Báo cáo Thực hành môn công nghệ protein - Enzyme

Sắc ký là một họ các kỹ thuật hóa học phân tích dùng để tách các chất trong một hỗn hợp và được tiến hành lần đầu bởi nhà thực vật học người Nga MikhailTsvet (Mikhail Semyonovich Tsvet) vào năm 1903 khi ông đang nghiên cứu về chlorophyll. - Sắc ký trao đổi ion là một phương pháp sắc ký lỏng rắn mà pha tĩnh là hợp chất có khả năng trao đổi ion (gọi là các ionit). - Sắc ký trao đổi ion được phân loại dựa trên cơ chế của quá trình tách: do ái lực khác nhau của các ion trong dung dịch (pha động) với các trung tâm trao đổi ion (nhóm chứa ion) trên chất rắn (pha tĩnh). - Đây là phương pháp được sử dụng nhiều trong các phòng thí nghiệm Hóa sinh.Theo những thống kê mới nhất, IEC là kỹ thuật tách protein được sử dụng nhiều nhất trong các quy trình tinh chế (có thể bao gồm nhiều bước và nhiều kỹ thuật khác nhau): IEC: 75%; sắc ký ái lực (AC): 60%; sắc ký lọc gel (GF): 50% các trường hợp. - Trước tiên, chất cần phân tích sẽ gắn thuận nghịch với các chất trao đổi bằng tương tác ion giữa các nhóm mang điện tích trái dấu. - Sau đó, các ion đã trao đổi được chiết rút riêng biệt bằng phương pháp rửa giải hoặc rửa đẩy. Có thể tách chiết bằng cách thay đổi pH (ít dùng hơn) khiến các nhóm tương tác trên chất phân tích bị mất điện tích.

pdf25 trang | Chia sẻ: lvbuiluyen | Lượt xem: 7156 | Lượt tải: 2download
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Báo cáo Thực hành môn công nghệ protein - Enzyme, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
1 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC ------  ------ BÁO CÁO THỰC HÀNH MÔN CÔNG NGHỆ PROTEIN - ENZYME Sinh viên thực hiện : Đinh Hoàng Yến Lớp : K55 - CNSHB Mã sinh viên : 550513 Giáo viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Thành Trung Hà Nội, 2012 2 Bài g à r o i ion I – Mụ í h, yêu ầu - Sinh viên giải thích được nguyên lý của phương pháp sắc ký lọc gel và sắc ký trao đổi ion. - Biết cách chuẩn bị gel, làm sắc ký. - Biết cách xây dựng đồ thị nồng độ thành phần protein trong mẫu. – h ng h 1. r o i ion (Ion –Exchange Chromatography): chung: - Sắc ký là một họ các kỹ thuật hóa học phân tích dùng để tách các chất trong một hỗn hợp và được tiến hành lần đầu bởi nhà thực vật học người Nga MikhailTsvet (Mikhail Semyonovich Tsvet) vào năm 1903 khi ông đang nghiên cứu về chlorophyll. - Sắc ký trao đổi ion là một phương pháp sắc ký lỏng rắn mà pha tĩnh là hợp chất có khả năng trao đổi ion (gọi là các ionit). - Sắc ký trao đổi ion được phân loại dựa trên cơ chế của quá trình tách: do ái lực khác nhau của các ion trong dung dịch (pha động) với các trung tâm trao đổi ion (nhóm chứa ion) trên chất rắn (pha tĩnh). - Đây là phương pháp được sử dụng nhiều trong các phòng thí nghiệm Hóa sinh.Theo những thống kê mới nhất, IEC là kỹ thuật tách protein được sử dụng nhiều nhất trong các quy trình tinh chế (có thể bao gồm nhiều bước và nhiều kỹ thuật khác nhau): IEC: 75%; sắc ký ái lực (AC): 60%; sắc ký lọc gel (GF): 50% các