Báo cáo Nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn Bacillus subtilis để khử protein vỏ tôm

TRƯỜNG …………………. KHOA………………………. -----[\ [\----- Báo cáo tốt nghiệp Đề tài: Nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn Bacillus subtilis để khử protein vỏ tôm Lu n v ăn t t nghi p Ph m Th Trang K49 ================================================================= B GIÁO D C VÀ ðÀO T O CNG HÒA Xà H I CH NGH ĨA VI T NAM TR ƯNG ð I H C BÁCH KHOA HÀ N I ðc l p – T do – H nh phúc NHI M V LU N V ĂN T T NGHI P H và tên sinh viên : Ph m Th Trang Khóa: 49 S hi u sinh viên : 20043179 Vi n : Công ngh sinh h c và th c ph m Ngành : Công ngh các s n ph m lên men ð tài t t nghi p: “ Nghiên c u ng d ng vi khu n Bacillus subtilis ñ kh protein v tôm ”. Giáo viên h ưng d n : TS. Lê Thanh Hà Ngày giao lu n v ăn : Ngày hoàn thành lu n v ăn : Hà Ni, ngày 5 tháng 6 năm 2009 Tr ưng b môn Gi ng viên h ưng d n PGS.TS Nguy n Thanh H ng TS Lê Thanh Hà LI C M ƠN ============================================================== 1 Lu n v ăn t t nghi p Ph m Th Trang K49 ================================================================= Em xin chân tr ng c m ơn Vi n Công ngh sinh h c và Công ngh th c ph m – Tr ưng ð i h c Bách Khoa Hà N i ñã t o m i ñiu ki n thu n l i cho em th c hi n và hoàn thành lu n v ăn t t nghi p. Em xin bày t lòng bi t ơn sâu s c ñ n TS. Lê Thanh Hà ñã t n tâm, chu ñáo h ưng d n và có nh ng ch d n quan tr ng, quý giá giúp em hoàn thành lu n văn. Em xin chân thành c m ơn s giúp ñ nhi t tình c a các th y cô, anh ch cán b các Phòng, B môn trong Vi n Công ngh sinh h c và Công ngh th c ph m ñã nhi t tình quan tâm, giúp ñ và t o ñiu ki n thu n l i cho em trong quá trình nghiên c u th c hi n lu n v ăn t t nghi p. Cu i cùng em xin bày t lòng bi t ơn sâu s c ñ n nh ng ng ưi thân trong gia ñình cùng toàn th các b n bè ñã ñng viên và giúp ñ em v ưt m i khó kh ăn hoàn thành lu n v ăn t t nghi p. Hà N i, ngày … tháng … n ăm … SV th c hi n Ph m Th Trang ============================================================== 2 Lu n v ăn t t nghi p Ph m Th Trang K49 ================================================================= Mc L c M ð U .................................................................................................................... 8 I. TNG QUAN...................................................................................................... 9 I.1 HI N TR NG KHAI THÁC VÀ CH BI N TH Y S N ....................... 9 I.1.1 Thành ph n ph ph m tôm ....................................................................... 9 I.1.2 Ph th i trong công nghi p ch bi n......................................................... 9 I.1.3 Cu t o và thành ph n hoá h c c a ph li u tôm ................................... 10 I.1.3.1 Cu t o hóa h c c a ph li u v tôm .............................................. 10 I.1.3.2 Thành ph n hóa h c c a v tôm ..................................................... 11 I.2 M T S TÍNH CH T VÀ NG D NG C A CHITIN VÀ CHITOSAN.. 13 I.2.1 Tng quan v chitin ................................................................................ 13 I.2.1.1 S t n t i c a chitin trong t nhiên ................................................. 13 I.2.1.2 Cu t o c a chitin............................................................................ 13 I.2.1.3 Tính ch t c a chitin ......................................................................... 14 I.2.2 Tng quan v chitosan............................................................................ 15 I.2.2.1 Cu trúc phân t c a chitosan ......................................................... 