Luận văn Xây dựng quy trình phát hiện đột biến rta181v/t và rtn236t kháng adefovir của virus viêm gan b (hepatitis b virus) bằng kỹ thuật real - Time pcr

Viêm gan (VG) còn gọi là sưng gan, là một tình trạng bệnh lý phổ biến do thương tổn ở tế bào gan. Có nhiều nguyên nhân gây ra VG như: vi khuẩn, rượu, hóa chất và một vài loại thuốc cũng như vô số loại virus, trong đó có virus viêm gan B (VRVGB) [20]. VRVGB hay Hepatitis B virus (HBV) là một trong những virus tiêu biểu của họ Hepadnaviridae, một họ gây VG cho nhiều loài động vật. HBV lây truyền qua đường máu, đường tình dục, từ mẹ sang con, qua tiếp xúc, Quá trình nhiễm bệnh của HBV kéo dài, diễn tiến nặng, tỷ lệ tử vong cao. Theo ước tính của Tổ chức Y tế Thế Giới (WHO) có hơn 2 tỷ người trên thế giới nhiễm HBV trong thời điểm nào đó của cuộc đời, hơn 350 triệu người mang HBV mạn, trong đó 60 triệu người chết vì ung thư tế bào gan và 45 triệu người chết vì xơ gan [6]. Đến năm 2004, số người nhiễm HBV trên toàn cầu đã tăng lên 400 triệu người [28]. Vì vậy, nhiễm VRVGB mạn tính được xem như một vấn đề y tế mang tính chất toàn cầu. Việt Nam là một quốc gia thuộc vùng nội dịch của bệnh với tỷ lệ nhiễm VRVGB mạn tính vào khoảng 15-20% dân số, nghĩa là có trên 10 triệu trong tổng số khoảng 80 triệu người bị nhiễm VRVGB [8]

pdf99 trang | Chia sẻ: duongneo | Ngày: 28/07/2017 | Lượt xem: 753 | Lượt tải: 2download
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Luận văn Xây dựng quy trình phát hiện đột biến rta181v/t và rtn236t kháng adefovir của virus viêm gan b (hepatitis b virus) bằng kỹ thuật real - Time pcr, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH ٭٭٭٭    ٭٭٭٭ LÊ THỊ DUNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN rtA181V/T VÀ rtN236T KHÁNG ADEFOVIR CỦA VIRUS VIÊM GAN B (Hepatitis B Virus) BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR Chuyên ngành: Vi Sinh Vật Học Mã số: 60 40 60 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS. TS. CAO MINH NGA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2010 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết của đề tài: Viêm gan (VG) còn gọi là sưng gan, là một tình trạng bệnh lý phổ biến do thương tổn ở tế bào gan. Có nhiều nguyên nhân gây ra VG như: vi khuẩn, rượu, hóa chất và một vài loại thuốc cũng như vô số loại virus, trong đó có virus viêm gan B (VRVGB) [20]. VRVGB hay Hepatitis B virus (HBV) là một trong những virus tiêu biểu của họ Hepadnaviridae, một họ gây VG cho nhiều loài động vật. HBV lây truyền qua đường máu, đường tình dục, từ mẹ sang con, qua tiếp xúc, Quá trình nhiễm bệnh của HBV kéo dài, diễn tiến nặng, tỷ lệ tử vong cao. Theo ước tính của Tổ chức Y tế Thế Giới (WHO) có hơn 2 tỷ người trên thế giới nhiễm HBV trong thời điểm nào đó của cuộc đời, hơn 350 triệu người mang HBV mạn, trong đó 60 triệu người chết vì ung thư tế bào gan và 45 triệu người chết vì xơ gan [6]. Đến năm 2004, số người nhiễm HBV trên toàn cầu đã tăng lên 400 triệu người [28]. Vì vậy, nhiễm VRVGB mạn tính được xem như một vấn đề y tế mang tính chất toàn cầu. Việt