trường hợp. - Trước tiên, chất cần phân tích sẽ gắn thuận nghịch với các chất trao đổi bằng tương tác ion giữa các nhóm mang điện tích trái dấu. - Sau đó, các ion đã trao đổi được chiết rút riêng biệt bằng phương pháp rửa giải hoặc rửa đẩy. Có thể tách chiết bằng cách thay đổi pH (ít dùng hơn) khiến các nhóm tương tác trên chất phân tích bị mất điện tích. b) : - Cơ sở của IEC là sự cạnh tranh các nhóm tích điện trái dấu trên chất trao đổi giữa các ion của chất cần tách với các ion khác. - Khi nồng độ ion cạnh tranh thấp, các ion cần tách sẽ liên kết với chất trao đổi. Khi nồng độ ion cạnh tranh cao, các ion cần tách sẽ rời ra. - Nguyên tắc tách trực tiếp (căn cứ trên khác biệt điện tích). - Tại bất kỳ một điểm pH nào trừ điểm đẳng điện, các protein đều có mang một điện tích tương ứng với điểm pH đó. Dựa vào điện tích thực của chúng tại một điểm pH nhất định, ta có thể phân tách hỗn hợp protein. Trong phương pháp này, pha tĩnh là những hạt mang sẵn một điện tích nhất 3 định, những hạt này sẽ tương tác với các phân tử (protein) mang điện tích trái dấu với chúng. Cụ thể, nếu hạt mang điện âm (như cột carboxymethyl- cellulose (CM-cellulose)), tiến trình được gọi là sắc ký trao đổi ion dương, thì sẽ tương tác với những phân tử mang điện tích dương. Ngược lại, nếu hạt mang điện tích dương (như cột diethylaminoethyl-cellulose (DEAE- cellulose)), gọi là sắc ký trao đổi ion âm, thì tương tác với phân tử mang điện tích âm. Vì thế, những protein cùng dấu với cột sẽ chạy ra khỏi cột trong khi những protein trái dấu bị giữ lại cột. Để phóng thích những protein này, ta tăng nồng độ ion của pha động, những ion này sẽ thế phân tử protein tương tác với các hạt mang điện tích. Ví dụ, trong sắc ký trao đổi ion dương, ta thêm muối natri clorua hay muối khác trong dung dịch tách giải bởi vì ion natri sẽ tranh bám vào cột với các protein có điện tích dương, do đó, những protein mang điện tích dương được phóng thích ra ngoài cột lần lượt theo độ lớn về điện tích. c) - Có độ phân giải cao. - Đa dạng. - Dễ dàng tiến hành. 2. g (Gel-Filtration Chromatography): Phương pháp này tốt hơn các phương pháp trên vì nó dựa vào kích thước phân tử. Mẫu sẽ được nạp vào đầu một cột chứa nhiều hạt có lỗ làm từ polymer không tan nhưng có tính hydrate hóa cao như dextran, agarose (những dạng cabohydrate) hay polyacrylamide. Sephadex, Sepharose, và Bio- gel là những loại gel phổ biến trên thị trường có sẵn những hạt có lỗ với đường kính chuẩn là 100µm (0,1mm). Những phân tử nhỏ có thể ở cả bên trong lẫn giữa các hạt, trong khi đó những phân tử lớn hơn chỉ có thể ở bên ngoài các hạt. Vì vậy, những phân tử có kích thước lớn trong cột sẽ chảy nhanh hơn và ra ngoài trước . Phân tử có kích thước trung bình, có thể thỉnh thoảng vào được bên trong hạt sẽ rời khỏi cột ở vị trí giữa; còn những phân tử nhỏ sẽ phải đi qua đoạn đường dài hơn, quanh co nên sẽ ra sau cùng. 3. i Đây là một phương pháp rất hiệu quả và được ứng dụng rộng rãi trong việc tinh sạch protein. Kỹ thuật