Báo cáo Thí nghiệm vi sinh môi trường

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ KĨ THUẬT MÔI TRƯỜNG ----- Báo cáo: THÍ NGHIỆM VI SINH MÔI TRƯỜNG SVTH: Ngô Thái Bảo : 3009110516 Trần Thị Hồng Cẩm:3009110470 Trần Thiên Ân:3009110373 Nguyễn Dũ:3009110440 TP.HCM,tháng 6 năm 2013 MỤC LỤC PHẦN 1: DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ ............................................................................................................ 1 1. Dụng cụ, thiết bị sử dụng trong môn học: ......................................................................................... 1 1.1. Dụng cụ ......................................................................................................................................... 1 1.2. Thiết bị ...................................................................................................................................... 5 PHẦN 2: MỘT SỐ KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG PHÂN TÍCH VI SINH ............................................ 10 2.2.1. Kỹ thuật tiêu bản tạm thời ............................................................................................................. 10 2.2.2. Kỹ thuật pha môi trường ............................................................................................................... 11 2.2.3. Kỹ thuật làm ống thạch nghiêng : ................................................................................................. 12 2.2.4. Kỹ thuật cấy chuyền vi sinh vật. ................................................................................................... 13 2.2.5. Kỹ thuật phân lập vi sinh vật. ....................................................................................................... 15 2.2.6 Kỹ thuật pha loãng mẫu. ......................................................................................................... 18 2.2.7 Phương pháp hộp đổ ............................................................................................................... 19 2.2.8 Phương pháp hộp trải .............................................................................................................. 20 2.2.9 Phương pháp nhuộm đơn ........................................................................................................ 22 2.2.10 Phương pháp nhuộm kép (nhuộm gram) ............................................................................... 23 2.2.11 Kỹ thuật sử dụng kính hiển vi ................................................................................................ 26 PHẦN 3: KẾT QUẢ PHÂN TÍCH VI SINH MÔI TRƯỜNG ................................................................... 28 3.1. Vi sinh vật phân giải cellulose ......................................................................................................... 28 3.1.1. Nguyên tắc ................................................................................................................................ 28 3.1.2. Kết quả ...................................................................................................................................... 28 3.1.3. Nhận xét: ................................................................................................................................... 31 3.2. Vi sinh vật phân giải phosphor ........................................................................................................ 31 3.2.1. Nguyên tắc ................................................................................................................................ 31 3.2.2. Kết quả ...................................................................................................................................... 