Nam là một quốc gia thuộc vùng nội dịch của bệnh với tỷ lệ nhiễm VRVGB mạn tính vào khoảng 15-20% dân số, nghĩa là có trên 10 triệu trong tổng số khoảng 80 triệu người bị nhiễm VRVGB [8]. Các thuốc đặc hiệu dùng để điều trị cho người mang HBV mạn tính gồm hai loại là thuốc uống và thuốc tiêm. Thuốc tiêm gồm Interferon alfa-2b và PEG Interferon alfa-2a, đây là loại thuốc vừa ức chế siêu vi vừa tăng cường miễn dịch nhưng đắt tiền và nhiều tác dụng phụ. Còn thuốc uống gồm Lamivudine (LAM), Adefovir dipivoxil (ADV), Entecavir (ETV) và Tenofovir (TDF)... được Cơ quan Quản lý Thực – Dược Hoa Kỳ (FDA) chấp thuận cho sử dụng. Ở Việt Nam hiện nay, ADV và LAM được sử dụng chủ yếu trong điều trị cho bệnh nhân viêm gan B mãn tính. ADV có tác dụng ức chế VRVGB chậm hơn, song vẫn hiệu quả với siêu vi đã kháng LAM. Do vậy, trong điều trị người ta thường kết hợp ADV khi bắt đầu có hiện tượng virus kháng LAM. Hiện tượng kháng ADV, mặc dù xuất hiện muộn và ít thường xuyên hơn nhưng cũng có thể tìm thấy khoảng trên 28% ở những bệnh nhân được điều trị sau 5 năm [26,29,39]. Asparagine (N) được thay bởi Threonine (T) tại codon 236 trên vùng RT (rtN236T) và alanine (A) được thay bằng Valine (V) hoặc Threonine (T) tại codon 181 trên vùng RT (rtA181V/T) được nhận biết là kháng ADV [38]. Trên thực tế, có nhiều phương pháp khác nhau để phát hiện đột biến như phương pháp dựa vào kiểu hình, phương pháp dựa vào kiểu gen. Phương pháp dựa vào kiểu gen bao gồm phương pháp lai mẫu dò Southern blot (Southern, 1975), giải trình tự trực tiếp, tạo dòng, RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism - Tính đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn), Oligonucleotide Microarrays, PCR (Polymerase Chain Reaction - Phản ứng tổng hợp chuỗi bằng polymerase; Karl Mullis và cộng sự, 1985), phương pháp real-time PCR, và mỗi phương pháp đều có ưu, nhược điểm riêng. Tuy nhiên, do tính ưu việt của phương pháp real-time PCR là một kỹ thuật hoàn toàn mở, nhanh, nhạy, chính xác, không lệ thuộc vào các hãng sản xuất kít ở nước ngoài, giá thành rẻ hơn, nên chúng tôi chọn real- time PCR để phát hiện các đột biến kháng ADV ở HBV trong huyết thanh của những bệnh nhân viêm gan B mãn. Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn, chúng tôi chọn đề tài “Xây dựng quy trình phát hiện đột biến rtA181V/T và rtN236T kháng Adefovir của virus viêm gan B (Hepatitis B Virus) bằng kỹ thuật real- time PCR”, nhằm phát hiện nhanh các đột biến kháng thuốc, với giá thành thấp sẽ có ý nghĩa trong công tác theo dõi và điều trị bệnh viêm gan siêu vi B. Mục đích của đề tài: Xây dựng quy trình xác định các đột biến kháng thuốc Adefovir của HBV tại rtA181V/T và rtN236T bằng kỹ thuật real-time PCR sử dụng TaqMan probe, chi phí thấp để phát triển thành kit phục vụ quá trình điều trị viêm gan siêu vi B trong tương lai. Đối tượng nghiên cứu: Những bệnh nhân VGB mạn đã và đang được điều trị bằng ADV. Phạm vi nghiên cứu: Các phòng thí nghiệm, các trung tâm xét nghiệm và các bệnh viện thuộc địa bàn thành phố Hồ Chí Minh (Bệnh viện Đại học