Tóm tắt Luận án Nghiên cứu đặc tính sinh học, sinh học phân tử chủ yếu của chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02 phân lập tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam

1 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM LÊ THỊ TOAN NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC, SINH HỌC PHÂN TỬ CHỦ YẾU CỦA CHỦNG VIRUS PRRS HUA 01 VÀ PRRS HUA 02 PHÂN LẬP TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC VIỆT NAM Chuyên ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi Mã số:62.64.01.02 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÀ NỘI - 2017 Công trình hoàn thành tại: HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Ngƣời hƣớng dẫn: 1. PGS. TS. NGUYỄN THỊ LAN 2. PGS. TS. PHẠM CÔNG HOẠT Phản biện 1: PGS.TS. NGUYỄN BÁ HIÊN Học viện Nông nghiệp Việt Nam Phản biện 2: PGS.TS. TÔ LONG THÀNH Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ƣơng Phản biện 3: PGS.TS. CÙ HỮU PHÚ Hội Thú y Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Học viện họp tại: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Vào hồi giờ, ngày tháng năm 2017 Có thể tìm hiểu luận án tại thƣ viện: - Thƣ viện Quốc gia Việt Nam - Thƣ viện Học viện Nông nghiệp Việt Nam PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Bệnh tai xanh hay hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome – PRRS) là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm của lợn mọi nòi giống, mọi lứa tuổi. Bệnh xuất hiện đầu tiên ở Mỹ năm 1987 (Keffaber, 1989), rất nhanh chóng sau đó bệnh lan sang Canada và sau đó lan sang các nước Châu Âu. Năm 1991, virus được tìm thấy tại Hà Lan (Terpstra et al., 1991). Năm 1998, bệnh được phát hiện ở Hàn Quốc, Nhật Bản thuộc khu vực Châu Á. Từ năm 2005 trở lại đây, bệnh lây lan khắp các nước trên toàn thế giới. Bệnh tai xanh do một loại virus gây ra, virus tấn công là các đại thực bào dẫn đến hiện tượng suy giảm miễn dịch ở lợn, tạo điều kiện cho các virus, vi khuẩn gây bệnh khác tấn công.Tác nhân gây bệnh - virus PRRS (PRRSV) là một thành viên của giống Arterivirus, họ Arteriviridae, bộ Nidovirales (Collins et al., 1992). PRRS lần đầu tiên được ghi nhận ở Việt Nam vào năm 1997, thực tế cho thấy virus vẫn tồn tại và không ngừng biến đổi, cần có những nghiên cứu mới về PRRSV tại Việt Nam, để thấy rõ có sự khác biệt hay không với các chủng cổ điển đã phân lập trên thế giới cũng như trả lời cho câu hỏi tại sao vắc-xin PRRS được sử dụng mà dịch bệnh vẫn thường xuyên xảy ra. Nguyên nhân chúng ta chưa có thông tin chính xác về các chủng PRRSV thực tế đang lưu hành tại Việt Nam, cũng như những đặc tính sinh học và sinh học phân tử của các chủng virus này. Trong các nghiên cứu gần đây của Khoa Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã nghiên cứu được một số triệu chứng lâm sàng, đặc điểm bệnh lý của lợn mắc PRRS tự nhiên và cũng đã phân lập được một số chủng PRRSV gây bệnh từ đàn lợn nuôi ở một số tỉnh phía Bắc Việt Nam trên môi trường tế bào Marc 145. Trong các chủng phân lập được, có các chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02 được phân lập từ các lợn có triệu chứng và bệnh tích khá điển hình của lợn mắc PRRS, gây tỷ lệ ốm, tỷ lệ chết cao. Tuy nhiên vẫn chưa đánh giá hết được đặc tính sinh học và sinh học phân tử của các chủng virus này. Để phục vụ mục đích lựa chọn chủng chế tạo vắc-xin, đánh giá hiệu quả của vắc-xin hoặc sản xuất chế phẩm sinh học phòng, trị bệnh cho vật nuôi thì việc nghiên cứu các đặc tính sinh học và sinh học phân tử của các chủng virus phân lập được là vô cùng quan trọng và cấp thiết. 