Báo cáo Chiết xuất và phân lập Acid Glycyrrhizic từ Cam thảo

MỤC LỤC Đặt vấn đề ii Tổng quan tài liệu 1 Thực vật học 1 Phân loại thực vật 1 Mô tả thực vật 1 Phân bố, thu hái, chế biến 2 Thành phần hóa học 3 Tác dụng – công dụng 5 Tác dụng chung của cam thảo 5 Các nghiên cứu về tác dụng của glycyrrhizin 6 Chiết xuất phân lập 9 Các phương pháp chiết xuất 9 Phương pháp chiết xuất ngược dòng nhiều giai đoạn (Multi–stage countercurrent extraction - MCE) 9 Phương pháp chiết xuất có hỗ trợ vi ba (Microwave-aissisted extraction) 20 Các phương pháp phân lập 26 Phân lập và tinh khiết hóa bằng cách chiết với dung môi hữu cơ 26 Phương pháp sử dụng sắc ký ngược dòng tốc độ cao (Hight speed counter-current chromatography) 37 Kết luận – nhận định 43 Tài liệu tham khảo 44 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong xu thế Việt Nam giai nhập WTO, ngành dược nước ta có nhiều cơ hội phát triển và cũng đối mặt với không ít khó khăn. Dược liệu là thế mạnh của ngành công nghiệp dược nước ta vì vậy đẩy mạnh phát triển dược liệu là một trong những mục tiêu hàng đầu. Cam thảo là dược liệu truyền thống được sử dụng rộng rãi do có nhiều công dụng, gần đây y học hiện đại quan tâm đến cam thảo với hoạt tính chống virus và có nhiều triển vọng trong điều trị HIV với các kết quả nghiên cứu bước đầu trên glycrryhizic acid chiết xuất từ rễ cam thảo. Vấn đề chiết xuất và phân lập các hợp chất có hoạt tính sinh học trong cam thảo có vai trò quan trọng, cung cấp các hợp chất tinh khiết làm nguyên liệu để tạo ra các chế phẩm thuốc dùng trong điều trị. Bài báo cáo này được thực hiện nhằm cung cấp một số thông tin về quá trình chiết xuât, phân lập tinh khiết hoạt chất Saponin chính trong cây cam thảo – Glycrryhizic acid. TỔNG QUAN: THỰC VẬT HỌC. [1] 1.1.1 Phân loại thực vật. Cam thảo còn có tên là Bắc cam thảo, Cam thảo, Sinh cam thảo, Quốc lão. Tên khoa học Glycyrrhiza uralensis Fish và Glycyrrhiza glabra L. (G. glandulifera Waldst et Kit). Thuộc họ đậu ( cánh bướm) Fabaceae (Papilionaceae). Cam thảo (Radix Glycyrhizae) là rễ và thân rễ phơi hay sấy khô của cây cam thảo nguồn gốc Uran (Glycyrrhiza uralensis Fish.) hay cây cam thảo Châu Âu Glycyrrhiza glabra L. Tên Cam thảo vì cam là ngọt, thảo là cỏ, cỏ có vị ngọt. Glycyrrhiza vì do chữ Hy Lạp Glykos là ngọt và riza là rễ, rễ có vị ngọt, uralensis vì sản xuất ở vùng núi Uran, dãy núi nằm giữa Châu Á, Châu Âu. 1.1.2 Mô tả thực vật: Hình 1: Cây Cam thảo Glycyrrhiza uralensis Fish. Cây Cam thảo (Glycyrrhiza uralensis) là một cây sống lâu năm thân có thể cao tới 1m hay 1,5m. Toàn thân cây có lông rất nhỏ. Lá kép lông chim lẻ, lá chét 9 - 17, hình trứng, đầu nhọn, mép nguyên, dài 2 – 5,5 cm, rộng 1,5 – 3 cm. Vào mùa hạ và mùa thu nở hoa màu tím nhạt, hình cánh bướm dài 14 – 22cm (cây trồng ở Việt Nam sau 3 năm chưa thấy ra hoa). Quả giáp cong hình lưỡi liềm dài 3 – 4 cm, rộng 6 – 8 cm, màu