15 I.2.2.2 Tính ch t c a chitosan..................................................................... 15 I.2.3 ng d ng c a chitin và chitosan ............................................................ 16 I.2.3.1 Trong công ngh th c ph m............................................................ 16 I.2.3.2 Trong y d ưc ................................................................................... 18 I.2.3.3 Trong x lý môi tr ưng................................................................... 20 I.2.3.4 Trong nông nghi p .......................................................................... 20 I.2.3.5 Trong công ngh m ph m ............................................................. 21 I.2.4 Ph ươ ng pháp thu nh n chitin.................................................................. 21 I.2.4.1 Ph ươ ng pháp hóa h c ...................................................................... 21 I.2.4.2 Ph ươ ng pháp c ơ h c........................................................................ 23 I.2.4.4 Ph ươ ng pháp sinh h c ..................................................................... 23 I.3. Bacillus subtilis .......................................................................................... 25 I.3.1 Gi i thi u v vi khu n Bacillus subtilis.................................................. 25 I.3.2 Các y u t nh h ưng ñ n sinh tr ưng c a Bacillus subtilis ................. 25 I.3.2.1 Môi tr ưng dinh d ưng ................................................................... 25 I.3.2.2 Nhi t ñ ........................................................................................... 27 I.3.2.3 pH .................................................................................................... 27 I.3.2.4 Ngu n O2 ................................................................................................27 I.3.3 Tình hình nghiên c u quá trình kh protein ph li u tôm b ng Bacillus subtilis t i Vi t Nam và trên th gi i................................................................. 27 II. V T LI U VÀ PH ƯƠ NG PHÁP NGHIÊN C U .......................................... 29 II.1 V T LI U ...................................................................................................... 29 II.1.1 Vi sinh v t ........................................................................................... 29 II.1.2. V tôm................................................................................................. 29 ============================================================== 3 Lu n v ăn t t nghi p Ph m Th Trang K49 ================================================================= II.1.3 Các lo i thi t b s d ng ......................................................................... 29 II.1.4 Các môi tr ưng c ơ b n s d ng trong nghiên c u.................................. 30 II.1.5 Các hóa ch t s d ng .............................................................................. 30 II.2 PH ƯƠ NG PHÁP NGHIÊN C U .................................................................. 30 II.2.1 Ph ươ ng pháp vi sinh................................................................................ 30 II.2.1.1 Ph ươ ng pháp nuôi c y l ng ......................................................... 30 II.2.1.2 Ph ươ ng pháp lên men v tôm.......................................................... 30 II.2.2 Ph ươ ng pháp hóa sinh............................................................................ 30 II.2.2.1 Ph ươ ng pháp xác ñnh ho t ñ proteaza b ng ph ươ ng pháp khuy ch tán ñĩa th ch ................................................................................................... 