1.2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI 1.2.1. Mục tiêu chung Mục tiêu của luận án nhằm chọn ra chủng virus PRRS tiềm năng có đặc tính sinh học, sinh học phân tử điển hình để làm phong phú nguồn quỹ gene nhằm phục vụ các nghiên cứu chuyên sâu như: sản xuất vắc-xin phù 2 hợp có hiệu quả bảo hộ cao; chế kháng thể đạt chuẩn dùng trong phòng, trị PRRS; công cường độc để đánh giá hiệu quả của vắc-xin; gây bệnh thí nghiệm để nghiên cứu sâu hơn về đặc điểm bệnh lý PRRS; sử dụng làm chủng tham chiếu để nghiên cứu các virus mới phân lập và các biến chủng dùng trong dịch tễ học phân tử. 1.2.2. Mục tiêu cụ thể Xác định được một số đặc tính sinh học chủ yếu của 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02. Xác định được một số đặc tính sinh học phân tử của 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02. 1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU 1.3.1. Đối tƣợng nghiên cứu 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 đã được khoa Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam phân lập từ một số tỉnh phía Bắc Việt Nam. 1.3.2. Phạm vi nghiên cứu Phạm vi về không gian nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện trên đối tượng là chủng virus PRRS HUA 01 được phân lập tại tỉnh Hải Dương (năm 2013) và chủng virus PRRS HUA 02 được phân lập tại tỉnh Hưng Yên (năm 2013). Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ sinh học Thú y và phòng thí nghiệm bộ môn bệnh lý, khu nuôi động vật thí nghiệm – Khoa Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Thời gian nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện từ năm 6/2014- 12/2016. 1.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI Những vắc-xin được sử dụng để phòng bệnh tại Việt Nam hiện nay chưa mang lại hiệu quả rõ rệt. Điều này cho thấy có một sự sai khác đáng kể về tính kháng nguyên của chủng virus PRRS gây bệnh trên đàn lợn ở Việt Nam với chủng virus PRRS của vắc-xin nhập ngoại vì vậy mà kháng thể kháng virus PRRS có trong lợn được tiêm phòng không thể bảo hộ được chúng khỏi các chủng virus PRRS thực địa. Nghiên cứu sự tương đồng kháng nguyên giữa các chủng virus PRRS phân lập và các chủng virus vắc-xin cho phép xác định được tính tương đồng giữa các chủng virus này, từ đó đưa ra các thông tin chính xác về sự lưu hành của các chủng virus PRRS ở Việt Nam. Đồng thời cho phép lựa chọn được các chủng virus PRRS thích hợp để sử dụng làm vắc-xin. Luận án nghiên cứu đặc tính sinh học và sinh học phân tử của một số chủng virus PRRS đã được phân lập từ trước đó là một trong những nghiên cứu mới và cần thiết để lựa chọn ra được các chủng virus điển hình cho virus gây bệnh tại Việt Nam và có tiềm năng để sản xuất vắc-xin, thử độc 3 lực của vắc-xin hoặc các chế phẩm sinh học nhằm phục vụ cho chẩn đoán, phòng, trị bệnh cho lợn. 1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 1.5.