Tóm tắt Luận án Xác định một số yếu tố độc lực của enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) gây tiêu chảy trên heo con ở Đồng bằng sông Cửu Long

Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) là một trong những nguyên nhân phổ biến gây bệnh tiêu chảy cho heo con theo mẹ và sau cai sữa, do 2 yếu tố độc lực chính là kháng nguyên bám dính và độc tố ruột (Nagy and Fekete, 1999, Gyles and Fairbrother, 2010). Phần lớn những nghiên cứu về E. coli ở khu vực đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) chỉ dừng ở việc thực hiện phản ứng huyết thanh học để phát hiện kháng nguyên O và kháng nguyên F, hoặc một số loại độc tố. Trong khi các nghiên cứu trong và ngoài nước trong thời gian qua cho thấy sự phân bố và đặc điểm của E. coli gây bệnh nói chung và ETEC nói riêng luôn thay đổi theo từng vùng địa lý, thời gian lấy mẫu và trên những đàn khác nhau.

pdf28 trang | Chia sẻ: lecuong1825 | Ngày: 15/07/2016 | Lượt xem: 1060 | Lượt tải: 0download
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Tóm tắt Luận án Xác định một số yếu tố độc lực của enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) gây tiêu chảy trên heo con ở Đồng bằng sông Cửu Long, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ NGUYỄN THỊ HẠNH CHI XÁC ĐỊNH MỘT SỐ YẾU TỐ ĐỘC LỰC CỦA ENTEROTOXIGENIC ESCHERICHIA COLI (ETEC) GÂY TIÊU CHẢY TRÊN HEO CON Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã ngành: 62 42 01 07 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ NGUYỄN THỊ HẠNH CHI XÁC ĐỊNH MỘT SỐ YẾU TỐ ĐỘC LỰC CỦA ENTEROTOXIGENIC ESCHERICHIA COLI (ETEC) GÂY TIÊU CHẢY TRÊN HEO CON Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã ngành: 62 42 01 07 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Hà Thanh Toàn PGS.TS. Lý Thị Liên Khai 2015 Công trình được hoàn thành tại: Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Hà Thanh Toàn PGS.TS. Lý Thị Liên Khai Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án được bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án cấp Trường Họp tại Vàogiờ.., ngàytháng..năm. Có thể tìm luận án tại: 1. Thư viện Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ 2. Trung tâm học liệu trường Đại học Cần Thơ 3. Thư viện Quốc gia 1 Chương 1. TỔNG QUAN VỀ LUẬN ÁN 1.1 Giới thiệu Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) là một trong những nguyên nhân phổ biến gây bệnh tiêu chảy cho heo con theo mẹ và sau cai sữa, do 2 yếu tố độc lực chính là kháng nguyên bám dính và độc tố ruột (Nagy and Fekete, 1999, Gyles and Fairbrother, 2010). Phần lớn những nghiên cứu về E. coli ở khu vực đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) chỉ dừng ở việc thực hiện phản ứng huyết thanh học để phát hiện kháng nguyên O và kháng nguyên F, hoặc một số loại độc tố. Trong khi các nghiên cứu trong và ngoài nước trong thời gian qua cho thấy sự phân bố và đặc điểm của E. coli gây bệnh nói chung và ETEC nói riêng luôn thay đổi theo từng vùng