30 II.2.2.2 Ph ươ ng pháp xác ñnh ho t ñ proteaza b ng ph ươ ng pháp Anson ci ti n ......................................................................................................... 31 II.2.2.3 Ph ươ ng pháp xác ñnh hàm l ưng protein b ng ph ươ ng pháp Biuret ………………………………………………………………………………32 II.2.3. Ph ươ ng pháp qui ho ch th c nghi m b m t ñáp ng........................ 34 III. KT QU VÀ TH O LU N ....................................................................... 35 III.1 Tuy n ch n ch ng sinh t ng h p protease cao ............................................. 35 III.1.1 ðnh tính b ng ph ươ ng pháp ño ñưng kính vòng thu phân................ 35 III.1.2 ðnh l ưng b ng ph ươ ng pháp ño ho t l c proteaza t o thành theo ph ươ ng pháp Anson c i ti n .............................................................................. 36 III.2 T i ưu hóa ñiu ki n sinh t ng h p proteaza ............................................... 37 III.2.1 Ch n các y u t nh h ưng .................................................................... 37 III.2.1.1 nh h ưng c a pH....................................................................... 37 III.2.1.2 nh h ưng c a n ng ñ CaCl 2 .................................................... 38 III.2.1.3 nh h ưng c a n ng ñ ñưng ................................................... 39 III.2.1.3 nh h ưng c a th i gian nuôi c y .............................................. 39 III.2.2 T i ưu hóa ñiu ki n nuôi c y b ng ph ươ ng pháp b m t ñáp ng........ 40 III.3 Tìm ñiu ki n thích h p cho quá trình lên men ph li u tôm lo i protein ... 43 IV. KT LU N......................................................................................................... 47 V. PH L C………………………………………………………………………..47 ============================================================== 4 Lu n v ăn t t nghi p Ph m Th Trang K49 ================================================================= TÓM T T N I DUNG Chitin có r t nhi u trong v c a tôm, ñ ng th i d n xu t c a nó là chitosan l i có ho t tính sinh h c cao và ñưc ng d ng nhi u trong công nghi p d ưc, trong nông nghi p và trong công ngh th c ph m…Qui trình thu h i chitin t v tôm g m hai quá trình là quá trình lo i b ch t khoáng và lo i b protein. Ph ươ ng pháp kh protein s d ng hi n nay là ph ươ ng pháp hóa h c dùng bazo m nh nh ư NaOH. Ph ươ ng pháp này có nh ưc ñim là ch t th i c a quá trình có ch a ch t ăn mòn, làm ô nhi m môi tr ưng, d ch th y phân có ch t l ưng kém không thu h i l i ñưc. Hi n nay nhi u nghiên c u t p trung vào s d ng ph ươ ng pháp sinh h c ng d ng các ch ng vi khu n có kh n ăng sinh enzyme proteaza thu phân lo i b protein ra kh i nguyên li u, kh c ph c các nh ưc ñim c a ph ươ ng pháp hóa h c. Mc ñích c a ñ tài nghiên c u này là tuy n ch n ch ng vi sinh v t có ho t tính proteaza cao, t i ưu hóa ñiu ki n nuôi c y thu d ch enzym có ho t l c proteaza cao và ng d ng trong kh protein c a v tôm. T 11 ch ng vi khu n chúng tôi ñã ch n ñưc ch ng Bacillus subtilis DT2 có ho t l c proteaza cao. Ti n hành qui ho ch th c nghi m b ng ph ươ ng pháp b m t ñáp ng ñã ch n ñưc ñiu ki n t i ưu ñ thu d ch enzyme là CaCl 2 0,5g/l, n ng ñ glucoza 0,5 g/l, pH 9,37 và th i gian nuôi c y là 14h. ng d ng d ch enzyme c a ch ng Bacillus subtilis có th kh ñưc 96,14% protein trong v tôm. ============================================================== 5 Lu n v ăn t t nghi p Ph m Th Trang K49 ================================================================= DANH M C CÁC B NG BI U VÀ S Ơ ð Tên b ng Trang Bng 1.1 : Thành ph n hoá h c c a ph li u tôm ………………………………….10 Bng 2.1 : Gía tr mã hoá và th c nghi m…………………………………………. 