5KC661 cũng như những biến đổi kiểu hình tương ứng trên dòng tế bào HeLa clone 3. pVenus(1-173)N1-KIF2A-GD pVenus(155-238)C1-PIP5KA và pVenus(1-173)N1-β2-Adaptin-ear pVenus(155-238)C1-PIP5KC661 Hình 3.10. Đồ thị thể hiện phần trăm tế bào phát huỳnh quang khi đồng chuyển các plasmid mang trình tự mã hóa cho PIP5KC661 và β2-Adaptin- ear vào tế bào COS-7 ST: kí hiệu tế bào được nuôi trong môi trường D’MEM 0 % FBS Chương 3: Kết quả và thảo luận. 52 3.3.1. Kết quả biến đổi kiểu hình của tế bào HeLa clone 3 khi được kích thích bởi nhân tố tăng trưởng biểu mô EGF. Nhân tố tăng trưởng biểu mô EGF đóng vai trò quan trọng trong quá trình tăng sinh và biệt hóa của tế bào. Khi nhân tố này gắn vào thụ thể tương ứng của nó (EGFR) trên màng tế bào sẽ khởi động các con đường truyền tín hiệu [7]. Ở tế bào HeLa khi được kích thích bởi nhân tố tăng trưởng biểu mô EGF, PIP5KB cùng với protein ARF6 tham gia vào quá trình tạo nếp gấp trên màng (membrane ruffle) [17]. Protein ARF6 là một protein G, thuộc họ protein ARF. Protein này được hoạt hóa khi gắn với GTP và bất hoạt khi gắn với GDP. Khi được hoạt hóa bởi nhân tố trao đổi guanine (GEF), ARF6-GTP trực tiếp hoạt hóa PIP5K, dẫn đến quá trình tạo protein PIP2, theo sau đó là những biến đổi trên màng tế bào và hoạt động của actin [21]. Sự di chuyển của tế bào (cell migration) có vai trò quan trọng trong việc tái tạo mô, đáp ứng viêm, ung thư và di căn. Quá trình này gồm nhiều bước, bắt đầu với việc hình thành cấu trúc lamellipodia, filopodia, tiếp đến là kết dính các chất bên trong tế bào và cuối cùng giải phóng các chất này. Khi quá trình di chuyển của tế bào bị hạn chế do lamellipodia không được tạo ra không hiệu quả, những nếp gấp trên màng sẽ được hình thành. Những nếp gấp này sau đó tham gia tái sắp xếp lại actin [4][22]. Để so sánh tác động của nhân tố tăng trưởng biểu mô EGF đối với PIP5KA và PIP5KC661, chúng tôi tiến hành đồng chuyển các cặp plasmid trên vào dòng tế bào HeLa clone 3 kích thích tế bào bằng nhân tố này (100 ng/ml) trong thời gian 5 phút. Sự sắp xếp của F-actin trong tế bào được xác định bằng cách nhuộm tế bào với Alexa Fluor 568 (Invitrogen) Kết quả hình 3.11 cho thấy nếp gấp trên màng chỉ được hình thành ở tế bào biểu hiện PIP5KA mà không có ở tế bào biểu hiện PIP5KC661. Đồng thời PIP5KA cũng định vị tại những nếp gấp trên màng khi tế bào được kích thích bởi EGF (hình 3.11 – A2). Vị trí biểu hiện của PIP5KC661 và sự sắp xếp actin trong tế bào này không thay đổi trong trường hợp tế bào được kích thích bởi EGF (hình 3.11 – B2). Chương 3: Kết quả và thảo luận. 53 Theo công trình của Doughman và cs (2003), PIP5KA và Rac1 khi biểu hiện đồng thời cũng cảm ứng hình thành những nếp gấp trên màng tế bào trong nguyên bào sợi sarcoma xương ở người MG-63 khi có nhân tố tăng trưởng tiểu cầu (platelet- derived growth - PDGF) kích thích [11]. Trong