địa lý, thời gian lấy mẫu và trên những đàn khác nhau. Bên cạnh đó, người chăn nuôi sử dụng kháng sinh để phòng và điều trị bệnh cho vật nuôi đã tạo nên những chủng đa kháng với kháng sinh. Những chủng này không những gây ảnh hưởng đến sức khoẻ của người tiêu dùng, mà còn ảnh hưởng đến quá trình điều trị bệnh sau này. Vì vậy, nghiên cứu này giúp phát hiện các chủng ETEC gây bệnh trên heo con, sự đề kháng và khả năng mang gene kháng kháng sinh của chúng, nhằm bảo vệ vật nuôi, nâng cao năng suất và chất lượng thịt theo yêu cầu ngày càng cao của người tiêu dùng về súc sản phẩm như là thịt sạch, an toàn và chất lượng để bảo vệ sức khỏe cho con người. Xuất phát từ những vấn đề trên, nghiên cứu “Xác định một số yếu tố độc lực của enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) gây tiêu chảy trên heo con ở Đồng bằng sông Cửu Long” được tiến hành. 1.2 Mục tiêu Xác định sự phân bố của các yếu tố độc lực, đặc tính kháng kháng sinh của các chủng ETEC phân lập từ heo con ở một số tỉnh/thành thuộc ĐBSCL; phân tích một số đặc tính di truyền ở mức độ phân tử của các chủng ETEC mang kháng nguyên F4 và F18. 1.3 Ý nghĩa của luận án Luận án là công trình nghiên cứu một cách có hệ thống về một số gene độc lực của các chủng ETEC từ heo khỏe, heo tiêu chảy, môi trường chăn nuôi, đánh giá sự phân bố của các gene mã hóa độc lực theo địa phương, theo nhóm tuổi của heo con. Kết quả đề kháng và nhạy cảm với kháng sinh của các chủng ETEC để giúp cán bộ thú y chọn những loại kháng sinh điều trị có hiệu lực cao cho từng địa phương. 2 Kết quả nghiên cứu này là cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp theo về các biến thể của kháng nguyên bám dính F4 và F18 để chọn những chủng ETEC mang kháng nguyên thích hợp cho việc sản xuất vaccine phòng bệnh do ETEC gây ra ở heo con tại khu vực ĐBSCL, đồng thời có giá trị góp phần bổ sung kiến thức thực tế, tư liệu khoa học dùng cho nghiên cứu và giảng dạy môn Vi sinh vật học Thú y, Bệnh truyền nhiễm, Miễn dịch học trong các trường Đại học Nông nghiệp. 1.4 Những điểm mới của luận án Luận án là công trình đầu tiên ứng dụng kỹ thuật PCR để xác định chính xác sự hiện diện của các gene mã hóa kháng nguyên bám dính (F4, F5, F6, F18, Intimin, AIDA-I), độc tố ruột (LT, STa, STb, EAST1) và gene mã hóa khả năng kháng kháng sinh của các chủng ETEC gây bệnh tiêu chảy heo con theo mẹ và heo sau cai sữa ở khu vực ĐBSCL. Vì vậy, kết quả nghiên cứu này làm cơ sở để xác định vai trò của ETEC gây tiêu chảy ở heo con và hiệu quả phòng chống bệnh tại khu vực này. Kết quả của luận án cung cấp thông tin khoa học về sự phân bố những gene liên quan đến các độc lực và đề kháng kháng sinh của các chủng ETEC phân lập từ các trại chăn nuôi heo ở khu vực ĐBSCL. Phân tích mức độ tương đồng gene faeG, fedA và quan hệ di truyền của các chủng ETEC gây bệnh tiêu chảy trên heo ở ĐBSCL. Bố cục của luận án Luận án gồm 147 trang (không kể phần phụ lục), chia thành các phần như sau: Chương 1: Tổng quan về