Y Dược, Trung tâm Y khoa Medic, Phòng thí nghiệm Công ty Việt Á...). Ý nghĩa và tính mới về khoa học và thực tiễn của đề tài: Trong những năm gần đây, ở Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu của các bệnh viện và cơ sở y tế ứng dụng phương pháp giải trình tự và PCR để phát hiện các đột biến kháng thuốc của HBV ở những bệnh nhân viêm gan B mãn đã và đang được điều trị, trong đó có đột biến kháng ADV tại vị trí rtA181T/V và rtN236T. Tuy nhiên, giá thành cho mỗi mẫu xét nghiệm bằng giải trình tự là khá cao. Do vậy, có một quy trình xác định kháng Adefovir tại rtA181T/V và rtN236T đơn giản, chính xác, giá thành thấp là rất cần thiết. Để đáp ứng nhu cầu đó, chúng tôi xây dựng kỹ thuật real-time PCR nhằm phát hiện đột biến kháng Adefovir và đây là công trình chưa từng được công bố trước đây tại Việt Nam. Bố cục của đề tài: Mở đầu Chương 1 – Tổng quan tài liệu Chương 2 – Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu Chương 3 – Kết quả và thảo luận Chương 4 – Kết luận và kiến nghị Tài liệu tham khảo Phụ lục. CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 1.1.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước Bệnh VGB (VG huyết thanh) là một bệnh nhiễm trùng phổ biến trên toàn thế giới với nhiều con đường lây truyền khác nhau. Châu Á và châu Phi là những khu vực có tỷ lệ nhiễm bệnh cao nhất (khoảng 180 triệu dân châu Á và châu Phi đang mang mầm bệnh, chiếm 80% trong tổng số 220 triệu người mang mầm bệnh trên toàn thế giới) [20]. Một số bệnh nhân đã nhiễm HBV sau khi lành bệnh vẫn còn mang mầm bệnh trong một thời gian dài, một số khác trở thành VG mạn tính kéo dài nhiều năm hay suốt đời, dẫn đến xơ gan, ung thư tế bào gan. Do vậy, nhiễm HBV được xem là một vấn đề sức khỏe toàn cầu. Theo Dieter Glebe và cộng sự [26,44], HBV được xếp vào 8 kiểu gen A, B, C, D, E, F, G, H phân bố tùy theo vùng địa dư. Kiểu gen B và C chủ yếu ở khu vực Đông Nam Á, trong đó có Việt Nam. Theo Perrillo và cộng sự [34], ADV là chất tương tự nucleoside/tide, được FDA chấp thuận sử dụng trong điều trị những bệnh nhân mang HBV mạn tính từ năm 2005. Nó đóng vai trò như chất ức chế lên vùng reverse transcriptase (RT) của gen HBV polymerase, và trong tất cả các trường hợp đã hoàn toàn làm giảm nồng độ của virus. Tuy nhiên, chất ức chế này chủ yếu tác động vào sự nhân lên của virus làm cho virus không thể tăng lên được chứ không tiêu diệt virus bằng cách phá hủy cấu trúc của virus đã được hình thành theo Pawlotsky và cộng sự [33]. Đây là nguyên nhân của sự xuất hiện các đột biến kháng thuốc của HBV dẫn đến điều trị thất bại và diễn tiến xấu của bệnh. Hiện tượng kháng ADV, mặc dù xuất hiện muộn và ít thường xuyên hơn nhưng cũng có thể tìm thấy khoảng trên 28% ở những bệnh nhân được điều trị sau 5 năm trong các nghiên cứu của Hadziyannis và cộng sự (2005) [27], Lok và cộng sự (2007) [30], Westland và cộng sự (2003) [40]. Theo Villet và cộng sự (2008) [39], Lok và cộng sự (2007) [30], Pawlotsky và cộng sự (2008) [33], các đột biến chính dẫn đến hiện tượng kháng ADV của HBV trong điều trị tại vị