Các acid amin không thay thế

MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1:Công thức cấu tạo của các acid amine không thay thế ……………………………...3 Bảng 2.1:Hằng số phân li(pK) và điểm đẳng điện(pI) của acid amine không thay thế …………..5 Bảng 2.2:Độ hòa tan của các acid amine không thay thế trong nước (g/100g H2O) …………… 6 Bảng 2.3.Vị của các acid amine không thay thế ………………………………………………… 6 Bảng 4.1 :Thành phần của các loại acid amine không thay thế trong một số loại nguyên liệu thường gặp (đơn vị:g/100g) .................................................................................................. 12 Bảng 4.2: Vai trò của các acid amine và các bệnh lý gặp phải khi thiếu các loại acid amine tương ứng……………………………………………………………………………………… 12 Bảng 4.3:Nhu cầu hằng ngày về các loại acid amine không thay thế theo trọng lượng thể (đơn vị : mg/kg/ngày) ………………………………………………………………………………. 13 DANH MỤC HÌNH Hình7.1: Sữa tươi chứa lysine ...................................................................................................... 17 Hình7.2: Các loại thực phẩm chức năng chứa acid amine không thay thế .................................. 18 Hình7.3: Các loại thuốc có chứa acid amine không thay thế ....................................................... 18 Hình7.4: Các sản phẩm acid amine ở dạng hỗn hợp và riêng lẻ .................................................. 18 CÁC ACID AMIN KHÔNG THAY THẾ 1.Giới thiệu 1.1.Định nghĩa acid amine không thay thế Acid amine không thay thế (hay còn gọi là các acid amine thiết yếu)là các acid amine cần thiết đối với sự sinh trưởng và phát triển bình thường của cơ thể người và động vật.Tuy nhiên,nó không tự được tổng hợp trong cơ thể mà được bổ sung từ ngoài vào qua thức ăn. Trong số 20 loại acid amin thường gặp trong phân tử protein,tùy thuộc vào những điều kiện riêng biệt của từng loài và từng giai đoạn ,do có sự khác biệt về khả năng tổng hợp của cơ thể mà thành phần và số lượng các acid amine không thay thế đối với từng cơ thể là khác nhau.Theo nhiều tài liệu ,có 8 acid amine cần thiết cho người lớn :valin, leucine, isoleucine, metionine,threonine,phenylalanine,tryptophan và lyzine.Đối với trẻ em cần thêm 2 acid amine nữa là: argine và histidine. 1.2.Cấu tạo Các acid amine không thay thế đều có cấu tạo chung của các acid amine ,trong phân tử bao gồm nhóm α amine(-NH2),nhóm α carboxyl(-COOH)và gốc R khác nhau. Dưới đây là bảng công thức cấu tạo của 10 acid amine không thay thế: Bảng 1.1:Công thức cấu tạo của các acid amine không thay thế 1.3.Phân loại Có thể phân loại các các acid amine không thay thế dựa vào gốc R,là yếu tố quyết định các tương tác nội phân tử và tương tác giữa các phân tử . -Những acid amine có gốc R không phân cực và không tích điện :valine, leucine, isoleucine , methionine, phenylalanine,tryptophan. -Acid amine có gốc R không tích điện nhưng phân cực,có nhóm chức trung tính và phân cực ,có khả năng tạo liên kết hydro với một số phân tử nước như:threonine -Các acid amine có gốc R tích điện :lysine,histidine và arginine.Cả 3 acid amin này đều tích điện (+) ở pH=7. 2.Tính chất vật lý ,tính chất cảm quan. 2.1.Tính chất vật lý 2.1.1.Tính phân ly Trong dung dịch nước các acid amine không thay thế tồn tại ở dạng: Tùy thuộc vào điều kiện pH ,các acid amin có thể tồn tại ở dạng cation,anion hay trung tính.Quá trình này được đặc trưng bởi điểm đẳng điện pI và hằng số phân li pK. Tại giá trị pH,trong dung dịch ,acid amin chỉ tồn tại dưới dạng các ion lưỡng cực ,tổng điện tích của acid amin trong dung dịch bằng 0 được gọi là giá trị pH đẳng điện(pI). Bảng 2.1: Hằng số phân li(pK) và điểm đẳng điện(pI) của acid amine không thay thế Đối với các acid amine,tính acid của nhóm carboxyl cao hơn và tính bazơ của nhóm amine thấp hơn so với các acid carboxylic và amine tương ứng có cùng số lượng C do ảnh hưởng của khoảng cách giữa nhóm amine và carboxyl. 