luận án (3 trang); Chương 2: Tổng quan tài liệu (32 trang); Chương 3: Nội dung và và phương pháp nghiên cứu (20 trang); Chương 4: Kết quả và thảo luận (76 trang); Chương 5: Kết luận và đề xuất (2 trang); Tài liệu tham khảo (14 trang). Luận án có 40 bảng, 45 hình. Tổng tài liệu tham khảo là 182, gồm 25 tài liệu tiếng Việt, 153 tài liệu tiếng Anh và 4 tài liệu tham khảo từ trang Web. Chương 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Vi khuẩn Escherichia coli Vi khuẩn E. coli được Theodore Escherich - người Đức mô tả lần đầu tiên vào năm 1885 và sau đó được xem là nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy ở người và động vật (Levine, 1987). Đây là vi khuẩn thường trú trong đường tiêu hóa của động vật và người. Vi khuẩn E. coli có thể gây bệnh cho gia súc mọi lứa tuổi, đặc biệt là gia súc sơ sinh (Hirsh, 2004). 2.1.1 Đặc điểm hình thái 3 E. coli là trực khuẩn đường ruột, Gram âm, là những vi khuẩn hình que nhỏ, kích thước dài ngắn tùy thuộc vào môi trường nuôi cấy, đường kính khoảng 1 µm. Không hình thành bào tử, tạo giáp mô mỏng, có lông quanh cơ thể. Khuẩn lạc trên môi trường đặc phát triển hoàn toàn sau 1 ngày nuôi cấy. Khuẩn lạc có nhiều dạng khác nhau từ nhẵn, nhăn nheo có bìa tròn, hoặc nhăn nheo hoặc nhầy. Một vài chủng có khả năng gây dung huyết (Fairbrother and Gyles, 2006). 2.1.2 Đặc tính nuôi cấy E. coli thuộc loại trực khuẩn hiếu khí hoặc yếm khí tùy tiện. Nhiệt độ thích hợp cho chúng phát triển là 37oC, pH thích hợp là 7,2-7,4. Chúng mọc dễ dàng trong MacConkey (MC), Eosin Methylene Blue (EMB), có khả năng sản sinh dung huyết α và β (Quinn et al., 2004). 2.1.3 Đặc tính sinh hóa Kết quả kiểm tra Indole và Methyl Red (MR) của E. coli là dương tính, nhưng Voges Proskauer (VP) và Citrate thì âm tính, hoàn nguyên nitrate thành nitrite, không sử dụng ure. Trên môi trường Kligler Iron Agar (KIA): E. coli lên men đường glucose và lactose, phần thạch nghiêng và thạch đứng đều chuyển sang màu vàng, làm nứt thạch; ngoài ra không sinh H2S, (Quinn et al., 2004). 2.2 Phân loại vi khuẩn E. coli gây bệnh Vi khuẩn E. coli thuộc bộ Enterobacteriales, họ Enterobacteriaceae, giống Escherichia (Hirsh, 2004). E. coli gây bệnh được chia hai nhóm: E. coli gây bệnh đường ruột và E. coli gây bệnh ngoài đường ruột. Trước đây, E. coli gây bệnh đường ruột được chia thành 6 phân nhóm dựa trên khả năng gây bệnh của chúng: Enteropathogenic E. coli (EPEC), enterohaemorrhagic E. coli (EHEC), enteroinvasive E. coli (EIEC), enteroaggregative E. coli (EAEC), enterotoxigenic E. coli (ETEC) và diffusely adherent E. coli (DAEC) (Kaper et al., 2004). Gần đây, đã xuất hiện thêm hai phân nhóm mới, đó là adherent invasive E. coli (AIEC) được cho là có liên quan với bệnh Crohn, nhưng không gây ra tiêu chảy và shiga toxin (Stx) producing enteroaggregative E. coli (STEC) gây ổ dịch E. coli ở Đức vào năm 2011 (Clements et al., 2012). 