này dựa trên ái lực cao của nhiều protein với những nhóm hóa học chuyên biệt. Ví dụ, concanavalin A, một loại protein thực vật, có thể được tinh sạch khi cho qua cột mang những phân tử glucose bằng liên kết cộng hóa trị. Concanavalin A gắn vào cột bởi vì nó có ái lực cao với glucose, trong khi đó những protein khác thì không. Concanavalin A có thể được tách giải khỏi cột khi ta cho thêm dung dịch glucose đậm đặc vào. Phân tử đường trong dung dịch sẽ gắn với Concanavalin A thay thế những phân tử glucose nối với cột. 4 Sắc ký ái lực còn là một công cụ hữu hiệu trong việc tách các yếu tố phiên mã, những protein điều hòa sự biểu hiện gen thông qua việc gắn đặc hiệu với trình tự DNA. Hỗn hợp protein thấm qua cột có chứa những trình tự DNA đặc hiệu được gắn vào thể mang; những protein có ái lực cao với trình tự DNA sẽ bắt vào các trình tự và được giữ lại. Trong thí dụ này, yếu tố phiên mã sẽ được phóng thích khi rửa cột với dung dịch có hàm lượng muối cao. Ngoài ra, hiện nay người ta dựa vào tính đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể để tinh sạch kháng nguyên hay kháng thể. Nhìn chung, sắc ký ái lực có thể được dùng để tách một protein vốn có khả năng nhận biết một nhóm X bằng nối cộng hóa với nhóm này hay những chất dẫn xuất của nó được gắn trên một cái cột, sau đó nạp hỗn hợp protein vào cột, cột này sẽ được rửa lại để loại bỏ những protein không tạo được nối, cuối cùng là tách giải protein mục tiêu bằng dung dịch X với nồng độ cao hay thay đổi điều kiện để làm giảm lực liên kết. Sắc ký ái lực là phương pháp tinh sạch hiệu quả nhất khi tương tác giữa protein và phân tử được dùng như mồi bắt protein có độ chuyên biệt cao. 4. ỏng o : Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp là một dạng mở rộng của kỹ thuật sắc ký cột có khả năng phân tách protein được cải thiện đáng kể. Bản thân vật liệu tạo cột vốn đã có sự phân chia rõ ràng và như thế sẽ có nhiều vị trí tương tác dẫn đến khả năng phân tách được tăng lên đáng kể. Bởi vì cột được làm từ vật liệu mịn hơn nên phải có một áp lực tác động lên cột để có được một tốc độ chảy thích hợp. Kết quả thực có sự phân giải cao và phân tách nhanh. C h ng h h Sắc ký k nước, sắc ký đảo pha, sắc ký đẳng điện, sắc ký khí, sắc ký lớp mỏng, sắc ký màng, sắc ký nền mở rộng III – h ng h g à r o i ion: Sự tinh sạch của protein rất quan trọng và được thực hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau. Trong đó, sắc kí là một phương pháp phân tách quan trọng trong sinh học phân tử vì nó thích hợp với nhiều loại hợp chất và sản phẩm tinh sạch có thể được sử dụng ngay cho việc định lượng và định danh. Có nhiều phương pháp sắc kí như sắc kí lọc gel, sắc kí trao đổi ion, sắc kí ái lực… g (Gel-Filtration Chromatography): Là một trong những kỹ thuật sắc ký cột được dùng phổ biến trong tách chiết và tinh sạch protein. Sắc kí lọc gel còn được gọi là phương pháp dùng chất rây phân tử, lọc gel. Cơ sở của phương pháp lọc gel là dựa trên sự khác nhau về kích thước, hình dạng và