Bước đầu ứng dụng kỹ thuật southern blot phân tích đa dạng di truyên nấm magnaporthe grisea gây bệnh đạo ôn trên cây lúa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  ĐẶNG TRẦN ANH THƢ BƢỚC ĐẦU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SOUTHERN BLOT PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYÊN NẤM Magnaporthe grisea GÂY BỆNH ĐẠO ÔN TRÊN CÂY LÚA LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  BƢỚC ĐẦU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SOUTHERN BLOT PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYÊN NẤM Magnaporthe grisea GÂY BỆNH ĐẠO ÔN TRÊN CÂY LÚA LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện LÊ ĐÌNH ĐÔN ĐẶNG TRẦN ANH THƢ KHÓA: 2002 - 2006 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC FACULTY OF BIOTECHNOLOGY  POPULATION STRUCTURE OF Magnaporthe grisea EXAMINED INITIALLY BY SOUTHERN BLOT GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor Student LE DINH DON DANG TRAN ANH THU TERM: 2002 - 2006 HCMC, 09/2006 i LỜI CẢM TẠ  TÔI CHÂN THÀNH CẢM ƠN Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Bộ Môn Bảo vệ Thực vật, Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. TÔI TRÂN TRỌNG BIẾT ƠN Thầy Lê Đình Đôn đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện giúp đỡ chúng tôi hoàn thành khóa luận này. Thầy Bùi Cách Tuyến, thầy Bùi Minh Trí đã tạo điều kiện cho chúng tôi thực tập tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh. Thầy Nguyễn Đức Sáng đã giúp đỡ tôi về hóa chất và vật liệu nghiên cứu trong thời gian làm đề tài. Anh Nguyễn Văn Lẫm đã nhiệt tình chỉ dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Các anh chị ở Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, các anh chị ở bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giúp đỡ chúng tôi hoàn thành khóa luận. Các thành viên lớp Công Nghệ Sinh Học 28 đã động viên, giúp đỡ chúng tôi trong thời gian thực tập. CON THÀNH KÍNH BIẾT ƠN Cha Mẹ, các em và người thân trong gia đình đã ủng hộ và hỗ trợ con về mặt vật chất cũng như tinh thần để con có thể hoàn thành tốt khóa học này. TP Hồ Chí Minh tháng 8/2006 Đặng Trần Anh Thư ii TÓM TẮT KHÓA LUẬN  ĐẶNG TRẦN ANH THƯ, Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. Tháng 08/2006. “Bƣớc đầu ứng dụng kỹ thuật Southern Blot phân tích tính đa dạng di truyền của nấm Magnaporthegrissea gây bệnh đạo ôn trên cây lúa”. Giáo viên hướng dẫn: LÊ ĐÌNH ĐÔN  Cơ sở nghiên cứu: Sử dụng marker phân tử RFLP trên cở sở phương pháp Southern blot và phân tích sự khác biệt về sự thay đổi cấu trúc gen dẫn đến phân tích tính đa dạng di truyền của một số dòng nấm Magnaporthe grisea.  Mục đích nghiên cứu: Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của một số dòng nấm Magnaporthe grisea, làm cơ sở để đánh giá và có phương pháp phòng trị cho phù hợp.  Phƣơng pháp nghiên cứu: - Thực hiện ly trích và phân cắt genomic DNA bằng enzyme cắt giới hạn - Tiến hành phân tách các đoạn DNA cắt giới hạn trên gel agarose, chuyển và cố định DNA lên màng - Thực hiện phản ứng lai với phân tử probe là DNA plasmid được đánh dấu và phát hiện bằng huỳnh quang - Sử dụng phần mềm để phân tích tính đa dạng di truyền.  Kết quả: - DNA ly trích tốt và thực hiện thành công phản ứng cắt giới hạn - Biến nạp và ly trích thành công các loại plasmid được cung cấp để đánh dấu sư dụng cho phản ứng lai phát hiện MAGGY trong genome của M. grisea - Thực hiện phản ứng lai với probe pMGY-SB thành công đối mẫu đối chứng là plasmid pMGY-SB.  