2.3 Giới thiệu về ETEC ở heo ETEC xâm nhập vào động vật bằng đường tiêu hóa, và khi hiện diện đủ số lượng, bám vào các thụ thể trên biểu mô ruột non hoặc trong lớp biểu mô phủ chất nhầy, sau đó phát triển nhanh chóng để đạt được số lượng lớn khoảng 109 vi khuẩn/ gram trong đoạn giữa không tràng đến hồi tràng. ETEC bám chặt với các biểu mô sản xuất độc tố ruột, kích thích sự bài xuất 4 quá mức nước và chất điện giải vào trong lòng ruột. Kết quả dẫn đến tiêu chảy nếu các chất lỏng dư thừa từ ruột non xuống không được hấp thụ lại trong ruột già. ETEC là nguyên nhân tiêu chảy nghiêm trọng, có thể dẫn đến mất nước, mệt mỏi, chuyển hóa nhiễm acid, và có thể gây chết (Gyles and Fairbrother, 2010). 2.4 Các yếu tố độc lực của ETEC Những nghiên cứu gần đây cho rằng các yếu tố bám dính do ETEC sinh ra ở heo là K88 (F4), K99 (F5), 987P (F6), F41 và F18. Ngoài ra các nhà khoa học còn phát hiện thêm một loại bám dính khác (AIDA-I) trong các chủng ETEC hoặc VTEC có mang kháng nguyên bám dính F18 (Mainil et al., 2002, Ngeleka et al., 2003). Sau khi bám vào các thụ thể trên tế bào biểu mô ruột, các chủng ETEC sản xuất độc tố đường ruột, có thể là độc tố chịu nhiệt (STa, STb hoặc EAST1) hoặc độc tố kém chịu nhiệt (LT). (Gyles and Fairbrother, 2010). Những chủng ETEC dương tính với F4 là chủng phổ biến nhất ở heo con theo mẹ bị tiêu chảy, chúng sản xuất độc tố ruột LT và STb, những chủng dương tính với F5, F6 hoặc F41 sản xuất chủ yếu STa, và một vài chủng sản sinh STb, những chủng này gây bệnh tiêu chảy chủ yếu trên heo từ 0 - 6 ngày tuổi, ở heo lớn hơn chiếm tỷ lệ thấp (Fairbrother and Gyles, 2006). Ngoài ra các chủng ETEC phân lập từ heo sơ sinh hoặc cai sữa bị tiêu chảy có chứa độc tố STb hay STb: EAST1 cũng có thể dương tính với AIDA-I (Ngeleka et al., 2003). Kháng nguyên bám dính F4 và F18 chiếm tỷ lệ cao nhất và đóng vai trò quan trọng nhất trong quá trình gây bệnh ở heo con (Frydendahl, 2002; Zhang et al., 2007). 2.5 Tính kháng kháng sinh E. coli có khả năng kháng lại một hoặc nhiều loại kháng sinh, đặc biệt đối với các loại kháng sinh được sử dụng phổ biến trong thức ăn chăn nuôi và điều trị bệnh gia súc (Ahmed et al., 2009). Gần đây, những chủng E. coli có tính đa kháng với nhiều loại kháng sinh ngày càng tăng, đặc biệt với những kháng sinh thường sử dụng hiện nay thuộc họ β-lactam, cephalosporin và các quinolones thế hệ mới (Văn Bích và ctv., 2009). Sự kháng thuốc của vi khuẩn chủ yếu là do gene nằm trên plasmid qui định. Nhờ các gene kháng thuốc này mà vi khuẩn có khả năng chống lại tác dụng của kháng sinh. Sự đề kháng rất bền vững và được truyền sang thế hệ sau qua quá trình di truyền (Kenneth, 2012). 