2.1.2. Độ hòa tan Các acid amine nói chung ,acid amine không thay thế nói riêng đều chứa các nhóm phân cực là amine và carboxyl .Vì thế,chúng có thể tan tốt trong nước. Độ hòa tan trong nước của acid amine rất khác nhau ,có thể tăng lên khi thêm vào dung dịch một lượng acid hoặc kiềm nhờ sự tạo thành muối.Ngoài ra ,các acid amine trong hợp phần với các acid amine khác có độ tan tốt hơn khi nó chỉ có riêng một mình.Thực tế ,độ hòa tan của các acid amine trong dung dịch thủy phân protein cao hơn khi các acid amine ở dạng riêng lẻ. Bảng 2.2:Độ hòa tan của các acid amine không thay thế trong nước (g/100g H2O) Ngoài ra ,các acid amine trong hợp phần với các acid amine khác sẽ có độ tan tốt hơn khi nó chỉ có riêng một mình.Thực tế ,độ hòa tan của các acid amine trong dung dịch thủy phân protein cao hơn khi các acid amine ở dạng riêng lẻ. Trong dung môi hữu cơ ,các acid amine tan rất kém do tính phân cực.Tất cả các acid amine đều không tan trong ether.Trong ethanol các acid amin :phenylalanine, histidine và tryptophan chỉ tan một lượng rất thấp,methionine,arginine, leucine(0.0217g/100g,25oC).Độ hòa tan của isoleucine trong dung môi ethanol nóng tương đối cao(0.09g/100g,20oC và 0.13 g/100g,78-80oC). 2.1.3.Hoạt tính quang học Tất cả các acid amin đều có trung tâm bất đối xứng .Vì vậy ,trong tự nhiên nó có thể tồn tại dưới dạng đồng phân L hoặcD và có khả năng làm quay mặt phẳng của ánh sáng phân cực thẳng khi cho ánh sáng phân cực đi qua.Acid amine dạng D ít phổ biến ,tuy nhiên cũng xuất hiện trong tự nhiên ở một số peptid của vi sinh vật.Acid amine dạng D không được tiêu hóa trong cơ thể người. Hiện tượng quay quang học và độ lớn của góc quay phụ thuộc vào pH và nhiệt độ. 2.1.4.Khả năng hấp thụ tia UV Các acid amine có vòng thơm như tryptophan ,phenylalanin có khả năng hấp thụ quang phổ trong dãy UV với bước sóng hấp thu mạnh nhất là 200-230 nm và 250-290 nm . Histidine,methionine hấp thu UV ở bước sóng 200-210 nm.Trong các phép phân tích độ hấp thu sóng tại 280nm được sử dụng để định tính và định lượng các acid amine trong protein và peptid. 2.2.Tính chất cảm quan Tương tự như các acid amine nói chung,acid amine không thay thế cũng tham gia cào việc tạo mùi vị cho những sản phẩm giàu protein đã qua quá trình xử lý bằng quá trình thủy phân.Vị của các acid amine phụ thuộc vào cấu trúc không gian ,dạng L thường có vị đắng ,dạng D có vị ngọt , acid amine có gốc R mạch vòng thì có cả vị ngọt và vị đắng . Bảng 2.3.Vị của các acid amine Acid amine Dạng L Dạng D Vị Ngưỡng cảm nhận(mmol/l) Vị Ngưỡng cảm nhận(mmol/l) Arginine đắng trung dung Histidine đắng 45-50 ngọt 2-4 Ísoleucine đắng 10-12 ngọt 8-12 Leucine đắng 11-13 ngọt 2-5 Lyzine ngọt đắng 80-90 ngọt Methionine vị lưu huỳnh vị lưu huỳnh và vị ngọt Phenylalanine đắng 5-7 ngọt 1-3 Threonine ngọt 35-45 ngọt 40-50 Tryptophan đắng 4-6 ngọt 0.2-0.4 3.Tính chất hóa học riêng của các acid amine không thay thế . Các acid amine không thay thế đều có thể thực hiện những phản ứng hóa học của các acid amine nói chung như:phản ứng deamin hóa ,phản ứng decarboxyl hóa,phản ứng với thuốc thử ninhydrin,…Tuy nhiên,nó có những phản ứng riêng phụ thuộc vào gốc R: 3.1.Phản ứng của nhóm ε-NH2 của lysine 3.1.1.Phản ứng aryl hóa Tương tự như nhóm α-NH2 ,các nhóm ε-NH2 cũng có thể tham gia phản ứng aryl hóa với 1-floro-2,2-dinitrobenzen(FDNB) tạo ra hợp chất N-2,4-dinitrophenyl aminoacid có màu vàng và bền : Phản ứng này được dùng để định lượng nhóm ε-NH2 và lyzine. 