phân tử lượng của protein enzyme có trong hỗn hợp để tách chúng ra. Để đảm bảo cho việc tách protein enzyme được tốt, 5 chất rây phân tử phải là chất trơ, không phản ứng với protein enzyme, không hòa tan và tương đối bền với các yếu tố về cơ học cũng như sinh học. Ngoài ra chất được sử dụng cho mục đích lọc phân tử phải là chất không có tính đàn hồi (không co) và phải là chất ưa nước. Gel sephadex là chất thỏa mãn các yếu tố trên. Phương pháp lọc phân tử trên sephadex được tiến hành như sau: cho sephadex vào cột thủy tinh dài và cân bằng dung dịch đệm có pH nhất định. Sau đó cho dung dịch protein enzyme lên cột. Khi lọc và chiết bằng các dung môi thích hợp, các phân tử nhỏ (ở đây là các muối) sẽ khuếch tán chậm chạp qua các lỗ nhỏ của các hạt sephadex bị trương phồng, còn các chất có khối lượng phân tử lớn hơn (ở trường hợp này là các protein enzyme) không có khả năng đi vào mà lách nhanh qua các hạt shephadex và sẽ được chiết nhanh ra khỏi cột. Vì vậy, ta có thể tách được chất có khối lượng phân tử cao hơn thoát ra khỏi cột gel trước so với chất có khối lượng phân tử nhỏ. 2 h ng h í r o i ion (Ion –Exchange Chromatography): Dựa vào sự khác nhau về điện tích tổng số của các protein enzyme, hay phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng trao đổi ion giữa protein tan được trong nước hoặc dung dịch đệm loãng và các tác nhân trao đổi ion. Tác nhân trao đổi ion có thể là chất nhựa có tích nhóm sinh anion hoặc chất cation. Đây là những chất giá trơ, không tan tròn nước, có bản chất là cellulose hoặc chất gel dextran có lưới phân nhánh (Sephadex, Molselect) hoặc là chất nhựa polistirol. Chất giá thể này thường kết hợp với các nhóm ion hóa. Trong hỗn hợp chất ionit với dung dịch đệm có độ pH tương ứng, các chất ionit đã nói ở trên trở nên tích điện. Vì vậy trên bề mặt lớp chất giá sẽ hình thành một lớp điện tích có dấu phụ thuộc vào kiểu nhóm chức hóa học của nó. Nếu thêm protein enzyme vào dung dịch đệm thì các phân tử protein enzyme mang điện tích sẽ bị các nhóm tích điện trái dấu của chất trao đổi ion kéo lại. Khi dùng một dung dịch đệm để phản hấp phụ có pH khác hoặc khi thêm một loại ion khác có lực ion lớn hơn thì phân tử protein enzyme sẽ bị đẩy ra khỏi chất trao đổi ion. Khi tiến hành phản hấp phụ, thường người ta thêm vào các ion Na+ và Cl- trong NaCl có nồng độ tăng dần theo bậc thang hay theo gradient. Các phân tử protein enzyme nào có điện tích tổng số nhỏ thì sẽ bị đẩy ra trước do lực liên kết với chất trao đổi ion yếu. Còn những protein enzyme nào có liên kết với ionit lớn hơn thì sẽ bị đẩy ra bằng một lực ion của muối lớn hơn. Như vậy, bằng cách này, chúng ta có thể tách được từng phần các loại protein enzyme. Việc tách từng phần có lựa chọn tốt nhất là khi tăng dần nồng độ các ion thay thế. Nhờ nồng độ ion của muối tăng dần (gradient) người ta có thể rút ra từ cột các loại protein enzyme khác nhau. Có thể thu nhận dịch chiết enzyme protein sau khi qua cột bằng máy thu phân đoạn tự động. Theo thứ tự từng phần dịch thu được, người ta tiến hành định 6 lượng protein theo các phương pháp Lowry hay phương pháp đo quang phổ và xác định đoạt hoạt độ của enzyme. IV – Tiến hành hí nghiệm C dung dị h ệm: - Đệm phosphate 0.1M, pH 7.5. - Dung dịch NaCl 2M (dung dịch gốc) dùng để pha các nồng độ muối 0.1M, 0.25M, 0.5M, 1M (pha loãng trong đệm phosphate). 