Kết luận : Do quy trình Southern blot chưa hoàn thiện trong điều kiện phòng thí nghiệm ở TT PTTNHS của trường Đại học Nông Lâm và hạn chế về mặt thời gian nên kết quả của phản ứng lai đã không đi đến thành công. Do đó, không có cơ sở để phân tích sự đa dạng di truyền trên nấm M. grisea. iii MỤC LỤC PHẦN TRANG Trang tựa Lời cảm tạ .................................................................................................................... i Tóm tắt ........................................................................................................................ ii Mục lục ...................................................................................................................... iii Danh sách các chữ viết tắt ......................................................................................... vi Danh sách các hình ................................................................................................... vii Danh sách các bảng ................................................................................................. viii 1. MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1 1.1. Đặt vấn đề ....................................................................................................... 1 1.2. Mục đích – Yêu cầu ........................................................................................ 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................................... 3 2.1. Sơ lược về cây lúa ......................................................................................... 3 2.2. Bệnh cháy lá trên cây lúa (đạo ôn) ................................................................. 3 2.2.1. Sự xuất hiện của bệnh cháy lá trên cây lúa ......................................... 3 2.2.2. Triệu chứng bệnh của cây lúa bị bệnh cháy lá lúa .............................. 4 2.2.3. Đặc điểm phát sinh bệnh ..................................................................... 5 2.2.4. Nguyên nhân gây bệnh ........................................................................ 5 2.3. Phương pháp Southern blot ............................................................................ 6 2.4. Enzyme cắt giới hạn ....................................................................................... 7 2.5. Các phương pháp chuyển DNA lên màng ...................................................... 8 2.5.1. Phương pháp mao dẫn hướng lên ........................................................ 8 2.5.2. Phương pháp mao dẫn hướng xuống ................................................... 9 2.5.3. Phương pháp mao dẫn hai chiều ......................................................... 9 2.5.4. Phương pháp chuyển bằng điện .......................................................... 9 2.5.5. Phương pháp chuyển bằng chân không ............................................... 9 2.6. Probe đánh dấu sử dụng trong Southern Blot .............................................. 10 2.7. Cơ sở của sự đa hình trong quần thể nấm M. grisea .................................... 10 2.8. Một số nghiên cứu ứng dụng Southern blot trong phân tích đa dạng di truyền của quần thể nấm M. grisea ............................................ 12 iv 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................... 14 3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành ................................................................... 14 3.2. Đối Tượng khảo sát ...................................................................................... 15 3.3. Nội dung thực hiện ....................................................................................... 15 3.4. Vật liệu và hóa chất ...................................................................................... 16 3.4.1. Dụng cụ và thiết bị ............................................................................ 16 3.4.2. Hóa chất ............................................................................................. 16 3.5. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 17 3.5.1. Triết tách DNA tổng số từ các mẫu nấm M. grisea (isolate) ............ 