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài Các thông tin khoa học, những kết quả nghiên cứu về đặc tính sinh học và sinh học phân tử của 02 chủng PRRSV phân lập được tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam là cơ sở khoa học quan trọng cho các nghiên cứu sâu hơn về PRRS như nghiên cứu sản xuất kháng thể đơn dòng, nghiên cứu sản xuất vắc-xin, nghiên cứu chế tạo Kit chẩn đoán, bảo tồn nguồn gene virus thực địa với các đặc tính sinh học rõ ràng và đầy đủ. Kết quả của luận án sẽ chỉ ra được các đặc tính sinh học và sinh học phân tử cũng như độc lực của một số chủng PRRSV sẽ rất có ích cho lĩnh vực thú y nói riêng và lĩnh vực công nghệ sinh học nói chung. Tạo ra được những tiến bộ khoa học, phát triển các hướng nghiên cứu về công nghệ sinh học trong lĩnh vực thú y. 1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài Kết quả của luận án sẽ đưa ra những thông tin về đặc tính sinh học, sinh học phân tử của một số chủng virus PRRS nghiên cứu để có thể lựa chọn được chủng virus tiềm năng dùng để chế vắc-xin phòng bệnh hoặc chế kháng nguyên chẩn đoán bệnh hoặc làm chủng cường độc để thử hiệu lực của vắc- xin. Như vậy các chủng virus này có thể giúp ích cho các công ty sản xuất vắc-xin hoặc các cơ sở nghiên cứu. Sản xuất được vắc-xin trong nước, giúp chúng ta không phải lệ thuộc vào sự nhập khẩu vắc-xin và có thể chủ động trong việc phòng chống dịch PRRS nhằm giảm thiểu tối đa thiệt hại kinh tế cho người chăn nuôi, giúp phát triển một ngành chăn nuôi bền vững. PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. TÌNH HÌNH VỀ PRRS TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 2.1.1. Lịch sử và tình hình dịch PRRS ở lợn trên thế giới Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome - PRRS) được ghi nhận lần đầu tiên trong các báo cáo về các thiệt hại của ngành công nghiệp chăn nuôi tại Mỹ. Tại các ổ dịch có biểu hiện các triệu chứng lâm sàng của PRRS đã được báo cáo ở Mỹ vào cuối những năm 80 của thế kỉ trước (1987) người ta thấy số lượng lợn chết trong điều kiện bình thường tăng lên và lợn chậm lớn. Các triệu chứng lâm sàng bao gồm rối loạn sinh sản nghiêm trọng, viêm phổi ở lợn con sau cai sữa, chậm lớn, giảm năng suất và tỷ lệ tử vong tăng (Keffaber, 1989). Hai năm sau các ổ dịch có các triệu chứng lâm sàng tương tự đã được báo cáo ở CHLB Đức (1990). Năm năm sau kể từ khi có báo cáo đầu tiên về bệnh, năm 1991 virus được tìm thấy lần đầu tiên tại Hà Lan. 4 (Terpstra et al., 1991). Sau đó không lâu, virus PRRS được Mỹ đặt tên là ATCC VR – 2332) (Collins et al., 1992). 2.1.2. Lịch sử và tình hình dịch PRRS ở lợn tại Việt Nam Lần đầu tiên trong lịch sử vào năm 1997, PRRS được phát hiện trên đàn lợn nhập từ Mỹ vào các tỉnh miền Nam. Kết quả kiểm tra thấy 10/51 lợn giống nhập khẩu có huyết thanh dương tính với PRRS. Toàn bộ số lợn này đã được xử lý vào thời gian đó. Tuy nhiên, trong những năm tiếp theo, các nghiên cứu về bệnh trên những trại lợn giống tại các tỉnh phía Nam cho thấy tỷ lệ lợn có huyết thanh dương tính với bệnh rất khác nhau, từ 1,3% cho tới 68,29% (Cục Thú y, 2007). Theo thống kê của Cục Thú y, đợt dịch đầu tiên xảy ra vào ngày 12/3/2007 và sau đó lây lan ra khắp cả nước. Từ năm 2007 đến nay, PRRS luôn là vấn đề thời sự bởi tính nguy hiểm của nó. 2.2. MỘT SỐ HIỂU BIẾT VỀ VIRUS PRRS 2.2.1. Cấu trúc virus PRRS Virus PRRS là một virus RNA chuỗi đơn dương, virus này được xếp vào bộ Nidovirales, họ Arteriviridae, chi Arterivirus (Collins et al., 1992). Họ Ateriviridae chỉ có một giống Aterivirus bao gồm hai thành viên là: Equine Ateritis Virus (EAV) gây viêm động mạch, sảy thai và viêm phổi ngựa non; Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome Virus (PRRSV) gây rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn. 