2.6 Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước về ETEC gây bệnh tiêu chảy trên heo con 5 Các nghiên cứu trong nước như Cù Hữu Phú và ctv. (2003), Hồ Soái và Đinh Thị Bích Lân (2005), Trương Quang (2005), Trịnh Quang Tuyên (2006), Đỗ Ngọc Thúy và ctv. (2008) Võ Thành Thìn (2012) và ngoài nước như Frydendahl (2002), Vũ Khắc Hùng và Pilipcinec (2003), Wang et al. (2006), Zhang et al. (2007), Lee et al. (2008) và Chae et al. (2012) trong thời gian qua cho thấy sự phân bố và đặc điểm của E. coli gây bệnh đường ruột nói chung và ETEC nói riêng luôn thay đổi theo thời gian và vùng địa lý. Sự thay đổi này có ảnh hưởng rất lớn đến hiệu quả của các biện pháp phòng chống bệnh cho đàn heo ở các vùng địa lý-kinh tế khác nhau. Riêng ở khu vực ĐBSCL, E. coli được xác định là một trong số các nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy thường xảy ra trên heo con theo mẹ và sau cai sữa (Lý Thị Liên Khai, 2001). Chỉ có 3 nghiên cứu chuyên sâu về E. coli gây bệnh trên heo con ở ĐBSCL của Nguyễn Khả Ngự và Lê Văn Tạo (1996); Lý Thị Liên Khai (2001), Bùi Trung Trực và ctv. (2004) là rất ít ỏi so với các khu vực chăn nuôi heo khác ở trong nước. Chương 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Nội dung nghiên cứu 3.1.1 Phân lập và định danh vi khuẩn E. coli từ phân heo khỏe, heo tiêu chảy và môi trường Phân lập và xác định tỷ lệ nhiễm E. coli từ phân heo khỏe, heo tiêu chảy và môi trường. Định danh các chủng ETEC bằng phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính. 3.1.2 Xác định các yếu tố độc lực của ETEC Xác định sự hiện diện một số gene mã hóa kháng nguyên bám dính F4, F5, F6, F18, Intimin và AIDA-I. Xác định sự hiện diện một số gene mã hóa độc tố STa, STb, LT và EAST1. Thí nghiệm trên động vật thí nghiệm trên chuột và trên heo sau cai sữa. 3.1.3 Xác định đặc tính đề kháng kháng sinh của ETEC Xác định sự kháng kháng sinh của ETEC Xác định gene kháng kháng sinh 3.1.4 Phân tích đặc tính di truyền ở mức độ phân tử của một số chủng ETEC Phân tích trình tự nucleotide gene faeG và fedA mã hóa tiểu phân tử FaeG, FedA của kháng nguyên bám dính F4 và F18 Xác định quan hệ di truyền của các chủng F4 và F18 của ETEC 6 3.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu Địa điểm lấy mẫu: các nông hộ/ trang trại ở 6 tỉnh/ thành thuộc ĐBSCL (An Giang, Bến Tre, Đồng Tháp, Sóc Trăng, Vĩnh Long và Thành phố Cần Thơ). Phòng thí nghiệm: (1) phòng thí nghiệm Vi khuẩn học, Bộ môn Thú y, Đại học Nông nghiệp và Kỹ thuật Tokyo, Nhật Bản; (2) Phòng thí nghiệm Vệ sinh Thực phẩm, Bộ môn Thú Y, khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, Đại học Cần Thơ; (3) Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ; (4) Công ty Macrogen, Hàn Quốc. Thời gian nghiên cứu: 12/2011 – 7/2014 3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Phân lập và định danh vi khuẩn E. coli từ phân heo khỏe, heo con tiêu chảy và môi trường 3.3.1.1 Đối tượng nghiên cứu: Từ tháng 11/2011 đến 12/ 2013, mẫu phân được thu thập từ heo theo mẹ và sau cai sữa mắc bệnh tiêu chảy, mẫu phân heo khỏe và mẫu môi trường. 