17 3.5.1.1. Chuẩn bị môi trường lỏng nhân sinh khối sợi nấm ................... 17 3.5.1.2. Ly trích DNA theo phương pháp lysis ...................................... 18 3.5.1.3. Phương pháp tinh sạch DNA ...................................................... 18 3.5.2. Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn ............................... 18 3.5.2.1. Chuẩn bị tế bào khả nạp.............................................................. 18 3.5.2.2. Biến nạp plasmid pMGY-SB, pMGR-T1, pEBA18 vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5 bằng phương pháp sốc nhiệt (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989) .......................................................... 19 3.5.2.3. Kiểm tra kết quả biến nạp ........................................................... 19 3.5.2.4. Tăng sinh vi khuẩn và ly trích plasmid bằng kit ......................... 21 3.5.3. Thực hiện đánh dấu plasmid ............................................................. 22 3.5.4. Tạo mẫu lai ........................................................................................ 22 3.5.4.1. Thực hiện phản ứng cắt genomic DNA bằng enzyme cắt giới hạn ..................................................................... 23 3.5.4.2. Điện di sản phẩm cắt trên gel agarose ........................................ 23 3.5.4.3. Chuyển DNA từ gel lên màng bằng phương pháp mao dẫn hướng lên................................................ 24 3.5.4.4. Làm khô màng ........................................................................... 25 3.5.4.5. Cố định DNA lên màng .............................................................. 25 3.5.5. Lai southern ...................................................................................... 26 3.5.5.1. Thực hiện phản ứng lai ............................................................... 26 3.5.5.2. Rửa màng sau khi lai .................................................................. 26 v 3.5.5.3. Phát hiện kết quả trên phim X-ray .............................................. 27 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................................... 28 4.1. Ly trích DNA tổng số của nấm M. grisea. ................................................... 28 4.2. Biến nạp plasmid pMGY-SB, pEBA18, pMGR-T1 vào vi khuẩn E.coli DH5α ............................................................................ 30 4.3. Thiết lập phản ứng cắt DNA genome của M. grisea bằng enzym cắt giới hạn ...................................................................... 31 4.4. Phản ứng lai DNA M. grisea sau khi được cắt bằng EcoRV và BamHI với probe SB ......................................................... 33 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................... 38 5.1. Kết luận ....................................................................................................... 38 5.2. Đề nghị ......................................................................................................... 38 TÀI NIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 49 vi DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT bp: base pair B: Bam HI Ctv cộng tác viên DNA: Deoxyribonucleic acid 2,4 – DAPG: 2,4 – Diacetylphloroglucinol DIG: Digoxigenin E: Eco RV ETDA: Ethylenediamine tetraacetic acid H: Hind III HRP: Horseradish peroxydase Kb: kilobase PCR: Polymerase Chain Reaction RE: Restriction Enzyme RFLP: Restriction fragment length polymorphism RNA: Ribonucleic acid RT: Reverse transcrip SDS: Sodium dodecyl sulfate SSC: Saline sodium citrate TAE: Tris Acetate EDTA TBE: Tris-base Boric EDTA UV: Ultraviolet (light) w/v: Weight for volume vii DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1. Triệu chứng bệnh đạo ôn trên lá lúa (a) và trên cổ bông (b) ................... 