2.2.2. Phân loại virus PRRS Về tính đa dạng di truyền, virus PRRS có hai prototyp, phân lập ở châu Âu (virus Lelystad-LV) và phân lập ở Bắc Mỹ (VR-2332). Ngoài sự khác biệt giữa các lần phân lập người ta đã chứng minh được có sự biến dị di truyền mạnh trong cả hai typ phân lập, được khẳng định qua phân tích trình tự Nucleotid và Aminoacid của các khung đọc mở (ORFs) của LV và VR-2332. Trình tự Aminoacid của VR-2332 so với LV là 76% (ORF2), 72% (ORF3), 80% (ORF4&5), 91% (ORF6) và 74% (ORF7). Phân tích trình tự cho thấy các virus đang tiến hóa do đột biến ngẫu nhiên và tái tổ hợp trong gene. Theo Murtaugh et al. (1995), Meng et al. (1995) và Nelsen et al. (1999) các chủng virus này gây bệnh trên động vật cảm thụ với bệnh cảnh giống nhau nhưng chúng lại đại diện cho 2 genotyp khác biệt. 2.2.3. Một số nghiên cứu về đặc tính sinh học của virus PRRS 2.2.3.1. Tính chất nuôi cấy của virus PRRS Có nhiều dòng tế bào có thể sử dụng để nuôi cấy virus. Tuy nhiên virus PRRS chỉ có thể nhân lên trên hai loại tế bào, đó là: đại thực bào phế nang lợn (Porcine Alveolar Macrophage-PAM) và tế bào thận khỉ (Marc 145, CL2621). 5 2.2.3.2. Một số nghiên cứu về khả năng nhân lên của virus PRRS trên môi trường tế bào Marc 145 thông qua khả năng gây bệnh tích tế bào Nghiên cứu của Martha et al. (2009) đã sử dụng 2 dòng tế bào là đại thực bào phế nang (PAM) và MA104 để phân lập virus PRRS từ các mẫu thu thập được. Nghiên cứu của Fang et al. (2006) đã chọn chủng virus PRRS là YA được phân lập từ phổi lợn mắc triệu chứng cấp tính với PRRS tại một tỉnh của Trung Quốc và được xác định là thuộc serotype Bắc Mỹ độc lực cao. 2.2.3.3. Một số nghiên cứu về quy luật nhân lên của virus PRRS trên môi trường tế bào Nghiên cứu của Fang et al. (2006) đã thực hiện nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng của virus trong điều kiện môi trường nuôi cấy tế bào Marc-145. Virus được tiến hành gây nhiễm trên môi trường Marc 145 với giá trị MOI = 0,1. Nghiên cứu của Han et al. (2007) đã tiến hành nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng của virus trên dòng tế bào MA 104 trên môi trường nuôi cấy tế bào bằng bình T25 với giá trị MOI là 5 x 104 PFU. Nguyễn Thị Lan và Lương Quốc Hưng (2012) đã nghiên cứu đặc tính sinh học của một số chủng phân lập tại Việt Nam. 2.2.4. Một số nghiên cứu về đặc tính sinh học phân tử của virus PRRS Dựa trên phân tích về phát sinh loài virus phân lập khác nhau trên thế giới (Nelson et al., 1993) PRRSV có thể được phân biệt thành hai kiểu gene: loại I, European gienotype gồm virus thuộc dòng Châu Âu, đại diện là chủng Lelystad (LV), gồm 3 subtype đã được xác định trong đó, subtype 1 được chia thành 12 clade khác nhau, subtype 2 được chia thành 9 clade (Shi et al., 2010); loại II: Northern American gienotype gồm những virus thuộc dòng Bắc Mỹ mà tiêu biểu là chủng virus Bắc Mỹ ATCC - VR2332. PRRSV phân lập ở Trung Quốc được chỉ định là thành viên của kiểu gene II. Nghiên cứu phân tử mở rộng cho thấy rằng PRRSV là rất khác nhau về kháng nguyên, độc lực và đa dạng trình tự nucleotide (Nguyễn Hữu Nam và Nguyễn Thị Lan, 2007). Sợi đơn RNA của virus bao gồm một bộ gene có khoảng 15 kb, mã hóa 9 ORFs. Bộ gene PRRSV bao gồm hai gene polymerase là ORF1a và ORF1b và bảy gene cấu trúc là ORF2a, 2b, 3, 4, 5, 6, và 7. Một số nghiên cứu khác về gene ORF5: ORF5 là gene mã hóa cho một glycoprotein xuất hiện phần lớn trên bề