trí rt181 và rt236 thuộc dạng đột biến điểm thay thế nucleotide này thành nucleotide khác, làm biến đổi acide amine này thành acide amine khác. Hiện nay, có nhiều phương pháp phát hiện đột biến kháng ADV của HBV như giải trình tự, lai mẫu dò (line probe assay – LiPA), PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism – Tính đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn), PCR (có thể kết hợp với giải trình tự), real-time PCR (PCR định lượng) Tuy nhiên, mỗi phương pháp đều có ưu, nhược điểm riêng. PCR kết hợp với giải trình tự có công trình của Yan J. và cộng sự (2006) [39] với độ nhạy là 103 bản sao/l. Chen J.J. và cộng sự (2008) [25] sử dụng phương pháp PCR-RFLP phát hiện được virus mang đột biến rtN236T trong thời gian điều trị bằng ADV từ 0-8 tháng. Bộ kit INNO-LiPA HBV DR v2 (Innogenetics, 2006) sử dụng mẫu dò đặc hiệu với nhiều vị trí đột biến kháng ADV và LAM. Theo Carla Osiowy và cộng sự (2006) [24], Munira Hussain và cộng sự (2006) [31], bộ kit này có độ đặc hiệu cao, phát hiện sớm các đột biến và có độ nhạy cao hơn so với phương pháp giải trình tự chuỗi. Ưu điểm là cùng lúc có thể phát hiện được nhiều đột biến, thao tác kỹ thuật dễ thực hiện nhưng giá thành quá đắt không phù hợp trong phát hiện và chẩn đoán, phục vụ cho quá trình theo dõi và điều trị nhiễm HBV mạn tính ở Việt Nam. Trong công trình nghiên cứu của mình, Julien Lupo và cộng sự (2009) [28] đã chứng tỏ rằng việc phát hiện đột biến kháng ADV và LAM bằng phương pháp real-time PCR có độ nhạy cao hơn cả so với phản ứng lai mẫu dò (sử dụng bộ kit INNO-LiPA DR v2, Innogenetics) và giải trình tự. Bằng cách pha trộn chủng đột biến và chủng hoang dại, real-time PCR với mẫu dò phát huỳnh quang có khả năng phát hiện 0,1% bản sao mang đột biến trong tổng số 105 bản sao. Phương pháp này có ưu điểm là định lượng được nồng độ virus mang đột biến trong quần thể nên giúp hiểu rõ hơn sự phát triển tự nhiên của các dạng virus kháng thuốc trong suốt quá trình điều trị. 1.1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước Việt Nam nằm trong vùng dịch lưu hành cao với tỷ lệ nhiễm HBV trong cộng đồng từ 10-20% dân số [6,20]. Trong một số nghiên cứu y học [1,9], ở Việt Nam, HBV có 3 kiểu gen A, B và C. Trong đó, hai kiểu gen B và C là chủ yếu. Hiện nay, ở Việt Nam, ADV và LAM được sử dụng chủ yếu trong điều trị cho bệnh nhân viêm gan B mãn tính. ADV có tác dụng ức chế VRVGB chậm hơn, song vẫn hiệu quả với siêu vi đã kháng LAM. Do vậy, trong điều trị người ta thường kết hợp ADV khi bắt đầu có hiện tượng virus kháng LAM. Hiệu quả điều trị bằng ADV là không thay đổi với các kiểu gen (genotype) của HBV. Hiện tượng kháng ADV của HBV ở những bệnh nhân mạn tính trong thời gian điều trị thường xuất hiện chậm với tỷ lệ thấp. Thế nhưng một khi đột biến mới xuất hiện, nó sẽ nhân lên trong quần thể và ảnh hưởng không nhỏ đến quá trình chẩn đoán và chi phí điều trị. Các phương pháp áp dụng phát hiện các dạng đột biến kháng thuốc của HBV hiện nay là PCR, giải trình tự, PCR-RFLP, real-time PCR Một số cơ sở y tế hiện đang sử dụng một