4 Hình 2.2. Bào tử nấm M. grisea chụp dưới kính hiển vi ........................................ 5 Hình 2.3. Vòng đời của nấm M. grisea ................................................................... 6 Hình 2.4: Những vị trí cắt giới hạn của MAGGY ................................................ 10 Hình 4.1. DNA tổng số của nấm M. grisea .......................................................... 28 Hình 4.2. DNA của các nguồn nấm M. grisea sau khi được xử lý với RNAse .... 30 Hình 4.3. Kết quả ly trích plasmid điện di trên gel agarose 0,8 ............................ 31 Hình 4.4. Kết quả thực hiện phản ứng cắt DNA tổng số bằng enzyme giới hạn ........................................................................... .32 Hình 4.5. Kết quả điện di tạo mẫu DNA cho phản ứng lai ................................... 34 Hình 4.6. Kết quả phát hiện trên X-ray film ......................................................... 35 viii DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1. Các enzym cắt thông dụng……………………………………………. ... 7 Bảng 3.1. Enzym giới hạn dùng phân cắt genomic DNA tạo mẫu lai…………. .. ..16 Bảng 3.2. Thành phần phẩn ứng cắt với tổng thể tích là 25 µl…………………. . ..23 Bảng 3.3. Thành phần phản ứng cắt với tổng thể tích phản ứng là 50 µl……… …23 Bảng 4.1. Những khó khăn và những giải pháp khắc phục trong thực hiện phản ứng lai Southern ……………………………… …36 1 PHẦN 1. MỞ ĐẦU 5.3. Đặt vấn đề Magnaporthe grisea (Hebert) Barr. (anamorph, Pyricularia. grisea (Cooke) Sacc.) là nguyên nhân gây bệnh cho nhiều loài thực vật thuộc họ Gramineae, Cannaceae, Cyperaceae và Zingiberaceae [12]. Đặc biệt, loại nấm này là nguyên nhân gây bệnh cháy lá (đạo ôn) trên cây lúa (Oryza sativa), đây là một loại bệnh nghiêm trọng và gây tổn thất lớn đối với các nước trồng lúa trên thế giới. Hàng năm, năng suất lúa gạo do bệnh này gây ra giảm 30% trên toàn thế giới. Ở Việt Nam, đạo ôn cổ gié đã gây hại 138.000 ha trong năm 1991 và 217.000 ha trong năm 1992 ở đồng bằng Sông Hồng. Bệnh cũng đã gây hại nghiêm trọng ở đồng bằng Sông Cửu Long từ 1978-1981 [11]. Theo báo cáo của Cục Bảo vệ thực vật, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, tổng diện tích bị nhiễm bệnh đạo ôn trong vụ Đông Xuân 2003-2004 là 37.029 ha (tăng 3 lần so với Đông Xuân 2003), vụ Hè Thu 2006 là 38.346 ha lúa bị nhiễm đạo ôn lá và 4046 ha bị nhiễm đạo ôn cổ bông. Trong những năm gần đây, người trồng lúa đã áp dụng nhiều biện pháp phòng trừ như: phun thuốc diệt nấm và tăng cường trồng giống kháng trên diện rộng. Thuốc diệt nấm có thể giảm một phần thiệt hại của bệnh nhưng không tiêu diệt được bệnh. Những giống kháng có thể kháng được bệnh đạo ôn nhưng chỉ có thể duy trì được tính kháng trong một thời gian ngắn. Điều này có thể được giải thích rằng nấm Magnaporthe grisea có sự đa dạng di truyền trong quần thể [11]. Một số giả thuyết cho rằng những yếu tố chuyển vị (transposon) [12], thể dị hạch (heterokaryosis), và sự tái tổ hợp trong sinh sản hữu tính có thể là nguyên nhân tạo nên sự đa dạng di truyền trong quần thể nấm M. grisea [14]. Ngày nay, cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học, nhiều kĩ thuật mới ra đời như kĩ thuật PCR, Southern blot, đọc trình tự v.v.. giúp cho quá trình nghiên cứu cấu trúc di truyền của quần thể sinh vật thuận lợi hơn. Những kỹ thuật này đã được ứng dụng để nghiên cứu sự đa hình trong quần thể dựa trên những DNA marker như: RFLP, ALP, AFLP, RAPD, DAF, SSR, AP-PCR, SSCP, MRDHV-DNA, SNP [1]. Trên thế giới, các kĩ thuật này đã được áp dụng thành công trong việc nghiên cứu về 2 sự đa dạng di truyền của nấm Magnaporthe grisea. Ở nước ta, những nghiên cứu như vậy còn rất ít. Xuất phát từ tình hình trên, tôi đã thực hiện đề tài “Bƣớc đầu ứng dụng kỹ thuật Southern blot phân tích sự đa dạng di truyền của nấm Magnaporthe grisea gây bệnh đạo ôn trên cây lúa”, nhằm phân tích được cấu trúc di truyền