2. Chuẩn bị gel: - Cân 6g sephadex G75 ngâm trong 60 ml đệm phosphate. (dùng cho sắc kí lọc gel). - Cân 8g DEAE sephadex A 25 ngâm trong 500ml đệm phosphate ( lượng đệm sử dụng để ngâm gấp 10 lần thể tích sẽ nở được) (dùng cho sắc kí trao đổi ion). - Làm nở gel trong nhiệt độ thường ủ 1- 2 ngày hoặc 2h ở 100ºC hoặc hấp 121ºC trong 30 phút. Bảo quản ở nhiệt độ từ 4- 25ºC. 3 Nhồi ộ g Rửa và tráng sạch cột rồi dựng cột thẳng đứng trên giá. Tráng qua cột bằng đệm rồi đóng khóa phía dưới cột. Khuấy nhẹ hòa đều gel đổ từ từ vào cột (cần chú ý tránh tạo bọt trong gel và gel phân lớp không đồng nhất), để gel lắng một lúc. Mở khóa để đệm chảy ra và để gel lắng dưới tác dụng của áp suất trong cột. Tiếp tục đổ gel vào cột cho đến thể tích mong muốn. 4. C n ng g (equilibration): Sau khi nhồi xong cột gel phải được cân bằng lại, với gel sắc kí lọc gel cân bằng bằng đệm phosphate, với sắc kí trao đổi ion cân bằng bằng đệm phosphate có bổ sung NaCl. Cho đệm chảy từ từ vào cột, tháo van để dung dịch đệm cân bằng ra ngoài. 5. G n m u ên ộ (Binding): Sử dụng mẫu protein nấm mốc đã được tủa bằng ethanol. Cho lớp dịch đệm chảy đến sát mặt gel. Dùng pipet hút mẫu cần tách cho từ từ vào cột. 6. T h rử ộ ( u ion) Với sắc kí lọc gel: Cho đệm phosphate chảy qua từ từ và thu các phân đoạn protein (từ 1- 2 ml) cho đến khi đến khi OD280 của dịch rửa khoảng thấp và không thay đổi nhiều thì không phải tách rửa nữa. Với sắc kí trao đổi ion: Cho đệm phosphate có bổ sung muối NaCl với các gradient nồng độ 0,1M, 0,25M, 0,5M, 1M và 2M mỗi nồng độ NaCl cho chạy ½ hoặc 1 thể tích cột (khoảng 20ml) chảy qua từ từ tốc độ khoảng 25ml/h đến khi OD280 của dịch rửa khoảng thấp và không thay đổi nhiều thì không phải tách rửa nữa. Thu liên tục dịch chảy ra từng phân đoạn vào ống nghiệm nhỏ mỗi ống thu 1  2 ml. Tiến hành đo OD280 từ các ống thu được. 7 Từ kết quả thu được (OD280) của các phân đoạn, tiến hành vẽ đồ thị, xác định các phân đoạn có nồng độ protein cao có thể đem xác định một số hoạt tính sơ bộ hoặc hoạt độ. 7 T i inh g (r g n r ion) Với sắc kí lọc gel cho rửa bằng đệm phosphate. Với sắc kí trao đổi ion: Phụ thuộc vào bản chất của mẫu, tái sinh thường được rửa bằng đệm ion mạnh (ví dụ: NaCl 1M hoặc 2M) hoặc/ và giảm hoặc tăng pH, theo đệm sử dụng cân bằng trong gắn mẫu. Trong một số trường hợp cần phải rửa sạch cột có thể bằng ethylene glycol hoặc ethanol. 