số bộ kit của nước ngoài kết hợp với giải trình tự bằng hệ thống máy tự động. LAM (1998) được FDA chấp thuận đưa vào sử dụng điều trị sớm hơn so với ADV (2002), do vậy ở Việt Nam có nhiều công trình nghiên cứu và phát hiện tính kháng LAM của HBV trong điều trị. Công ty Nam Khoa (Tp. Hồ Chí Minh) sử dụng phương pháp giải trình tự trên máy CEQ8000 (Beckman Coulter) để phát hiện kiểu gen và các đột biến kháng LAM, ADV của HBV. Phát hiện đột biến tại rt180 và rt204 kháng LAM của HBV sử dụng kỹ thuật PCR-RFLP có đề tài nghiên cứu của Nguyễn Chí Vinh [22]; sử dụng phương pháp real-time PCR có công trình nghiên cứu của Nguyễn Sử Minh Tuyết và cộng sự [19], Nguyễn Thành Khôi và Hồ Huỳnh Thùy Dương [10]. Sử dụng phương pháp PCR và đọc kết quả qua điện di trên gel agarose 3% trong đề tài của Trần Thiện Toàn (Khóa luận tốt nghiệp, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên) [18]. Trong nghiên cứu này, tác giả sử dụng mồi ngược bắt cặp với bản mẫu hoang dại tại vị trí rt181, bản mẫu mang đột biến sẽ cho kết quả âm tính (không xuất hiện vạch) trên gel dưới tia UV. Trong khóa luận tốt nghiệp, Huỳnh Trường An (Đại học Mở, Tp. Hồ Chí Minh) [2], sử dụng mồi ngược bắt cặp với bản mẫu đột biến tại rt236 và mẫu dò phát huỳnh quang đọc tín hiệu qua mỗi chu kỳ khuếch đại. Trên thực tế, việc lựa chọn phương pháp nào cho đúng đắn để đưa vào chẩn đoán thường quy là không dễ. PCR kết hợp với giải trình tự hay PCR-RFLP đều là những phương pháp đòi hỏi kỹ thuật viên có trình độ tay nghề cao, thao tác khéo léo, thời gian cho kết quả lâu, thiên về nghiên cứu nhiều hơn là áp dụng vào thực tiễn và nhược điểm lớn nhất là độ nhạy không cao bằng real-time PCR. Với ưu điểm trên và có thể phát hiện chính xác nồng độ virus đột biến trong quần thể, real-time PCR được xem là công cụ hữu hiệu nhất với giá thành thấp, dùng để phát hiện các đột biến kháng ADV tại rt181 và rt236 của HBV ở những bệnh nhân mạn tính. 1.2 Đại cương về virus gây bệnh viêm gan siêu vi B 1.2.1 Lịch sử phát hiện bệnh viêm gan siêu vi B [6,7] Lịch sử của các loại VGVR thực ra là lịch sử của các bệnh vàng da (hoàng đảm), vì hội chứng này đã được ghi nhận rất lâu trong lịch sử loài người với nhiều bệnh khác nhau có thể gây nên vàng da. Vàng da có thể chỉ là một dấu hiệu của một bệnh toàn thân, hay là một bệnh chủ yếu ở lá gan. Bệnh ở gan gây nên vàng da cũng có nhiều nguyên nhân, trong đó tác nhân virus là chủ yếu. Sau đây là lịch sử của VG được ghi nhận theo kinh biểu niên. Vàng da nhiễm khuẩn được biết từ thời Hippocrates. Tuy người ta không biết rõ nơi nào và khi nào trận dịch VGVR đầu tiên xảy ra. Luerman (1883) mô tả một trận dịch tại xưởng đóng tàu Bremen ở những người được chủng ngừa vaxcin đậu mùa có bạch cầu người. Cùng năm này, một trận vàng da sau chủng ngừa khác xảy ra ở Merzig. Do vậy, sự hiện diện của một thể VGVR lây nhiễm trực tiếp từ máu người hoặc các dẫn xuất từ máu đã được nghĩ đến. Virchow (1885) đã mô tả bệnh gan là bệnh “vàng da xuất tiết” (catarrhal). Ông cho rằng vàng da xuất tiết có nguyên nhân là viêm đường mật do chất