mặt của virus PRRS. Trình tự protein GP5 được dự đoán có chứa vùng trình tự tín hiệu (từ amino acid 1-32), 2 vùng trình tự ectodomain ngắn (từ amino acid 32-64 và amino acid 89-109) và vùng trình tự endodomain (từ amino acid 110-200) (Li and Murtaugh, 2012; Kim et al., 2014). Nghiên cứu mức độ tương đồng của gene ORF5 cho thấy, các chủng virus PRRS lưu hành ở Việt Nam có mức độ tương đồng cao với các chủng của Trung Quốc (Metwally, 2010). Nghiên cứu phân tử mở rộng cho thấy rằng PRRSV là rất khác nhau về kháng nguyên, độc lực và đa dạng trình tự nucleotide (Nguyễn 6 Hữu Nam và Nguyễn Thị Lan, 2007). Những nghiên cứu còn cho thấy có sự khác biệt về tính di truyền trong các virus được phân lập từ các vùng địa lý khác nhau. Bản thân các virus trong cùng một nhóm cũng có sự thay đổi về chuỗi nucleotid khá cao đến 20% về trình tự và số lượng ribonucleotide, điển hình là các chủng virus thuộc dòng Bắc Mỹ (Nguyễn Bá Hiên và Huỳnh Thị Mỹ Lệ, 2007). Nghiên cứu của Đỗ Hải Quỳnh và cs. (2016) khi phân tích đa dạng di truyền gene ORF5 của một số chủng virus phân lập tại miền Bắc Việt Nam từ năm 2011-2013 cũng chỉ ra mức độ tương đồng về nucleotide giữa các chủng virus nghiên cứu với chủng JXA1 là rất cao. 2.3. MỘT SỐ HIỂU BIẾT VỀ HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ HẤP VÀ SINH SẢN Ở LỢN (PRRS) 2.3.1. Truyền nhiễm học 2.3.1.1. Loài vật mắc bệnh PRRSV gây bệnh cho lợn ở mọi lứa tuổi, nòi giống nhưng mẫn cảm nhất vẫn là lợn con và lợn nái mang thai. Thông thường virus PRRS chỉ gây bệnh cho lợn không gây bệnh cho người và các động vật khác. Tuy nhiên, một số loại gia cầm như vịt trời (Mallard duck) đã được chứng minh là rất mẫn cảm với virus PRRS và virus có thể nhân lên ở loài vịt này (Zimmerman et al., 1997). 2.3.1.2. Cơ chế sinh bệnh Virus có đặc điểm rất thích hợp với đại thực bào, đặc biệt là đại thực bào vùng phổi. Đây là tế bào duy nhất có receptor phù hợp với cấu trúc hạt virus, vì thế virus hấp phụ và thực hiện quá trình nhân lên chỉ trong tế bào này và phá huỷ nó. Virus nhân lên ngay bên trong đại thực bào, sau đó phá huỷ và giết chết đại thực bào (tới 40%). Đại thực bào bị giết chết nên sức đề kháng của lợn mắc bệnh bị suy giảm nghiêm trọng. Do vậy lợn bệnh thường dễ dàng bị nhiễm khuẩn kế phát (Nguyễn Hữu Nam và Nguyễn Thị Lan, 2007). 2.3.2. Triệu chứng và bệnh tích Biểu hiện triệu chứng lâm sàng của bệnh phụ thuộc vào nhiều yếu tố: chủng virus, tuổi, giới tính, điều kiện môi trường... và sự kế phát của một số vi sinh vật khác. Theo các tác giả Lê Văn Năm (2007), Phạm Ngọc Thạch và Đàm Văn Phải (2007) thì lợn con theo mẹ có tỷ lệ ốm và chết cao nhất. Lợn sau cai sữa, lợn vỗ béo có tỷ lệ chết cao thứ 2. Nái nuôi con và nái mang thai có tỷ lệ ốm, chết thấp hơn. Bệnh tích tập trung ở phổi. Các ổ viêm thường gặp ở thuỳ đỉnh, song cũng thấy ở các thuỳ khác nhưng hầu như không xuất hiện đối xứng. Các ổ viêm, áp xe thường có màu xám đỏ, rắn, chắc. Mô phổi lồi ra và có màu đỏ xám loang lổ như tuyến ức hay như đá granito. Cắt miếng phổi nhỏ bỏ vào nước thấy miếng phổi chìm, chứng tỏ phổi đã bị phù nề tích nước nặng. 7 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU Bộ môn bệnh lý thú y, khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Thời gian: từ tháng 6/2014 tới 12/2016. 