8 Bảo quản Khi không sử dụng thêm 0,05% NaN3 vào cột gel bảo quản ở 4- 8ºC. C yếu ảnh h ng ến ế quả - Độ dài cột sắc ký. - Tổng thể tích cột gel. - Tốc độ dòng chảy. - Bản chất hạt gel. - Nồng độ cột gel và sự phân bố của hạt gel trong cột. - Độ dài cột sắc ký. - Môi trường pH trong cột. - Sự phân bố điện tích bề mặt của protein. - Bản chất các ion trong dung dịch. - Các chất được thêm vào như: dung môi hữu cơ… - Đặc tính của chất trao đổi. IV – Kế quả hí nghiệm g Ống nhỏ OD280 (A) Ống nhỏ OD280 (A) Ống nhỏ OD280 (A) 1 0,066 16 0,038 31 0,334 2 0,076 17 0,034 32 0,322 3 0,108 18 0,062 33 0,294 4 0,048 19 0,056 34 0,286 5 0,026 20 0,076 35 0,252 6 0,026 21 0,122 36 0,238 7 0,020 22 0,134 37 0,218 8 0,024 23 0,190 38 0,238 9 0,018 24 0,220 39 0,244 10 0,020 25 0,256 40 0,264 11 0,194 26 0,278 41 0,158 8 12 0,040 27 0,308 42 0,162 13 0,046 28 0,326 43 0,166 14 0,028 29 0,338 15 0,076 30 0,326 Đồ thị nồng độ protein trong sắc ký lọc gel 0.000 0.050 0.100 0.150 0.200 0.250 0.300 0.350 0.400 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Ống nghiệm OD 2 80 (A ) OD280 (A) 2 r o i ion Ống nhỏ OD280 (A) Ống nhỏ OD280 (A) Ống nhỏ OD280 (A) 1 0,272 16 0,028 31 0,212 2 0,110 17 0,020 32 0,210 3 0,112 18 0,041 33 0,195 4 0,106 19 0,116 34 0,192 5 0,126 20 0,106 35 0,294 6 0,482 21 0,120 36 0,070 7 0,067 22 0,128 37 0,223 8 0,241 23 0,158 38 0,191 9 0,123 24 0,106 39 0,163 10 0,066 25 0,101 40 0,208 11 0,002 26 0,096 41 0,099 12 0,005 27 0,088 42 0,133 13 0,046 28 0,290 14 0,041 29 0,109 15 0,021 30 0,155 9 Đồ thị nồng độ protein trong sắc ký trao đổi ion 0.000 0.100 0.200 0.300 0.400 0.500 0.600 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Ống nghiệm O D 2 80 (A ) OD280 (A) V – Nhận xé , Trong g - Ta thấy có 4 đỉnh nhọn protein, nhưng chỉ có 2 đỉnh đầu là khả năng phân tách tốt. - Phần đáy không trùng với điểm không, chứng tỏ có những mẫu không đồng nhất một loại protein. - Ở các ống 29, 30, 31, giá trị đo ở ống 30 nhỏ hơn với 2 ống 29 và 31, có thể do lỗi ở máy đo. 2 Trong r o i ion - Ta thấy có 5 đỉnh protein, nhưng chỉ 2 đỉnh đầu là độ phân tách tốt. - Chỉ có ống nghiệm 11 và 12 thì giá trị OD280 gần với giá trị 0 nhất, ở đó nồng độ protein gần như bằng 0. - Từ ống nghiệm thứ 13 trở đi thì giá trị đo OD lên xuống không còn theo quy luật nữa. 3 Nguyên nh n - Trong quá trình thí nghiệm, cột sắc ký chuẩn bị không được tốt. - Protein vẫn còn lẫn tạp. - Dòng chảy protein ra ngoài không đều. - Khi để protein chảy nhanh ra ngoài thì dễ lẫn các protein với nhau. - Máy đo OD cũng có khả năng sai sót thông số. 10 - Nồng độ protein trong ống nghiệm phân bố không đều nên khi đo OD giá trị nhiều lúc thay đổi. 11 Bài X ịnh nồng ộ ro in ng h ng h h nh u (Biur , Lowry, Br dford) I – Mụ í h, yêu ầu - Sinh viên biết và giải thích được nguyên lý của các phương pháp xác định nồng độ protein khác nhau. - Xây dựng đồ thị đường chuẩn của các phương pháp khác nhau. - Biết cách xác định hàm lượng protein dựa vào đồ thị đường chuẩn. II – Định ợng nồng ộ ro in ng h ng h Biur : Phương pháp Biuret là phương pháp đơn giản nhất để định lượng protein. Phương pháp này nhạy cảm với thành phần amino acid của protein. Độ nhạy của nó là hằng số tương đối cố định từ protein này đến protein khác. Do tiến hành đơn giản