nâu đen, mặt quả có nhiều lông. Trong quả có 2 – 8 hạt nhỏ dẹt, đường kính 1,5 – 2mm màu xám nâu, hoặc xanh đen nhạt, mặt bóng. Tại Trung Quốc mùa hoa tháng 6 – 7, mùa quả tháng 7 – 9. Hình 2: Cây Cam thảo Glycyrrhiza glabra L Cây Cam thảo Glycyrrhiza glabra rất giống loài Cam thảo Glycyrrhiza uralensis, nhưng khác ở chỗ lá chét thuôn dài hơn, dài 1,5 – 4 cm, rộng 0,8 – 2,3mm, quả giáp thẳng hoặc hơi cong, dài 2 – 3cm, rộng 4 – 4,4mm, mặt quả gần như bóng hoặc có lông ngắn, số hạt ít hơn loài trên. Mùa hoa tháng 6 – 8, mùa quả tháng 7 – 9. 1.1.3. Phân bố, thu hái, chế biến: Cây Cam thảo bắc trước đây không có ở nước ta. Từ năm 1958 được du nhập vào Việt Nam bằng những hạt giống của loài Glycyrrhiza uralensis do Liên Xô cũ cung cấp. Cây mọc khỏe vào mùa xuân hạ và thu. Đến mùa đông thì lụi đi hoặc kém phát triển. Sang năm sau cây lại mọc mới. Lượng chất trong rễ mỗi năm mỗi tăng. Tuy nhiên, sau 3 năm cây vẫn chưa ra hoa. Một số tài liệu nói rằng cây trồng thường không ra hoa. Trồng bằng hạt hoặc bằng thân rễ. Sau 4 – 5 năm trở lên có thể thu hoạch. Đào rễ và thân rễ vào mùa xuân hoặc thu đông. Nhưng mùa thu đông cam thảo tốt hơn. Mỗi hecta có thể thu hoạch 8 – 10 tấn. Vì là một cây lâu năm mới thu hoạch cho nên trong 2 – 3 năm đầu người ta thường trồng xen các cây thực phẩm. Khi đào thường người ta chỉ lấy rễ, nhưng nhiều khi lấy cả thân rễ. Thân rễ dài, có khi tới 7 – 8m. Sau khi đào rễ, người ta xếp đống để cho hơi lên men, làm cho rễ có màu vàng sẫm hơn, là màu người ta chuộng hơn. Tại Liên Xô cũ, Trung Quốc và nhiều nước khác cây Cam thảo mọc hoang và trở thành một thứ cỏ khó diệt trừ, chỉ một mẫu thân rể có thể trở thành bụi Cam thảo và cứ như vậy lan ra rộng mãi. Những khu vực Cam thảo mọc hoang là nơi có đất khô, đất có Calci, đất cát, đất cát vàng. Những nơi có đất đen cứng chắc, kiềm tính và ẩm thấp thì lượng Cam thảo kém hơn, nhiều xơ, tí bột, ít ngọt, rễ mọc cong queo. THÀNH PHẦN HÓA HỌC. [2] [3] Glycyrrhiza glabra L. Chất vô cơ 4 - 6%, carbohydrate 3 - 5%, malnitol, tinh bột 25 -30%, lipid 0,5 – 1%, asparagin 2 – 4 %, nhựa 5% . Glycyrrhizin là một saponin thuộc nhóm olean, hàm lượng từ 10 – 14% trong dược liệu khô, chỉ có trong bộ phận dưới mặt đất, có vị rất ngọt. Đây là saponin quan trọng trong rễ Cam thảo. Glycyrrhizin được Robiquet phân lập năm 1809 dưới dạng mảnh màu vàng. Glycyrrhizin tinh khiết dạng bột màu trắng dễ tan trong nước nóng, cồn loãng, ít tan trong nước lạnh, nếu để nguội sẽ tạo thành gel, không tan trong ether và chloroform. Nếu cho vào nước lắc thì tạo bọt. Độ ngọt gấp 60 lần saccharose, nhưng nếu phối hợp với mía, độ ngọt lại tăng lên và có thể gấp 100 lần. Dưới tác dụng của acid vô cơ, acid glycyrrhizic bị đẩy ra khỏi muối của nó. Khi thủy phân bằng acid thì nó cho phần aglycon là acid glycyrrhetic ( còn gọi là acid glycyrrhetinic) và 2 phân tử acid glucuronic. Acid glycyrrhetic