3.3.1.2 Phương pháp a) Điều tra về hiện trạng nuôi và tình hình bệnh trên heo con Các nội dung cần thu thập khi điều tra được ghi nhận theo phiếu điều tra. b) Lấy mẫu Tổng số mẫu phân thu thập là 2.011, trong đó có 1.272 mẫu từ heo tiêu chảy, 199 mẫu heo khỏe và 540 mẫu môi trường. Mẫu phân: dùng tăm bông vô trùng xoay nhẹ hướng về biểu mô niêm mạc trực tràng heo bị tiêu chảy nghi do E. coli, cho tăm bông có mẫu phân vào lọ vô trùng có chứa môi trường vận chuyển là cary-blair, bảo quản lạnh vận chuyển về phòng thí nghiệm. Số mẫu từ phân tiêu chảy được tiến hành lấy 2-3 mẫu/ đàn và mỗi trại lấy 3-5 đàn. Riêng mẫu phân heo khỏe chỉ lấy 1 mẫu đại diện/ trại. Mẫu môi trường Mẫu nước uống: ở mỗi trại/ hộ dân có heo con tiêu chảy, rửa sạch núm uống và bỏ những giọt nước đầu tiên đi, dùng bọc nilon vô trùng lấy 1.000 ml, bảo quản lạnh 4-8oC đem về phòng thí nghiệm phân lập trong ngày. Mẫu nền ổ úm/ sàn chuồng: dùng tăm bông vô trùng quét nhẹ lên nền chuồng, chổ khô ráo, không dính phân, cho tăm bông vào môi trường chuyên chở, bảo quản lạnh. 7 c) Nuôi cấy, phân lập và định danh vi khuẩn E. coli Nuôi cấy và phân lập E. coli dựa theo quy trình của Barrow and Feltham (2003). Đặc tính sinh hóa của E. coli trên môi trường KIA và các xét nghiệm IMViC (Quin et al., 2004; Gyles and Fairbrother, 2010). d) Định danh các chủng ETEC bằng phản ứng huyết thanh học Chọn 1.141 chủng phân lập được từ 1.141 mẫu phân heo tiêu chảy; 197 chủng từ phân heo khỏe và 220 chủng từ môi trường. Phản ứng ngưng kết tìm chủng F4 (K88), F5 (K99) và F6 (987P) theo Moon et al. (1976) và Moon et al. (1977). 3.3.2 Xác định gene mã hóa các yếu tố độc lực của ETEC 3.3.2.1 Xác định các gene mã hóa một số kháng nguyên bám dính (F4, F5, F6, F18, Intimin, AIDA-I) và độc tố ruột (STa, STb, LT, EAST1) của vi khuẩn ETEC 390 chủng ETEC dương tính với phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính được chọn để tiến hành phản ứng PCR, gồm có 330 chủng từ phân heo con tiêu chảy, 14 chủng từ heo khỏe và 46 chủng từ môi trường được thu thập từ 6 tỉnh/ thành thuộc ĐBSCL. Ly trích DNA mẫu bằng phương pháp đun sôi (Costa et al., 2010). Gene mã hóa cho các loại kháng nguyên bám dính và độc tố của vi khuẩn ETEC được xác định bằng phản ứng PCR. PCR phát hiện gene faeG, fanA, fasA, fedA, eaeA, aidA-I mã hóa kháng nguyên bám dính lần lượt là F4, F5, F6, F18, Intimin và AIDA-I; các độc tố LT, STa, STb và EAST1 được mã hóa bởi các gene elt, estA, estB và astA. Trình tự các cặp mồi dùng để xác định các yếu tố bám dính và độc tố của ETEC dựa theo Boerlin et al. (2005), Ojeniyi et al. (1994), Frank et al. (1998); Fagan et al. (1999) và Vu-Khac et al. (2007). Tổng thể tích các thành phần trong phản ứng PCR là 25 µl, các hóa chất được sử dụng do công ty Promega (Mỹ) sản xuất. 3.3.2.2 Thử nghiệm trên động vật thí nghiệm a) Kiểm tra độc lực của các chủng ETEC trên chuột bạch theo phương pháp của Picard et al. (1999). b) Kiểm tra độc lực của các chủng ETEC qua tiêm truyền cho heo Sử dụng những chủng F4 và F18 gây bệnh trên chuột để kiểm tra độc lực trên heo sau cai sữa, những heo này được kiểm tra không mang kháng thể kháng F4 và F18 bằng phương pháp ELISA gián tiếp theo Verdonck et al. (2002). Tiêm truyền và theo dõi heo thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp của Verdonck et al. (2002) 3.3.3 Xác định đặc tính kháng kháng sinh của các chủng ETEC 8 3.3.3.1 Xác định khả năng kháng kháng sinh của ETEC Khả năng nhạy cảm và kháng kháng sinh của 215 chủng vi khuẩn ETEC được xác định bằng phương pháp khuyếch tán trên đĩa thạch như mô tả của Bauer et al. (1966). Kết quả được đánh giá theo tiêu chuẩn của Clinical and Laboratory Standards Institude (CLSI, 2012). 3.3.3.2 Phát hiện sự hiện diện các gene kháng thuốc của các chủng ETEC bằng phương pháp PCR Quy trình ly trích DNA mẫu, bộ Kit sử dụng trong phản ứng PCR và phân tích sản phẩm PCR được thực hiện như mô tả ở mục 3.3.2.1. Đoạn mồi dựa theo Maynard et al., 2003; Boerlin et al., 2005; Robicsek et al., 2006; Amed et al., 2007b và Võ Thành Thìn, 2012. Những chủng ETEC đề kháng với các kháng sinh nhóm β. lactam được xác định qua phát hiện các gene blaTEM, blaSHV, blaCMY; nhóm aminoglycosid là gene aph(3′)-Ia (aphA1), aph(3′)-IIa (aphA2), aac(3)-IV và aadA; nhóm tetracycline là gene tetA, tetB và, tetC; nhóm phenicol là gene floR; nhóm sulfonamides là gene sulII; nhóm trimethoprim dhfrV; nhóm quinolones là gene qnrA, qnrB và qnrS. 3.3.4 Phân tích đặc tính di truyền ở mức độ phân tử của các chủng ETEC Sử dụng phương pháp BLAST N để tìm sự tương đồng giữa các trình tự 16S rRNA của các chủng vi khuẩn phân lập được với trình tự 16S rRNA đã được đăng tải trên GenBank. Tất cả các trình tự 16S rRNA của các dòng vi khuẩn phân lập cũng như các trình tự 16S rRNA tham khảo từ GenBank sẽ được so sánh cặp với nhau (multi-aligned) bằng CLUSTALW 1.6. Cây phát sinh loài (No Bootstrap NJ tree) được xây dựng dựa trên khoảng cách tiến hóa bằng phần mềm phân tích MEGA5 (Molecular Evolutionary Gentics Analysis, Tamura et al., 2011). 3.4. Thống kê và xử lý số liệu Các số liệu thu thập sẽ được nhập và xử lý bằng phần mềm Excel. Xử lý thống kê bằng phần mềm Minitab 16.0 và phần mềm Microsoft office Excel 2003. Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Phân lập và định danh vi khuẩn E. coli 4.1.1 Phân lập 4.1.1.1 Phân lập vi khuẩn E. coli 9 Ở mỗi mẫu khảo sát được nuôi cấy trên môi trường MC và EMB, tiến hành chọn 3-10 khuẩn lạc E. coli đặc trưng Bảng 4.1: Số khuẩn lạc E. coli phân lập được trong phân và môi trường Địa điểm Phân heo tiêu chảy Phân heo khỏe Môi trường Tổng SMKS SKLPL SMKS SKLPL SMKS SKLPL SMKS SKLPL AG 215 1.030 32 168 82 189 329 1.387 BT 216 1.048 34 171 80 141 330 1.360 CT 211 1.033 29 129 85 184 325 1.346 ĐT 215 1.045 49 243 126 234 390 1.522 ST 203 1.003 23 110 87 140 313 1.253 VL 212 1.036 32 160 80 83 324 1.279 Tổng 1.272 6.195 199 981 540 971 2.011 8.147 SMKS: số mẫu khảo sát; SKLPL: số khuẩn lạc E. coli phân lập được; AG: An Giang; BT: Bến Tre; CT: Cần Thơ; ĐT: Đồng Tháp; ST: Sóc Trăng; VL: Vĩnh Long 8.147 khuẩn lạc E. coli được phân lập từ 2.011 mẫu phân heo tiêu chảy, heo khỏe và môi trường chăn nuôi tại 6 tỉnh/ thành thuộc ĐBSCL. Kết q
Luận văn liên quan