nhầy dính làm tắc đường mật, từ đó gây viêm ở chỗ nối đường mật – tá tràng và bệnh do vi khuẩn gây ra. Quan niệm này của Virchow gây ảnh hưởng lâu dài và đã cản trở quan điểm tiến bộ về nguyên nhân và sinh bệnh học VGVR cho mãi đến nửa đầu thế kỷ XX (Thế chiến thứ II). McDonald (1908) cho rằng tác nhân của vàng da xuất tiết là do virus. Lindstedl (Thụy Điển, 1919) đã tiên phong trong việc đặt ra thuật ngữ VG cho bệnh vàng da xuất tiết và đã chẩn đoán phân biệt hai dạng VG dịch tễ và VG huyết thanh. Năm 1943 – 1946, các nghiên cứu ở Anh và Quân Y Mỹ cho rằng VRVGB hiện diện trong huyết thanh gây vàng da và thường được mang bởi những người khỏe mạnh bình thường và không vàng da. Nhưng chỉ đến các trận dịch VG trên toàn thế giới trong Thế chiến thứ II mới đưa đến nhận thức tổng quát về bản chất lây nhiễm của bệnh vàng da xuất tiết của Virchow. Năm 1947, MacCallum đề nghị gọi tên bệnh VG nhiễm huyết thanh là VGB. Cuối cùng, các thuật ngữ này được Ủy Ban của Tổ chức Y tế Thế Giới về VGVR chấp thuận. Năm 1963, Blumberg, trong một nghiên cứu các protein huyết thanh đa hình (polymorphic), đã phát hiện một protein trong máu của một thổ dân Australia trước đó chưa từng biết. Năm 1965, protein Australia được gọi là kháng nguyên Australia (hiện nay được gọi là kháng nguyên bề mặt hoặc HBsAg). Vào lúc này, xét nghiệm miễn dịch men (EIA) đối với các dấu ấn miễn dịch của các loại VGVR trong huyết thanh vẫn còn là cơ sở chính trong chẩn đoán lâm sàng. Sau khi khám phá ra kháng nguyên Australia trong huyết thanh, Blumberg và cộng sự nhận xét rằng kháng nguyên này hiện diện với nồng độ cao ở bệnh nhân ung thư máu và ở các trẻ bị bệnh Down. Năm 1968, các nhà nghiên cứu khác, nhất là Prince, Okochi và Murakami, đã xác định kháng nguyên Australia chỉ được tìm thấy trong huyết thanh người nhiễm VRVGB, từ đó VRVGB mới được nhận biết và được xác lập đặc điểm. Blumberg nhận giải Nobel Y học vào năm 1976 nhờ phát hiện này. Từ năm 1942-1967, các nghiên cứu thực nghiệm viêm gan được thực hiện trên chính con người (Đức và Mỹ) đã bị nhiều người phê phán do vấn đề y đức. Nhưng cũng nhờ đó mà các đặc điểm dịch tễ, bệnh sử và phòng ngừa của hai loại VG A và B được hiểu biết rõ hơn. Năm 1970, hạt tương tự virus được phát hiện (gọi là hạt Dane) mang trên bề mặt của nó kháng nguyên Australia trong huyết thanh của bệnh nhân VGB và những hạt này được cho là VRVGB. Kaplan (1973) phát hiện DNA polymerase nội sinh bên trong vỏ ngoài của các hạt Dane. Chính DNA polymerase này giúp Robinson (1979) nhân dòng HBV DNA và xác định chuỗi mã nucleotide DNA toàn phần, cho rằng HBV là một tác nhân gây bệnh theo đường máu nhưng không sao chép trong môi trường nuôi cấy mô. Từ đó, bộ gen HBV là bộ gen độc đáo trong thế giới virus do bản chất đậm đặc của chúng, các khung đọc gối lên nhau và do phụ thuộc vào bước phiên mã ngược, dù rằng virion chứa chủ yếu DNA. Do phát hiện này, VRVGB người trở thành kiểu nguyên sinh của họ hepadnavirus, Hepadnaviridae. Năm 1972, Magnus phát hiện ra HBeAg. Mullis K.B. (1983) đã tìm ra phương pháp phản ứng