có một nhóm OH ở C-3 ( nối với 2 phân tử acid glucuronic) một nhóm carbonyl ở C-11, một nối đôi ở C-12-13 và ở C-30 là nhóm carboxyl. Trên thị trường, glycyrrhizin thương phẩm là amoni glycyrrhizat thu được bằng cách chiết bột cam thảo với nước rồi acid hóa để kết tủa, rửa tủa rồi lại hòa tan trong amoniac, bốc hơi trong các khay mặt bằng sẽ thu được những vảy màu đen nhạt, bóng, tan trong nước và rất ngọt. Hàm lượng glycyrrhizin là 6 – 12% ( dược liệu khô). Hình3: Glycyrrhizic acid. Trong Cam thảo còn có các dẫn chất triterpenoid khác như: acid liquiritic (acid này khác acid glycyrrhetic bởi nhóm carboxyl ở C-29), acid 18-α-hydroxy-glycyrrhetic, acid 24-α-hydroxyglycyrrhetic, glabrolid, deoxyglaborid, isoglabrolid, 24-α-hydroxyisoglabroid, acid liquiridiolic, aicd 11-deoxyglycyrrhetic, acid 24-hydroxy 11-deoxyglycyrrhetic. Các flavonoid là nhóm hoạt chất quan trọng thứ hai trong rễ Cam thảo với hàm lượng 3 – 4%. Có 27 chất đã được biết, quan trọng nhất là hai chất liquiritin (hay liquiritirosid) và isoliquiritin (hay isoliquiritirosid ). Hình 4: Flavonoid chính trong rễ cây cam thảo. Liquiritin được Shinoda và Ueda (1934) phân lập, chất này thuộc nhóm flavanon, có phần aglycon là liquiritigenin ( 4’,7dihydroxy – flavanon). Isoliquiritin được Puri và Seshadri phân lập (1954). Chất này là đồng phân của chất trên và thuộc nhóm chalcon, phần aglycon là isoliquiritigenin ( 4,4’,6’ – trihydroxy chalcon). Isoliquiritigenin ở môi trường acid thì đồng phân hóa thành liquiritigenin. Ngoài ra còn có nhiều flavonoid thuộc các nhóm khác: isoflavan (gla-bridin), isoflavon (glabron), isoflaven (glabren). Những hoạt chất estrogen steroid: phần này tan trong ether dầu hỏa, khi thí nghiệm trên chuột cống đã thiến thì thấy xuất hiện những tế bào sừng non trong niêm dịch âm đạo. Những chất coumarin: umbelliferon, herniarin, liqcoumarin (6-acetyl – 5 – hydroxy – 4 – methyl coumarin). Glycyrrhiza uralensis Fisch. Rễ chứa carbohydrate 4,7 – 10,97%, tinh bột 4,17 – 5,92%; glycyrrhizin 5,49 – 10,04%, acid 24 – hydroxy glycyrrhetic, acid 3β – hydroxyolean – 11,13 (18) dien – 30 – oic, acid 3β hydroxyolean – 19 (11), 12 (13) dien – 30 oic; flavonoid có khoảng 20 chất trong đó những chất chính là liquiritin, liquiritigenin , isoquiritin, isoliquiritigenin, neoliquiritin, (dl) – liquiritigenin – 7 - β – D – glucopyranosid, neo – isoliquiritin (trans – isoliquiritigenin – 4- β – D – glycopyranosyl – 2 – β – D – apio – d (hay l ) – furanosid). TÁC DỤNG – CÔNG DỤNG. Tác dỤng và công dỤng chung cỦa Cam thẢo:[2] Tác dụng dược lý: Tác dụng gây trấn tĩnh, ức chế thần kinh trung ương, giảm vận động tự nhiên, hạ thể nhiệt, giảm hô hấp; giảm ho; giảm co thắt cơ trơn; chữa loét đường tiêu hóa, ức chế tác dụng gây tăng tiết dịch vị của histamin; bảo vệ gan trong viêm gan mạn tính và tăng bài tiết mật; chống viêm gan và chống dị ứng; tác dụng giống