3.2. ĐỐI TƢỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 3.2.1. Đối tƣợng nghiên cứu Chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02 được Khoa Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam phân lập từ mẫu bệnh phẩm thu thập từ 02 trang trại thuộc 2 tỉnh Hải Dương và Hưng Yên vào năm 2013. 3.2.2. Vật liệu nghiên cứu Dụng cụ, hóa chất, trang thiết bị phục vụ nghiên cứu. 3.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Nghiên cứu đặc tính sinh học chủ yếu của 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 phân lập tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam. Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử của 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 phân lập tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam. 3.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.4.1. Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào Khôi phục tế bào; Cấy chuyển tế bào; Thu tế bào. 3.4.2. Phƣơng pháp gây nhiễm virus Gây nhiễm virus lên môi trường tế bào; Quan sát bệnh tích tế bào; Thu virus. 3.4.3. Phƣơng pháp xác định hiệu giá virus (TCID50/ml) Tế bào Marc 145 được chuẩn bị trên khay 96 giếng (2,0 x 104 tế bào/giếng). Huyễn dịch virus được pha loãng theo cơ số 10 rồi đem ủ trên bề mặt tế bào một lớp các giếng theo thứa tự đánh dấu trước (25µl/giếng), mỗi độ pha loãng lặp lại 5 lần. Sau 1 giờ ủ, dung dịch duy trì DMEM (10% TBP) được bổ sung vào (100 µl/giếng). CPE được quan sát hàng ngày cho đến ngày thứ 5 sau khi gây nhiễm. TCID50 được xác định theo công thức Spearman-Karber. 3.4.4. Phƣơng pháp xác định đƣờng biểu biễn sự nhân lên của virus Tế bào Marc 145 được chuẩn bị vào những khay 96 giếng (5×104 tế bào/giếng) và được nuôi như mô tả ở trên. Virus PRRS phân lập được và chủng virus vắc-xin được gây nhiễm lên tế bào ở MOI = 0.01. Sau một giờ ủ, để virus bám vào tế bào, huyễn dịch chứa virus được hút bỏ và môi trường nuôi dưỡng được rửa sạch bằng 0.5 ml PBS. Sau đó, dung dịch nuôi dưỡng thiết yếu được bổ sung vào môi trường nuôi cấy 100µl/giếng. Virus giải phóng ngoài tế bào và virus trong 8 tế bào được thu riêng từ dịch nổi và phần tế bào còn lại ở các bình gây nhiễm tại các thời điểm 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96 giờ sau gây nhiễm virus. Tiến hành xác định hiệu giá những ống virus đã thu để định lượng virus. Đường biểu biễn sự nhân lên của virus được xây dựng có biến là log10 của TCID50 tại mỗi thời điểm thu virus. 3.4.5. Phƣơng pháp RT-PCR Quy trình tách chiết RNA tổng số được thực hiện theo hướng dẫn đi kèm của bộ Kit QIAamp Viral RNA Minikit (Qiagen, Hilden, Đức). Mẫu RNA sau khi tách chiết sẽ được tiến hành phản ứng RT-PCR theo bộ Kit Qiagen One-step RT-PCR. 3.4.6. Phƣơng pháp Realtime RT-PCR Thự hiện phản ứng Realtime RT-PCR theo TCVN 8400-21:2014. 3.4.7. Phƣơng pháp giải trình tự gene Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng máy giải trình tự gene tự động Beckman Coulter CEQ 8000 (Mỹ) thí nghiệm được tiến hành tại Phòng thí nghiệm trung tâm Khoa Thú y. Quá trình thực hiện giải trình tự bao gồm các bước: Tinh sạch sản phẩm của phản ứng RT-PCR, thực hiện phản ứng PCR sequence, tinh sạch sản phẩm PCR sequence. 3.4.8. Phƣơng pháp gây bệnh thực nghiệm Bước 1: Chọn lợn Bước 2: Theo dõi lợn trước khi gây nhiễm Bước 3: Gây nhiễm cho lợn. Bước 4: Theo dõi lợn sau khi gây nhiễm 3.4.9. Phƣơng pháp khám lâm sàng Tiến hành quan sát, ghi chép, thống kê các biểu hiện của lợn tại một số ổ dịch từ khi xuất hiện những dấu hiệu bệnh lý đầu tiên đến hết thời gian