điều kiện bình thường của tế bào, quá trình hoạt hóa và bất hoạt ARF6 xảy ra thuận nghịch. Khi tế bào HeLa clone 3 được kích thích bởi EGF, protein ARF6 nội bào được hoạt hóa, tác động đến hoạt động của PIP5KA, quá trình polymer hóa actin xảy ra và hình thành nếp gấp trên màng tế bào. Nhưng ARF6 cũng có thể bị bất hoạt bởi các protein thủy giải liên kết GTP-ARF6 bên trong tế bào. Vì vậy, membrane ruffle chỉ được hình thành trong thời gian ngắn [6][17]. Như vậy, chúng tôi có thể kết luận hoạt động của PIP5KA liên quan đến sự hình thành nếp gấp trên màng khi tế bào nhận được các kích thích, trong khi đó, hoạt động của protein PIP5KC661 không bị ảnh hưởng. 3.3.2. Kết quả biến đổi kiểu hình của tế bào HeLa clone 3 khi protein ARF6 QL biểu hiện vượt mức. Protein ARF6 QL được sử dụng trong đề tài này là dạng đột biến của ARF6, đột biến này kháng lại quá trình thủy giải GTP thành GDP [20]. Tương tự kết quả trên dòng tế bào COS-7, PIP5KA và PIP5KC661 đều di chuyển đến vị trí gần màng tế bào chỉ khi có sự hiện diện của protein ARF6 đã được hoạt hóa (ARF6 QL). Kết quả nhuộm F-actin cũng cho thấy các sợi actin tập trung ngay tại vị trí biểu hiện của PIP5KA và PIP5KC661 (hình 3.12). Nghiên cứu của Brown và cộng sự (2001) cho thấy khi đồng chuyển gene mã hóa protein ARF6 QL và gene mã hóa protein PIP2 vào tế bào HeLa, protein PIP2 biểu hiện và tích lũy thành “cụm”, những “cụm” này được bao phủ bởi actin. Kết quả kiểu hình tương tự ở dòng tế bào COS sau 18 giờ chuyển gene mã hóa protein ARF6 QL, số lượng và kích thước của các “cụm” PIP2 tăng lên ở thời điểm 40 phút sau đó [6]. Chương 3: Kết quả và thảo luận. 54 A2 PIP5KA F-actin PIP5KA F-actin A1 B1 B2 PIP5KC661 PIP5KC661 F-actin F-actin Hình 3.11. Kết quả sắp xếp của actin trong tế bào HeLa clone 3 khi kích thích bởi EGF và mẫu chứng “PIP5KA”: kí hiệu tế bào HeLa clone 3 được đồng chuyển plasmid (1-173) KIF2A-GD và (155-238) PIP5KA. “PIP5KC661”: kí hiệu tế bào HeLa clone 3 được đồng chuyển plasmid (1-173) β2-Adaptin-ear và (155-238) PIP5KC661. “F-actin”: kí hiệu kết quả nhuộm actin của tế bào bằng Alexa Fluor 568. A1 và B1: tế bào không bị kích thích bởi EGF; A2 và B2: tế bào bị kích thích bởi EGF trong 5 phút. Thanh tỉ lệ kích thước: 10 µm. “ “: vị trí membrane ruffle. Chương 3: Kết quả và thảo luận. 55 3.3.2. Kết quả định lượng cường độ huỳnh quang trên dòng tế bào HeLa clone 3. Để xác định ảnh hưởng của EGF và ARF6QL lên sự hoạt hóa của PIP5KA và PIP5KC661, chúng tôi sử dụng phần mềm Image J (NIH) để tính toán cường độ huỳnh quang trên dòng tế bào HeLa clone 3 khi có sự hiện diện của nhân tố tăng Hình 3.12. Kết quả sắp xếp actin trong tế bào HeLa

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdf6.pdf
  • pdf0.pdf
  • pdf1.pdf
  • pdf2.pdf
  • pdf3.pdf
  • pdf4.pdf
  • pdf5.pdf
  • pdf7.pdf
  • pdf8.pdf
  • pdf9.pdf
Luận văn liên quan