oestrogen; chữa bệnh addison; tác dụng giải độc. Tính vị, công năng: Rễ Cam thảo bắc có vị ngọt, tính bình. Để sống ( đồ mềm, sấy khô) có tác dụng giải độc, tả hỏa; tẩm mật, sao vàng ( chích Cam thảo), lại có tác dụng ôn trung, nhuận phế, điều hòa các vị thuốc. Công dụng: Cam thảo sống được dùng chữa cảm, ho mất tiếng, viêm họng, mụn nhọt, đau dạ dày, ỉa chảy, ngộ độc. Cam thảo chích có tác dụng bổ, chữa tỳ vị hư nhược, ỉa lỏng, thân thể mệt mỏi, kém ăn. Các nghiên cứu gần đây cho thấy Cam thảo bắc còn có thêm một số tác dụng: Chữa loét dạ dày ruột, có tác dụng giảm loét, giảm co thắt cơ trơn, giảm tiết acid hydroclorid; chữa bệnh addison. Cam thảo bắc dùng phối hợp với cortison có thể làm giảm tác dụng của cortison. Cam thảo bắc làm cho thuốc có vị ngọt, dễ uống và thường có trong thành phần các thuốc viên, thuốc phiến, kẹo ngậm, siro chữa ho. Theo tài liệu nước ngoài, trong y học Trung Quốc, Cam thảo bắc dùng phối hợp với một số dược liệu khác làm thuốc long đờm chữa ho gà, thuốc để bao và bảo vệ niêm mạc dạ dày, thuốc chữa lao phổi và viêm phế quản, thuốc giải độc đối với ngộ độc thịt và nấm, thuốc có tác dụng làm trẻ người. Rễ Cam thảo bắc còn có tác dụng nhuận tràng nhẹ, được dùng chữa các chứng bệnh xuất tiết và các chứng kích thích niêm mạc các cơ quan đường tiết niệu. Trong y học dân gian Ấn Độ, Cam thảo bắc còn được dùng nhai với lá trầu không, nhào với bơ sữa trâu hoặc mật ong để đắp ngoài chữa vết chém, vết thương. Các nghiên cỨu vỀ tác dỤng cỦa Glycyrrhizin ( Acid Glycyrrhizic).[4] Giá trị y học của rễ cam thảo là do chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học như triterpen glycoside, hợp chất phenolic, oligo và polysaccharides, lipid, sterine… quan trọng nhất là triterpen glycoside, acid glycyrrhizic (GL) và aglycone của nó, 18β-glycyrrhetinic acid (GLA), một pentacyclic triterpen thuộc nhóm β-amyrin. GA và aglycone của nó có nhiều hoạt tính sinh học (kháng viêm, chống loét, chống dị ứng, chống giảm khả năng nhận thức, chống oxi hóa, chống virut, chống khối u),… muối monoammonium của GL (glycyram, tusillnar) được dùng làm biện pháp khắc phục chống dị ứng, kháng viêm cho chữa bệnh hen suyễn, eczemas, và các bệnh khác. Thuốc này được ứng dụng để giảm hiện tượng dung nạp glucocorticosteroid. Muối Natri của hemisuccinate acid glycyrrhetinic (carbenoxolone) được sử dụng thành công cho điều trị loét dạ dày tá tràng. Sự tương đồng về cấu trúc của GL aglycone đến 11- ketosteroid xác định cũng tương đồng trong hoạt tính sinh học. Vì thế, GL và aglycone ảnh hương đến chuyển hóa muối nước, ức chế sự oxi hóa do nhiễm độc phospho, quá trình sinh tổng hợp mucopolysaccharic và hoạt tính của men phospholipase A2, cải thiện hoạt tính của glutamic transaminase. GL và GLA ảnh hưởng đến sự tăng acid arachidonic, ức chế quá trình tổng hợp prostaglandine và leucotriene. Monoammonium glycyrrhizate ức chế hình