31 3.2.3. Nhận xét: ................................................................................................................................... 32 3.3. Vi khuẩn Nitrat hoá, nitrit hoá và vi khuẩn phản nitrat hoá ............................................................ 32 3.3.1. Nguyên tắc ................................................................................................................................ 32 3.3.2. Kết quả ...................................................................................................................................... 33 3.3.3. Nhận xét: ................................................................................................................................... 35 3.4. E.coli,Coliform ................................................................................................................................ 36 3.4.1. Nguyên tắc ................................................................................................................................ 36 3.4.2. Kết quả ...................................................................................................................................... 36 3.5. Vi sinh vật trong xử lý nước thải: .................................................................................................... 38 3.5.1. Nguyên tắc .................................................................................................................................... 38 3.5.2. Kết quả .......................................................................................................................................... 40 3.5.3. Nhận xét .................................................................................................................................... 41 PHẦN 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................................... 42 4.1. Kết luận ............................................................................................................................................ 42 4.2. Kiến nghị .......................................................................................................................................... 42 4.3. Bài học kinh nghiệm ........................................................................................................................ 43 Nhóm 1 PHẦN 1: DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ 1. Dụng cụ, thiết bị sử dụng trong môn học: 1.1. Dụng cụ Dụng cụ Hình ảnh Công dụng Đĩa petri Chứa môi trường nuôi cấy VSV. Ống nghiệm Dùng để chứa đựng dung dịch với thể tích nhỏ, nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường lỏng hay môi trường thạch. Chứa môi trường nuôi cấy hay dung môi hóa Bình tam giác. chất trong pha chế môi trường. Phiến kính và lá Phiến kính:chứa giọt kính. VSV ở trạng thái sống hoặc nhuộm màu khi quan sát bằng kính hiển vi. Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 1 Nhóm 1 Lá kính : dung để đậy lên giọt VSV trên phiến kính để quan sát trạng thái sống của tế bào VSV. Dùng để chứa cồn, hóa chất… Cốc thủy tinh Trải giọt sinh khối VSV lên bề mặt thạch. Que trang Que cấy vòng Ria trên bề mặt thạch hay phân lập VSV trên bề mặt thạch hoăc cấy chuyền trên môi trường lỏng Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 2 Nhóm 1 Đèn cồn Tạo không gian vô trùng, khử trùng các loại que cấy. Định lượng một thể tích chính xác VSV, Micropipette môi trường nuôi cấy hay dung dịch hóa chất. Kính lúp Quan sát các vật có kích thước nhỏ. Phễu thủy tinh. Chuyển dung môi từ dụng cụ chứa này sang dụng cụ chứa kia dùng khi miệng dụng cụ chứa nhỏ. Sử dụng để định mức lượng hóa chất cần Ống đong. dùng với độ chính xác cao. Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 3 Nhóm 1 Nghiền nhỏ mẫu đất. Cối. Bình tam giác có nút Dùng để chứa cồn mài. hoặc các loại hóa chất dễ bay hơi trong không khí. Chậu thủy tinh Chứa rác như giấy báo,gang tay, khẩu trang … đã sử dụng. Để ống nghiệm tránh Giá để ống nghiệm vỡ, lăn ra ngoài… Kẹp sắt Dùng để giữ vật mà yêu cầu không sử dụng tay để giữ, vd : giữ phiến kính hơ trên ngọn lửa cồn, tn phân giải xenlulozo… Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 4 Nhóm 1 Dùng để để pipet, đũa Giá để pipet thủy tinh. Bình tia Chứa nước cất. Bóp cao su Sử dụng hơi để hút hóa chất thông qua pipet. 1.2. Thiết bị Thiết bị Cách vận hành Hình ảnh • Mở nắp nồi hấp, lấy hai giỏ inox ra ngoài. Nồi hấp • Cho nước cất vào nồi khử trùng hấp đến khi ngập con ốc cảm ứng khoảng 1-2 cm tiếp tục cho giỏ inox lớn vào nồi hấp. • Cho dụng cụ và môi trường cần hấp khử trùng vào giỏ nhỏ rồi đưa vào nồi hấp. • Đóng nắp và khóa van. Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 5 Nhóm 1 • Bật công tắt ở bên hông, cài đặt thông số nhiệt độ,áp suất, thời gian, bấm lần lượt các nút “set” và “start”. • Khi đã có tín hiệu thì mở nồi hấp ra, chờ 1 phút cho bớt nóng và lấy dụng cụ môi trường ra (nếu muốn hạ áp suất của nồi hấp thì mở nắp nồi hấp ) . Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 6 Nhóm 1 • Mở cửa tủ sấy cho vật liệu sấy vào và đóng lại ( đẩy Tủ sấy thanh tay cầm sang trái để mở, sang trái để đóng). • Cắm nguồn điện chờ 10s rồi mới bật on/off để mở máy. • Nhấn phím “▲▼” để chọn chương trình P3, chờ 5s để xác nhận chương trình đã chọn . • Nhấn phím X/W để cài nhiệt độ sấy( dùng phím “▲▼” để cài nhiệt độ ). • Nhấn phím X/W để cài thời gian sấy ( dùng phím “▲▼” để cài thời gian), nếu chạy liên tục thì để thời gian cài đặt bằng 0. • Chờ 5s máy tự động lưu thong số vừa cài ở bước 4 và 5. • Khi đạt nhiệt độ sấy màn hình nhấp nháy liên tục hai thông số đã cài đặt, khi thời gian cài đựt về 0 thì kết thúc quá trình sấy, tắt tủ sấy lấy vật liệu sấy ra. • Vệ sinh tủ sấy Cân điện tử Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 7 Nhóm 1 - Cắm điện. - Đặt ống nghiệm lên phần Máy lắc núm đen . ống nghiệm + Bật công tắc lên nếu muốn sử dụng chế độ lắc gián đoạn(Manual). Nhấn nhẹ và giữ chặt ống nghiệm trong vài giây rồi nhấc ống nghiệm ra. + Bật công tắc xuống nếu muốn sử dụng chế độ lắc liên tục(Continuous) Lò vi ba Bếp điện Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 8 Nhóm 1 Máy dập mẫu • Đặt tiêu bản lên bàn mẫu, dùng Kính hiển kẹp để cố định tiêu vi quang bản. học • Chọn vật kính: tùy theo mẫu tiêu bản và mục đích quan sát mà ta chọn vật kính thích hợp. • Nhỏ 1 giọt dầu soi lên phiến kính khi soi vật kính x100. • Điều chỉnh ánh sáng • Điều chỉnh tụ quang • Điều chỉnh cỡ màn chắn tương ứng với vật kính. • Mắt nhìn thị kính, tay vặn ốc chỉnh thô đến khi thấy hình ảnh mờ, tiếp tục điều chỉnh ốc chỉnh tinh đến khi nhìn rõ vật Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 9 Nhóm 1 PHẦN 2: MỘT SỐ KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG PHÂN TÍCH VI SINH 2.2.1. Kỹ thuật tiêu bản tạm thời Nội dung công Hình ảnh minh họa Ghi chú việc Bước 1: Rửa sạch lam và lamen o Cho lam và lamen vào chậu Sử dụng gang tay, khẩu thủy tinh trang trong quá trình o Đổ dd HCl thao tác. 10% vào và ngâm trong ... phút o Rửa lại bằng nước Bước 2: cho một giọt sinh khối VSV lên phiến Nếu là nấm mốc thì ta kính. phải cố định bằng một giọt nước. Bước 3: Đặt lá kính lên phiến kính. Có thể đặt lá kính lên o Đặt lá kính phiến kính bằng cách: song song với đậy lá kính sao cho chân phiến kính cách của lá kính chạm vào phiến kính giọt nước hay giọt màu, khoảng 2 cm nghiêng một góc 450 o Đặt lá kính và hạ lá kính xuống để từ từ xuống có bọt khí phiến kính, dung khăn giấy khô thấm nước tràn ra bên ngoài. Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 10 Nhóm 1 Bước 4: Đặt tiêu bản lên bàn mẫu, điều chỉnh kính hiển vi để quan sát. 2.2.2. Kỹ thuật pha môi trường Nội dung công việc Hình ảnh minh họa Ghi chú Bước 1: Cân từng thành  Cân chính xác phần của môi trường lượng hóa chất  Tắt hết thiết bị quạt Bước 2: hòa tan từng  Đối với môi trường thành phần của môi đặt như agar phải trường trong một lượng nấu tan chảy xong nước nhỏ. Sau đó trộn lẫn mới hòa tan các tất cả các thành phần dinh thành phần khác dưỡng với nhau và thêm nước cho đủ thể tích Bước 3: Phân phối môi trường vào các dụng cụ chứa, đóng nút bông, bao gói giấy báo Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 11 Nhóm 1 Bước 4: Hấp tiệt trùng  Hấp tiệt trùng ở trong nồi hấp và làm 1210C, trong 15 nguội tới nhiệt độ thích phút hợp và gieo cấy vsv 2.2.3. Kỹ thuật làm ống thạch nghiêng : Nội dung công việc Hình ảnh minh họ a Ghi chú Bước 1: Rửa sạch dụng Bao gói dụng cụ trước cụ và hấp khử trùng khi hấp Bước 2:Cho vào mỗi o Sử dụng gang ống nghiệm 7-8 ml tay ,khẩu trang trong môi trường quá trình thao tác. o Khử trùng tay và khu vực làm thí nghiệm bằng cồn trước khi tiến hành. o Thao tác nhanh, môi trường rất dễ đông . Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 12 Nhóm 1 Bước 3: Làm nút bông và bịt nắp ống nghiệm Bước 4: Chú ý phần thạch Để các ống nghiệm cách miệng ống nghiêng <250, phần nghiệm 2 cm. thạch nghiêng khoảng Không di chuyển 1/2-1/3 ống nghiệm. ống nghiệm khi môi Chờ môi trường trường chưa đông đặc. đông lại, bảo quản ở nhiệt độ thích hợp. 2.2.4. Kỹ thuật cấy chuyền vi sinh vật. Nội dung công việc Hình ảnh minh họa Ghi chú Bước 1: Chuẩn bị 1 Chuẩn bị mẫu VSV ống nghiệm thạch phải đúng và phát nghiêng có môi trường triển tốt. phù hợp và 1 ống mẫu chứa VSV. o Sử dụng khẩu trang trong suốt quá trình cấy. o Khử trùng sạch tay và bàn làm việc. Bước 3: Đốt que cấy trên o Tay trái cầm 2 ngọn lửa đèn cồn đến ống nghiệm (ống chứa khi đỏ Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 13 Nhóm 1 mẫu và ống cấy) Không để ống o Tay phải cầm nghiệm ở quá xa đèn que cấy,ngón út và cồn lòng bàn tay của tay phải cầm và giữ nút bông Bước 4: Để vào thành ống o Đưa que cấy đã nghiệm cho bớt nóng khử trùng vào bên Không để đầu que trong ống nghiệm cấy chạm vào miệng chứa vsv và thành ống nghiệm o Lấy một ít sinh khối vsv và đậy nút bông lại Bước 5: Tránh để vỡ thạch. o Mở nút bông ở Không ria nhiều ống thạch cần cấy, khử lần. trùng miệng ống nghiệm o Rồi đưa que cấy vào đáy ống nghiệm ria theo đường dzích dzăc từ dưới kéo về hướng miệng ống nghiệm Bước 6: o Rút que cấy ra, hơ miệng ống nghiệm o Đóng nút bông lại o Khử trùng que cấy và để Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 14 Nhóm 1 vào giá Bước 7 : Dán nhãn, bao gói, bảo quản. 2.2.5. Kỹ thuật phân lập vi sinh vật. 2.2.5.1. Kỹ thuật hộp ria. Nội dung công việc Hình ảnh minh họa Ghi chú Bước 1: Chuẩn bị Petri không bị nhiễm o Petri chứa sv khác môi trường thạch o Ống nghiệm chứa vsv cần cấy,nút bông bằng gạc o Dụng cụ cần thiết (que cấy, cồn, đèn cồn, bông,…) Bước 2: Dùng bông gòn thấm nước thấm cồn sát trùng tay và mặt bàn chuẩn bị cấy. Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 15 Nhóm 1 Bước 3: Dùng máy lắc, Giữ chặt ống nghiệm lắc đều ống nghiệm tránh làm rơi ra ngoài. chứa VSV Bước 4: Đặt petri và ống o Để petri nghiệm gần ngọn lửa gần đèn cồn đèn cồn trong phạm vi o Tay trái < 15cm cầm ống nghiệm chứa VSV vừa lắc xong, tay phải cầm que cấy, dùng ngón tay út mở nút bông, khử trùng miệng ống nghiệm bằng cách hơ qua ngọn lửa đèn cồn Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 16 Nhóm 1 Bước 5: o Để que o Khử trùng cấy vào miệng que cấy trên ống nghiệm cho ngọn lửa đèn cồn bớt nóng. cho đến khi nóng o Chú ý đỏ. thao tác cẩn o Đưa que thận để không cấy vào giữa ống làm vỡ thạch. nghiệm chứa VSV lấy một ít sinh khối VSV. o Khử trùng miệng ống nghiệm, tiệt trùng nút bông và đóng bông ống nghiệm và để que cấy trong không gian vô trùng. o Tay trái mở nắp petri, tay phải cầm que cấy ria trên bề mặt thạch, đậy nắp petri lại Bước 6: Bao gói cẩn thận bảo o Khử trùng que quản để không bị cấy khi cấy ria xong và nhiễm sv khác để vào giá đựng o Ghi tên sinh viên, môi trường, tên VSV lên đĩa petri và bao gói lại bảo quản. Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 17 Nhóm 1 2.2.6 Kỹ thuật pha loãng mẫu.  Với mẫu nước Nội dung công việc Hình ảnh minh họa Ghi chú Bước 1: Hút 10ml mẫu Lắc đều mẫu cho vào bình tam giác đã trong bình tam có 90ml nước cất giác ít nhất 2 phút ta có được mẫu có độ pha loãng 10-1 Bước 2: Dùng pipette vô Lắc đều ta được trùng hút 1ml mẫu cho mẫu có độ pha -2 vào ống nghiệm chứa 9ml loãng 10 nước cất. Làm tương tự như trên đến khi đạt nồng độ yêu cầu.  Với mẫu đất Nội dung công việc Hình ảnh minh họa Ghi chú Bước 1: Chuẩn bị mẫu đất, Lắc đều mẫu,ta dùng cối giã đất nhuyễn được nồng độ ra, cân 10g cho vào bình 10-1. tam giác có chứa 90ml nước cất. Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 18 Nhóm 1 Bước 2: Lắc đều bình tam Lắc đều dung dịch giác chứa mẫu, dùng ta được mẫu có pipette hút 1ml cho vào nồng độ pha loãng ống nghiệm chứa 9ml 10-2. nước cất. Tiếp tục thực hiên như các bước trên ta sẽ được nồng độ theo yêu cầu. 2.2.7 Phương pháp hộp đổ Nội dung công việc Hình ảnh minh họa Ghi chú Bước 1: Chuẩn bị o Pha chế môi trường cần sử dụng để cấy o Petri, pipette,bao gói giấy báo và đem hấp khử trùng Bước 2: o Mẫu chứa o Khử trùng tay và nơi vsv phải dược lắc làm việc bằng đèn cồn đều trước khi hút o Dùng pipette đã hấp o Sử dụng khử trùng hút 1ml dịch vsv găng tay và khẩu cho vào đĩa petri vô trùng trang trong suốt chưa có môi trường quá trình thao tác thí nghiệm Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 19 Nhóm 1 Bước 3: Xoay đều đĩa Đỗ khoảng 15 – 0ml môi petri để vsv dàn trường nóng chảy ở 450C đều và mặt thạch vào đĩa petri đã cấy giống bằng phẳng. vsv, đậy nắp đĩa petri Các thao tác Đặt đĩa petri lên mặt phải được thực phẳng ngang, xoay nhẹ đĩa hiện trong không petri theo 2 chiều ngược gian vô trùng (gần nhau mỗi chiều từ 3 – 5 lần ngọn lửa đèn để dịch vsv dàn đều ở mặt cồn). đáy của đĩa petri và trộn đều trong môi trường cấy Bước 4: Để đông tự nhiên gần ngọn lửa đèn cồn Dán tên sinh viên ,môi trường, VSV,…lên đĩa petri Đợi môi trường đông, lật ngược đĩa petri lại, bao gói và đem bảo quản ở nhiệt độ thích hợp 2.2.8 Phương pháp hộp trải Nội dung công việc Hình ảnh minh họa Ghi chú Bước 1: Sử dụng găng tay o Sử dụng các đĩa petri và khẩu trang chứa môi trường đã chuẩn trong suốt quá bị trước trình tiến hành o Chuẩn bị dụng cụ và nút bông o Hấp khử trùng dụng cụ Khử trùng tay và bàn làm việc bằng cồn Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 20 Nhóm 1 Bước 2: Dùng pipette vô Hút trong không trùng hút 0,1ml dịch vsv gian vô trùng gần lên bề mặt môi trường ngọn lửa đèn cồn thạch đĩa trong không gian vô trùng Bước 3: Thao tác cấy được o Nhúng đầu thực hiện trong que trang vào cốc không gian vô thủy tinh chứa cồn trùng 700, đốt trên ngọn lửa đèn cồn để khử trùng. o Mở đĩa petri, dùng que trang gạt và xoay đều giọt vsv trên bề mặt thạch Trong khi gạt,xoay đĩa petri tới lui 3 – 4 lần, mỗi lần ½ chu vi cho dịch vsv trải đều khắp trên bề mặt môi trường Bước 4: Bao gói kỹ và bảo o Rút que trang quản đúng thời kh