và cho kết quả nhanh chóng, nó được sử dụng để định lượng protein chiết xuất thô với khoảng nồng độ lớn. Ngoài ra, phương pháp này còn có thể được sử dụng để xác định nồng độ protein trong quá trình tinh sạch. Nguyên lý của nó dựa trên liên kết giữa ion đồng (Cu2+) với peptide của protein trong môi trường kiềm để tạo thành màu tím hay xanh tím có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 540 nm. Cường độ màu của phản ứng tỷ lệ thuận với số lượng liên kết peptide (- CO – NH -) trong chuỗi polypeptide. Hó hấ : - Thuốc thử Biuret: 1.5 g cupric sulfate pentahydrate (CuSO4 5 H2O) và 6.0 g sodium potassium tartrate tetrahydrate (NaKC4H4O6 4 H2O). Hòa tan trong 500 ml nước cất. Thêm 300 ml NaOH 10%. Thêm 1g KI, lắc cho tan, thêm nước cất đến thể tích 1 lít. Bảo quản trong lọ tối. - Cân 100 mg BSA (albumin huyết thanh bò) hoà tan trong 10ml nước, ta được dung dịch gốc có nồng độ là 10 mg/ml. Bảo quản ở 4ºC. Chỉ dùng trong 2 tuần. 2. Lậ ồ thị ờng chuẩn: Lấy 6 ống nghiệm, đánh số từ 1 – 6, cho các chất tham gia phản ứng vào từng ống nghiệm như bảng sau: Bảng : Lập đồ thị đường chuẩn BSA STT BSA 10 mg/ml ml H2O (ml) Thuốc thử Biuret (ml) Nồng độ protein (mg/ml) 1 0.0 1.0 4 0 2 0.2 0. 8 4 2 3 0.4 0. 6 4 4 4 0.6 0.4 4 6 5 0.8 0.2 4 8 12 6 1.0 0.0 4 10 Lắc đều, để yên các ống nghiệm trong 20 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm. Giá trị OD540 của các ống nghiệm từ 2 – 6 sau khi trừ đi giá trị OD540 của ống 1 sẽ xây dựng được đồ thị biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang theo nồng độ protein chuẩn (BSA) (Đồ thị đường chuẩn). 3 X ịnh hàm ợng protein b ng h ng h Biur : Enzyme ngoại bào được tách chiết từ nấm mốc nuôi trên môi trường xốp. 10g mẫu (cả môi trường và nấm mốc) được cho vào ống falcon 45ml và 30ml nước cất vô trùng, vortex, ly tâm 4000 vòng/phút trong 30 phút lấy dịch trong. Tiếp tục lọc dịch bằng giấy thấm. Thu được 26 ml dịch chiết enzyme ngoại bào. Bảo quản ở - 20°C. Cho vào ống nghiệm 1 ml dung dịch mẫu và 4 ml thuốc thử Biuret, lắc đề, để yên trong 20 phút ở nhiệt độ phòng, dung dịch có màu xanh. Do OD ở bước sóng 540 nm. Lấy giá trị OD540 của mẫu trừ đi OD540 của ống nghiệm thay mẫu bằng nước cất rồi chiếu vào đồ thị chuẩn để suy ra lượng protein có trong dung dịch mẫu. D ng ồ hị ờng huẩn Nồng độ protein (mg/ml) OD540 2 0.003 4 0.012 6 0.024 8 0.034 10 0.039 Đường chuẩn BSA (phương pháp Biuret) y = 0.0047x - 0.0058 R2 = 0.9848 0 0.01 0. 0.03 0.04 0.05 2 4 6 8 10 Nồng độ protein (mg/ml) OD 54 0 OD540 Linear (OD540) 13 Ta có: Phương trình đường chuẩn BSA (phương pháp Biuret): y = 0,0047x - 0,0058 Trong đó: x: là nồng độ protein (mg/ml) y: là giá trị OD540 (A) Kế quả hí nghiệm - Các mẫu đều đã được pha loãng 2 lần trước khi đo OD. Mẫu MT1X MC7 MT2Đ OD540 (A) 0,310 0,311 0,322 Nồng độ protein (mg/ml) 134,383 134,809 139,489 Nồng độ protein (µg/ml) 134383 134809 139489 Nhận xét: - Giá trị OD540 của mẫu vượt ra xa ngoài giá trị OD540 trên đường chuẩn cho nên nồng độ protein có được