thành PGE2 và PGF2a ở thận chuột in vitro và invivo tương đương với indomethacin. Tác động chống dị ứng của GL do tác dụng đối kháng với acetylcholine, histamine và các chất kích thích dị ứng. Monoammonium glycyrrhizate và GLA được ghi nhận như là một tác nhân làm giảm lipid và chống oxi hóa. Tác dụng kháng viêm của GL và aglycone của nó được tìm thấy với tác dụng chống loét gây ra bởi quá trình tổng hợp acid nucleic ở niêm mạc dạ dày. Hoạt tính giải độc của GL được xác định chắn bởi sư hiện diện của acid glucuronic trong cấu trúc của nó. GL và muối của nó có thể chống lại liều gây chết của strychnine, nicotinic, caffeine, histamin, và các chất độc khác, và được đề nghị sử dụng như những chất giải độc. GL ngăn sự tổn thương tế bào gan ở chuột do các chất gây độc như allylformiate, acid linolic, galatose amine, và CCl4. Tính chất bảo vệ tế bào gan của GA được cho là liên quan đến tác dụng chống oxy hóa của nó. Vì thế GL ức chế sản phẩm aminotrasferases từ tế bào gan chuột trên vitro và chất gây độc tế bào gan trên vivo và giảm lượng lipid peroxides ở chuột giống như α-tokoferol. GL được sử dụng trên lâm sàng ở Nhật bằng đường tĩnh mạch để trị viêm gan siêu vi B mãn . GL thay đổi sự vận chuyển trong tế bào, ngăn chặn quá trình syalyl hóa của virut viêm gan siêu vi B,C trên bề mặt kháng nguyên trong ống nghiệm. Điều đó chỉ ra rằng chữa trị của SNMC cho bệnh nhân bị nhiễm virut viêm gan C làm giảm transaminase trong huyết tương hoạt động ngay cả trong các bệnh nhân kháng trị với interferon. GL kích thích sản xuất g-interferon trong ống nghiệm. Trên lâm sàng GL tiêm tĩnh mạch kích thích g-interferon diệt thông thường (normal killers) và interferon trong huyết tương. Một tác dụng kích thích của GL trên sự tiết của interleukin-2 được tìm thấy trong những dòng bạch cầu ngoại vi nuôi cấy. GL và muối monoammonium ức chế sự tăng trưởng AND và ARN của virut (vaccinia, bệnh New Castle, mụn nước, bệnh thủy đậu, zona, cúm…) in vitro. GL là một trong những glycoside thiên nhiên đầu tiên ức chế virut gây bệnh HIV type 1 (HIV-1) trong nhóm 4 loại tế bào, được chứng minh bởi các nhà nghiên cứu lâm sàng học, sự kiểm soát của GL đến bệnh nhân AIDS là trì hoãn sự tiến triển của triệu chứng nhiễm HIV. Điều trị đầu tiên với GL được bắt đầu sớm khi HIV-1 chưa có triệu chứng, đã bảo vệ bệnh nhân hơn 11 năm mà không có cảm ứng của thuốc chống lại. Người ta khám phá ra rằng sự trị liệu đồng thời GL cùng với azidotymidine (AZT) làm giảm tác dụng phụ của thuốc AZT. Cơ chế chống lại hoạt động của HIV của GL là nối với cấu trúc polyanionic của nó. GL ngăn cản bằng cách bám vào virut và ức chế proteinkinase C là yếu tố phải có cho sự liên kết của HIV-1 với các receptor của tế bào CD4. Ngày nay GL là thuốc đang được quan tâm trong việc chữa bệnh và thay đổi cấu trúc của nó sẽ tạo ra những hợp chất có hoạt tính sinh học cho y học. CHIẾT XUẤT – PHÂN LẬP. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT. Phương pháp chiết xuất ngược dòng nhiều giai đoạn (Multi–stage countercurrent extraction - MCE)[6]. Thiết kế thí nghiệm. Mẫu cam thảo nguyên liệu. Mẫu rễ cam thảo thô (Glycyrrhiza uralensis Fisch) được cung cấp bởi nhóm nghiên cứu ELION. Mẫu được xác thực bởi Giáo sư ShouQuan Lin thuộc Trung Tâm Cây Thuốc, Viện Hàm Lâm Khoa Học và Y Khoa Trung Quốc (Institute of Medicinal Plants, Chinese Academy Medical Sciences). Hàm lượng GA trong mẫu cam thảo thô là 3,72% về khối lượng, được xác định bởi phân tích HPLC. Mẫu cam thảo được cắt thành lát tròn dày khoảng 3mm với đường kính từ 5-10mm Thuốc thử. Acetonitrile, acid trifluoroacetic, ethanol và nước amoniac (25% amoniac trong nước) được sử dụng trong thí nghiệm đều đạt chuẩn phân tích. Thuốc thử được cung cấp bởi công ty hóa chất Sigma. Acid Glycyrrhizic được cung cấp bởi nhóm nghiên cứu ELION. Nước được sử dụng trong chiết xuất cam thảo và dùng làm pha động trong phân tích HPLC đều được cất bởi thiết bị cất nước Millipore (Millipore, USA). Thiết bị. Tất cả các thử nghiệm MCE đều được thực hiện trên thiết bị MCE Model DN-1.5 (Hangzhou Chunjiang Pharmacy Mechine Co., Ltd., Hangzhou, China). Chiết xuất có hỗ trợ vi sóng (MAE) được thực hiện trên thiết bị chiết xuất vi sóng Model WCD2S-1 có bộ điều nhiệt tự động và kiểm suất năng lượng (Nanjing Sanle Microwave Technology Co., Ltd., Nanjing, China). Chiết siêu âm (USE) được thực hiện trên thiết bị chiết siêu âm Model SK3200LH (Shanghai Kudos ultrasonic instrument Co., Ltd., Shanghai, China). Chiết bằng Soxhlet (SHE) được thực hiện trên bình chiết Soxhlet thủy tinh thông dụng. Phân Tích HPLC được thực hiện trên thiết bị HPLC Agilent Model 1100 (Agilent Co., Ltd., USA) bao gồm thiết bị bơm, đầu dò mảng lưỡng cực (diode array detector - DAD) và bộ phận tiêm mẫu tự động. Trước khi phân tích HPLC, dịch chiết được đem đi quay ly tâm với tốc độ cao (12000 vòng/phút) trong 10 phút bởi Máy quay li tâm đông lạnh MIKRO 22R (Hettich, Germany) Các phương pháp chiết xuất thông thường khác. Chiết xuất ở nhiệt độ thường (RTE) được thực hiện trên một cốc thủy tinh bằng cách trộn 1,0g bột Glycyrrhiza uralensis Fisch với 16ml nước. Ngâm hỗn hợp ở 25-29°C trong vòng 44 giờ, thường xuyên lắc đều. USE được thực hiện bởi bồn chiết siêu âm: 1,0g bột Glycyrrhiza uralensis Fisch được trộn với 16ml nước trong bình nón, sau đó đem chiết siêu âm trong 40 phút. SHE được thử nghiệm bằng cách trộn 4,0g bột Glycyrrhiza uralensis Fisch với 64ml nước trong 4 giờ. Thử nghiệm MAE với 1,0kg bột Glycyrrhiza uralensis Fisch với 16l nước. Sau đó chỉnh nhiệt độ cho hệ thống là 60°C và thời gian chiết là 54 phút. Phương pháp chiết xuất ngược dòng nhiều giai đoạn. Hình 5: Sơ đồ bố trí hệ thống MCE: A – G là các đơn vị chiết; 2 - bình chiết; 3 - bình dung môi; 4, 5, 8 là các vale đóng – mở; 6 – bơn tái