31 Bng 3.1 : ðung kính khu n l c và vòng thu phân................................................33 Bng 3.2 : ðưng kính vòng thu phân…………………………………………….34 Bng 3.3 : Ho t ñ proteaza c a 3 ch ng nghiên c u………………………………34 Bng 3.4 : nh h ưng c a pH ban ñ u ñ n ho t ñ proteaza thu ñưc…………….35 Bng 3.5 : nh h ưng c a th i gian nuôi c y………………………………………39 Bng 3.6 :nh h ưng c a th i gian nuôi c y trong ph ươ ng pháp quy ho ch th c nghi m b m t………………………………………………………………………40 Bng 5.1 : Các thì nghi m th c nghi m ti n hành trong qui ho ch t i ưu và k t qu …………………………………………………………………………………..45 ============================================================== 6 Lu n v ăn t t nghi p Ph m Th Trang K49 ================================================================= DANH M C CÁC HÌNH V VÀ ð TH Tên hình v Trang Hình 3.1 : nh h ưng c a pH ñ n ho t ñ proteaza c a ch ng DT2........................37 Hình 3.2 : nh h ưng c a n ng ñ CaCl2 ñn ho t ñ proteaza c a ch ng DT2….37 Hình 3.3 : nh h ưng c a n ng ñ glucoza ñ n ho t ñ proteaza ca ch ng DT2………………………………………………………………………………... 39 Hình 3.4 . nh h ưng c a t ng y u t ñ n ho t ñ proteaza khi c ñ nh các y u t còn lai. A, B, C và D là các giá tr c a các bi n n ng ñ CaCl 2, n ng ñ glucoza, th i gian và pH t ươ ng ng………………………………………………………….41 Hình 3.5 . nh h ưng c a th i gian và n ng ñ CaCl 2 ñn ho t ñ proteaza...........41 Hình 3.6 . nh h ưng c a pH và n ng ñ CaCl 2 ñn ho t ñ proteaza…………….42 Hình 3.7 . nh h ưng c a th i gian và n ng ñ glucoza ñ n ho t ñ proteaza……43 Hình 3.8 nh h ưng c a t l và th i gian lên men ñn hi u su t lên men……….45 ============================================================== 7 Lu n v ăn t t nghi p Ph m Th Trang K49 ================================================================= M ð U Trong nh ng n ăm g n ñây, ngành nuôi tr ng, khai thác và ch bi n th y s n xu t kh u Vi t Nam ñã phát tri n m nh m , trong ñó tôm ñông l nh xu t kh u ñã ñem l i thu nh p ngu n ngo i t cho ñ t n ưc r t ñáng k . Tuy nhiên, cùng v i s phát tri n ñó thì m t l ưng l n ph li u th i ra c ũng r t l n. Do v y, m t v n ñ ñ t ra là nghiên c u t n d ng ngu n ph li u ñ s n su t ra các m t hàng có giá tr gia tăng, nh m ñ m b o yêu c u s n xu t s ch h ơn, ñng th i c ũng ñem l i ngu n kinh t ñáng k . Hi n nay, vi c t n d ng ph li u tôm ñưc th c hi n theo h ưng s n xu t chitin – chitosan. Tuy nhiên, trong quá trình s n xu t chitin và chitosan t v tôm cn ph i qua các b ưc x lý nh ư kh khoáng và protein. Trong n ưc th i có ch a mt thành ph n l n và quan tr ng là protein. Chính vì v y vi c nghiên c u ñ ñưa ra quy trình thu h i protein là r t c n thi t. N u thu h i h n h p này ta có th s d ng ñ b sung vào th c ăn gia súc, nuôi tr ng th y s n v a góp ph n làm t ăng giá tr kinh t cho quy trình s n xu t chitin v a góp ph n gi i quy t v n ñ ô nhi m môi tr ưng do d ch th i này gây ra. Nh n th y tính c p thi t c a v n ñ thu h i protein t quy trình s n xu t chitin chúng tôi ñã ti n hành nghiên c u ñ tài: “Nghiên c u ng d ng vi khu n Bacillus subtilis ñ kh protein v tôm ” Mc ñích c a ñ tài : Ti ưu hoá ñiu ki n sinh t ng h p c a Bacillus subtilis nh m thu ñưc proteaza có ho t l c cao nh t, ñ ng th i ñem ng d ng vào trong thu phân protein trong v tôm sao cho hi u su t thu phân là cao nh t. ============================================================== 8 Lu n v ăn t t nghi p Ph m Th Trang K49 ================================================================= I. TNG QUAN I.1 HI N TR NG KHAI THÁC VÀ CH BI N TH Y S N I.1.1 