chuỗi polymerase (PCR). Đây là một phương pháp nhân dòng in vitro nhằm tạo ra một số lượng lớn bản sao của một chuỗi mã nhất định. Nhờ phát minh này, Mullis nhận giải Nobel (1993) và sinh học phân tử có những bước tiến bộ mới. Sự khuếch đại virus bằng PCR giúp phát hiện trực tiếp và rất nhạy HBV DNA trong huyết thanh, tế bào và các mô, hơn là phát hiện nhiễm HBV gián tiếp qua đáp ứng miễn dịch ký chủ đối với kháng nguyên virus. Nhờ đó trong thập kỷ vừa qua, nhiều tiến bộ đã đạt được về sinh học phân tử, dịch tễ học, sinh bệnh học, chẩn đoán, điều trị và dự phòng của HBV. 1.2.2 Phân loại và các kiểu gen HBV 1.2.2.1 Phân loại HBV Hiện nay, virus có tính hướng gan được xếp vào một danh sách ngày càng dài, thường xếp theo thứ tự mẫu la tinh từ A (HAV), B (HBV), C (HCV), D (HDV) , E (HEV), G, TTV (đến nay đã có 16 kiểu huyết thanh TTV), virus SENV (phát hiện năm 1999, đến nay đã có 9 kiểu gen), virus SANBAN, virus nhỏ giống TTV, virus YONBAN, virus Sentinel [6,7] Trong đó, chỉ có virus A và E là truyền theo đường tiêu hóa (thường gặp trong các vụ dịch ở Châu Á, Bắc Phi và Mexico); các virus khác (B, C, D) truyền theo đường máu; còn VRVG G cũng được cho là có thể truyền qua đường máu, là tác nhân gây bệnh nhưng hiếm, nếu có thì thường gây VG rõ rệt. Năm 1994, VRVG F được báo cáo, nhưng hiện nay, VRVG F được xem là thể biến dị của HBV gặp ở Nhật Bản [6,16]. Dựa theo sự xuất hiện ngoài tự nhiên: HBV thuộc virus động vật có xương sống. Dựa theo các nhóm acide nucleic của virus động vật, HBV nằm trong nhóm 1, chứa 2 sợi DNA có cấu trúc xoắn vòng, chỉ một mạch phiên mã tạo mRNA (dịch mã tạo protein vỏ capsid). HBV có cấu trúc 20 mặt, 42 capsomer, có vỏ ngoài, trọng lượng phân tử là 1,6kD, sợi thứ hai chưa hoàn chỉnh và có khác về chiều dài. Dựa theo khả năng gây bệnh: HBV là virus gây viêm gan (viêm nhiễm các tuyến) [4]. Hệ thống phân loại HBV: Họ Hepadnaviridae Chi Orthohepadnavirus Hepatitis B virus [20]. 1.2.2.2 Các kiểu gen HBV Dựa vào mức độ tương đồng về trình tự các nucleotide, hiện nay người ta chia HBV thành 8 kiểu gen (genotype) được gọi theo thứ tự mẫu la tinh: A, B, C, D, E, F, G, H [44]. Các kiểu gen HBV này khác nhau ít nhất 8%. Bên cạnh đó, chúng còn rất đa dạng, trong mỗi kiểu gen lại được chia ra thành nhiều phân týp (subgenotype) và các phân týp này khác nhau ít nhất 4% [26]. Các kiểu gen HBV khác nhau phân bố ở các vùng địa lí đặc trưng khác nhau: kiểu gen A phổ biến ở Bắc Mỹ, Châu Âu, Nam Phi, và Ấn Độ; kiểu gen B và C thì phổ biến ở Châu Á; kiểu gen D phổ biến ở Châu Âu (vùng Địa Trung Hải), Trung Đông, Ấn Độ và Nam Phi; kiểu gen E phổ biến ở Tây Phi; kiểu gen F phổ biến ở Trung và Nam Mỹ, Alaska; kiểu gen G phổ biến ở Châu Âu, Mexico, Mỹ; kiểu gen H thường thấy ở Trung Mỹ, Mỹ và Nhật Bản [37]. Hình 1.1: Sự phân bố các kiểu gen của HBV trên thế giới Nguồn: Marion Peters MD (2008), Hepatitis B - Diagnosis, Serology, Virology, UCSF. 1.2.3 Tình hình nhiễm virus HBV trên thế giới và Việt Nam Nhiễm HBV là một bệnh thường gặp nhất trên thế giới gây VG mạn ở người. VGB mạn tính có thể dẫ