tuần hoàn (re-circulating pump); K – đường ống chính nối các đơn vị chiết từ A đến G; 1, 7 – là các đường ống nối giữa bình dung môi với bình chiết và bơm. Các thiết bị sử dụng bao gồm các đơn vị chiết theo tuần tự từ A đến G, được nối với nhau bằng đường ống dẫn chung K, các đơn vị chiết có cùng một cấu trúc và kích cỡ bao gồm một bình chiết, một bình đựng dung môi và một bơm. Các đơn vị chiết được vận hành trong một chu trình khép kín, dung môi được bơm từ các vale ở đáy bình vào bên trong, hòa trộn với bột dược liệu và chảy ra khỏi bình qua vale ở phía trên và quay trở về bơm. Quá trình chiết xuất ngược dòng có thể phân ra 2 giai đoạn: đầu tiên, là giai đoạn điều hòa (Conditioning stage), sau đó là giai đoạn chiết (extraction stage). Trong giai đoạn điều hòa mẫu khoảng 300g rễ Cam thảo được trộn với một tỷ lệ tương ứng dung môi trong mỗi đơn vị chiết. Sau quá trình này, các bã dược liệu bên trong bình được tiếp tục chiết với một khoảng thời gian được ấn định trước. Những khoảng thời gian này khác nhau đối với những đơn vị chiết khác nhau và được thiết kế trước nhằm tạo ra một gradient nồng độ giữa các bình trong dãy. Ví dụ, gradient nồng độ cho việc chiết xuất 5 giai đoạn (five-stage extractor) thu được bằng cách ngâm các bã (bột – slurry) dược liệu trong các bình tương ứng A – E trong các khoảng thời gian 4T/6, 3T/6, 2T/6, T/6 và 0 phút, với T là tổng thời gian chiết xuất (total running time) của quy trình chiết xuất ngược dòng nhiều giai đoạn. Sau thời gian ngâm, dịch chiết với đơn vị A được chuyển sang E, và dịch chiết của đơn vị B được đổi với dịch chiết của đơn vị D. Cùng lúc đó, dung môi mới được thêm vào đơn vị A. Gradient nồng độ của GA trong mẫu dược liệu và trong dịch chiết của các đơn vị chiết khác nhau được minh họa bằng hình sau: Đơn vị chiết Trước khi chiết Chiết xuất Đổi dung môi Sau khi chiết Sau khi đổi dung môi Hình 6: Sơ đồ minh họa cho giai đoạn điều hòa (Conditioning stage): hình () – bình chiết, (0) – bình đựng dung môi chiết, (ä) – nồng độ GA tương ứng của dược liệu trong bình chiết và trong dung môi. Lần 1 kết thúc Các đơn vị chiết Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 Lần 6 bắt đầu bắt đầu bắt đầu bắt đầu bắt đầu bắt đầu kết thúc kết thúc kết thúc kết thúc kết thúc Sau giai đoạn điều hòa là giai đoạn chiết (extraction stage), giai đoạn này được minh họa bằng sơ đồ bên dưới. Quá trình từ 1 đến 5 trong sơ đồ minh họa cho quá trình di chuyển của GA giữa dung môi và bã (bột) dược liệu trong từng quá trình liên tiếp. Trong mỗi quá trình bao gồm 4 công đoạn cơ bản. Hình 7: Minh họa cho một quy trình chiết – five stages MCE. Lấy quá trình 1 làm ví dụ, các công đoạn bao gồm: (1) chiết xuất dược liệu với thời gian định trước; (2) thay bã dược liệu của đơn vị A và thu gom dịch chiết của đơn vị E; (3) chuyển dung môi chiết trực tiếp từ C → E, A → C, D → A, B → D; (4) thêm lượng b