Thành ph n ph ph m tôm Tôm là ñi t ưng quan tr ng c a ngành nuôi tr ng và ch bi n th y s n Vi t Nam. Th t tôm có giá tr dinh d ưng cao và có mùi v th ơm ngon ñc tr ưng, r t h p dn. Hi n nay, s n ph m tôm ñông l nh xu t kh u ñã góp 70-80% t ng kim ng ch xu t kh u c a toàn ngành (theo th ng kê kim ng ch xu t kh u thu s n c a Vi t Nam trong vòng 6 tháng ñu n ăm 2008). Hi n nay n ưc ta, k thu t khai thác và nuôi tôm r t phát tri n và ngày càng cung c p nhi u nguyên li u cho các nhà máy ch bi n th y s n trong n ưc và xu t kh u nhi u m t hàng nh ư: Tôm t ươ i nguyên con c p ñông IQF ho c Block Tôm v b ñ u c p ñông IQF hay Block Tôm là surimi Tôm b v ñóng h p Tôm b v , còn ñt ñuôi c p ñông IQF Tôm b v , b ch l ưng h p c p ñông ðiu này ch ng t tôm là m t m t hàng ñem l i ngu n l i kinh t l n cho ñ t nưc nh ưng ñng th i c ũng th i ra m t l ưng ñáng k ph li u, ch y u là v và ñu tôm. Ngoài ra, có m t l ưng ñáng k th t v do bóc nõn không c n th n ho c m t s tôm b th i lo i do bi n màu, ch t l ưng không ñ m b o. Tùy theo gi ng, loài và ph ươ ng pháp gia công ch bi n mà l ưng ph li u này có th thay ñ i t 40% ( ñ i v i tôm sú) ñ n 60% ( ñ i v i tôm càng xanh) l ưng nguyên li u thu mua. ð i v i s n ph m tôm bóc nõn và rút ru t thì m t mát theo v tôm và ñuôi kho ng 25%. Nhìn chung, trong ph li u tôm thì tr ng l ưng ph n ñ u th ưng g p 3 – 4 l n so v i ph n v và ñuôi. ============================================================== 9 Lu n v ăn t t nghi p Ph m Th Trang K49 ================================================================= I.1.2 Ph th i trong công nghi p ch bi n Tôm là ngu n Thu s n d i dào và có giá tr kinh t cao nh ưng vi c khai thác, ñánh b t ph thu c r t l n vào ñiu ki n t nhiên và mang tính mùa v vì v y ngoài ñánh b t t nhiên ng ưi ta còn ñy m nh theo h ưng nuôi tr ng ñm b o cung c p nguyên li u m t cách th ưng xuyên cho các nhà máy ch bi n Th y s n xu t kh u. Giáp xác là ngu n nguyên li u Th y s n d i dào chi m t 30-35% t ng sn l ưng nguyên li u Vi t Nam. Trong công nghi p ch bi n Thu s n xu t kh u, t l c ơ c u các m t hàng ñông l nh giáp xác chi m t 70-80% công su t ch bi n. Hàng n ăm các nhà máy ch bi n ñã th i b m t l ưng ph li u giáp xác khá l n kho ng 70.000 t n. Riêng t nh Khánh Hòa l ưng ph li u này vào kho ng 2257 t n/n ăm. Theo s li u th ng kê n ăm 1999 ph li u giáp xác trên toàn th gi i kho ng 5,ll tri u t n/n ăm. ñ a b n t nh Khánh Hòa trong nh ng n ăm g n ñây m t hàng tôm ñông lnh ñưc ñ y m nh nh t là các xí nghi p ch bi n Th y s n nh ư: Xí nghi p ðông l nh Nam Trung B , Xí nghi p ðông l nh Vi t Long, Xí nghi p ðông lnh Vi t Th ng, Xí nghi p ðông l nh Nha Trang (hay công ty F17),… Vi c tiêu th m t s l ưng l n tôm nguyên li u c a các nhà máy ch bi n th y s n ñã th i ra m t l ưng l n ph li u trong ñó ph li u v , ñ u tôm là ch yu. Các lo i ph li u này n u th i tr c ti p ra môi tr ưng s gây ô nhi m môi tr ưng tr m tr ng và n u ñem x lý ch t th i thì chi phí s r t l n. Ngày nay ñã có r t nhi u h ưng nghiên c u s d ng ph li u tôm ñ s n xu t các ch ph m có giá tr trong ñó quan tr ng nh t là vi c s n xu t chitin- chitosan t v giáp xác. I.1.3 Cu t o và thành ph n hoá h c c a ph li u tôm I.1.3.1 Cu t o hóa h c c a ph li u v tôm V chia làm 4 l p chính: Lp bi u bì (epicuticle); Lp màu; ============================================================== 10 Lu n v ăn t t nghi p Ph m Th Trang K49 ================================================================= Lp Canxi hoá; Lp không b Canxi hóa. Lp bi u bì, l p màu, l p Canxi hóa c ng do s l ng ñ ng c a Canxi. Lp màu, l p Canxi hóa, l p không b Canxi hóa ch a chitin nh ưng l p bi u b