giữa các dòng nấm Magnaporthe grisea gây bệnh đạo ôn trên cây lúa ở các tỉnh đồng bằng Sông Cửu Long. 5.4. Mục đích – Yêu cầu 5.4.1. Mục đích Bước đầu phân tích đa dạng di truyền của nấm Magnaporthe grisea gây bệnh đạo ôn bằng phương pháp Southern blot. 5.4.2. Yêu cầu - Phục hồi và nhân sinh khối các dòng nấm Magnaporthe grisea. - Ly trích DNA các dòng nấm Magnaporthe grisea. - Tạo được mẫu lai từ sản phẩm cắt DNA genome bằng các enzyme giới hạn. - Tạo được phân tử probe đánh dấu từ DNA plasmid. - Thiết lập được phản ứng lai và phát hiện sản phẩm lai trên phim X – ray. 3 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Sơ lƣợc về cây lúa Lúa thuộc họ Gramieae, loại Oryza, loài Oryza sativa. Lúa đang được trồng thuộc loài phụ Indica (lúa tiên) và Japonica (lúa cánh). Lúa là một loại cây lương thực quan trọng trên thế giới, đặc biệt là ở các nước Đông Nam Á. Lúa có giá trị dinh dưỡng cao và được ứng dụng nhiều trong chế biến thực phẩm, cung cấp năng lượng cho con người sống và hoạt động. Cây lúa có nguồn gốc lâu đời và đã được thuần hóa từ cây lúa hoang dại, bán hoang dại, dị hợp tử và đầy những biến dị. Quá trình thuần hóa cũng là quá trình lai tạo tự nhiên, đột biến gen do môi trường và sự chọn lọc của con người qua hàng ngàn năm. Việt Nam là một nước nhiệt đới nóng ẩm, thích hợp cho sự sinh trưởng và phát dục của cây lúa, vì vậy hầu hết các địa phương đều có trồng lúa. Nơi quá cao không có hệ thống thủy lợi, người ta cũng trồng lúa cạn. Do vị trí địa lý nước ta chạy dọc theo bờ biển, địa hình, địa thế cao thấp khác nhau, có điều kiện khí tượng thủy văn khác nhau, nên hình thành các vụ lúa và các vùng trồng lúa khác nhau. Nước ta có ba vùng trồng lúa lớn là: vùng lúa Bắc bộ và bắc Trung bộ, vùng lúa Trung và nam Trung bộ, vùng lúa ở Nam bộ [5]. Lúa thường gặp rất nhiều loại bệnh mà nguyên nhân chủ yếu là do nấm, vi khuẩn và số ít là do virus. Bệnh do nấm gây ra điển hình như: bệnh đạo ôn, đốm nâu, bệnh khô vằn và một số bệnh khác. Bệnh do vi khuẩn gây ra như: cháy bìa lá lúa, bệnh vàng lá lúa. Bệnh do virus gây ra như lùn soắn lá lúa. Trong đó, bệnh do nấm gây ra là thường gặp nhất và gây tổn thất nhiều nhất [6]. 2.2. Bệnh cháy lá trên cây lúa (đạo ôn) 2.2.1. Sự xuất hiện của bệnh cháy lá trên cây lúa Bệnh được ghi nhận và mô tả đầu tiên tại Trung Quốc vào năm 1637. Năm 1704, M. Tsuchiya (Nhật) bắt đầu nghiên cứu hiện tượng cháy lá trên cây lúa. Sau đó, bệnh được báo cáo có ở nhiều quốc gia khác như là Ý (1788), Mỹ (1876) và Ấn Độ (1913). Đây là bệnh phân bố rộng và có mặt trên 80 quốc gia trồng lúa trên thế giới [2]. Ở Nhật từ năm 1953-1960, thiệt hại về năng suất là 2,98%, tính riêng trong năm 4 1960, thất thu do bệnh cháy lá chiếm 24% trong tổng thất thu do sâu, bệnh, bão lũ. Bệnh có thể làm mất trắng như ở Hà Đông (Việt Nam). Đối với bệnh thối cổ gié, ước tính cứ 10% gié bị nhiễm bệnh thì năng suất thất thu 6% và tỉ lệ hạt kém phẩm chất gia tăng 5%. Ở Miền Bắc, các vùng Hải Phòng, Thái Nguyên, Ninh Bình, Bắc Giang, Hà Đông bị thiệt hại nặng. Ở đồng bằng sông Cửu Long, hàng năm thường có hai cao điểm của bệnh là tháng 11-12 dương lịch và tháng 5-6 dương lịch. Các huyện Châu Thành, Chợ Gạo, Cai Lậy, Chợ Mới (An Giang), Thạnh Trị (Cần Thơ) là những nơi thường có bệnh [6]. 2.2.2. Triệu chứng bệnh cháy lá trên cây lúa Bệnh cháy lá lúa là bệnh gây hại nghiêm trọng nhất trên cây lúa, còn được gọi là bệnh đạo ôn. Khi dịch cháy lá xảy ra trên diện rộng thì năng suất và sản lượng sẽ giảm rất rõ và thiệt hại nghiêm trọng về mặt kinh tế. Tác nhân gây bệnh có thể tấn công mọi giai đoạn của cây lúa; bắt đầu từ giai đoạn mạ hoặc sau khi gieo xạ cho đến trước trổ thì gọi là bệnh cháy lá. Bệnh có thể gây hại trên cổ lá nên gọi là thối cổ lá, hoặc gây hại trên cổ bông nên được gọi là thối cổ bông làm lép hạt, đôi khi bệnh có thể gây lem vỏ hạt lúa. a) b) Hì