3.1.2. Phản ứng acyl hóa : Đối với lysine tồn tại ở dạng tự do phản ứng acyl hóa có thể xảy ra ở nhóm α-NH2 hoặc ε-NH2 tùy thuộc vào tác nhân phản ứng .Trong đó ,phản ứng acyl hóa chọn lọc ở nhóm ε-NH2 khi được tiến hành với phức lyzine-Cu2+ : Phản ứng acyl hóa chọn lọc ở nhóm α-NH2 khi được tiến hành với dẫn xuất benzylidene Phản ứng với các acid dicarboxylic anhydride, như acid succinic anhydride tạo thành protein có nhóm carboxyl thay thế nhóm amine của lysine: Phản ứng ngược:dẫn xuất N-maleyl lysine được tạo thành khi cho protein có chứa lysine phản ứng với acid maleic anhydride trong môi trường kiềm.Trong môi trường acid, dẫn xuất tạo thành phân ly và tạo thành protein ban đầu 3.1.3Phản ứng tạo polyme Protein có chứa lysine có thể phản ứng với acid carboxyanhydride tạo thành sản phẩm polyme Gía trị của n phụ thuộc vào điều kiện phản ứng .Trong đó ,carboxylanhydride có thể được tạo thành từ phản ứng giữa acid amine với phosgene: 3.2. Phản ứng của nhóm ngoại guanidyl của arginine Sự có mặt của α – naphthol và hypobromite trong dung dịch protein có chứa arginine tạo thành hợp chất có màu đỏ ,có cấu trúc sau: Protein có chứa arginine phản ứng với α hoặc β –dicarbonyl tạo dẫn xuất cyclic,sản phẩm tạo thành tiếp tục cho phản ứng với NaBH4 tạo thành dẫn xuất nitropyrimidine ,có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 335nm : Phản ứng giữa nhóm ngoại của arginine với 1,2-xyclohexanedione là phản ứng có tính chọn lọc cao và xảy ra trong điều kiện bình thường ,sản phẩm tạo thành của phản ứng cũng có thể tái tạo trở lại nhóm ngoại của arginine khi cho phản ứng với hydroxyamine: 3.3. Phản ứng của nhóm ngoại thioether của methionine Methionine có thể bị oxy hóa tạo thành sulfoxide và sau đó là sulfone.Phản ứng này làm mất các acid amine thiết yếu trong quá trình chế biến thực phẩm: Nhóm thioether có thể phản ứng với iodo-acetic tạo thành các sulfonium: Tương tự ,nhóm thioether cũng phản ứng với acid performic,phản ứng này được sử dụng để định lượng methionine: Phản ứng của protein có chứa methionine với cyanogen bromide (BrCN) làm đứt liên kết peptid tại vị trí nhóm carboxyl của phân tử methionine. Phản ứng này được dùng để cắt các liên kết peptid trong chuỗi peptid một cách có định hướng: 3.4.Phản ứng của nhóm ngoại tryptophan N-Bromosuccinimide có thể oxy hóa tryptophan cũng như tyrosine,histidine và cysteine theo phản ứng: Phản ứng này được dùng để phân chia chuỗi peptid có chứa tryptophan 4. Hàm lượng của các loại acid amine không thay thế ,vai trò và nhu cầu đối với cơ thể. 4.1.Hàm lượng Trong tự nhiên ,các acid amine không thay thế không tồn tại ở dạng tự do mà ở dạng liên kết trong phân tử protein.Thành phần và tỉ lệ các acid amine không thay thế là chỉ số quan trọng khi đánh giá giá trị sinh học của protein,hỗn hợp thực phẩm chứa 35%trứng và 65% protein khoai tây được tìm thấy là có giá trị sinh học cao nhất. Nguồn thực phẩm có chứa lượng acid amine không thay thế tương đối đầy đủ là thịt ,cá ,trứng ,đậu tương.Protein từ ngủ cốc và các loại thực vật khác thường thiếu lysine,sữa bò và thịt thiếu methionine,lúa mì và lúa mạch thường thiếu threonine,trong khi casein(protein trong sữa ),protein từ bắp và gạo lại thiếu tryptophan. Bảng 4.1 :Thành phần của các loại acid amine không thay thế trong một số loại nguyên liệu thường gặp (đơn vị:g/100g) Acid amine Các loại nguyên liệu Trứng Thịt bò (cổ,vai) Thịt lợn (ba chỉ) Cá chép Cá ngừ Ngô Gạo Đậu tương Đậu phộng Tryptophan 0.12 0.18 0.09 0.20 0.22 0.06 0.07 0.59 0.22 Threonine 0.44 1.10 0,45 0.78 087 0.35 0.23 1.76 0.88 Isoleucine 0.66 1.25 0.54 0.82 0.92 0.33 0.28 1.97 0.90 Leucine 1.01 2.19 0.90 1.44 1.62 1.15 0.53 3.30 1.67 Lysine 0.80 2.32 0.96 1.63 1.84 0.26 0.23 2.70 0.92 Methionine 0.39 0.71 0.25 0.52 0.59 0.19 0.15 0.54 0.31 Phenylalanine 0.68 1.08 0.46 0.69 0.78 0.46 0.34 2.12 1.33 Valine 0.80 1.36 0.61 0.91 1.03 0.47 0.39 2.02 1.08 Arginine 0.64 1.78 0.75 1.06 1.19 0.47 054 3.15 3.08 Histidine 0.29 0.87 0.43 0.52 0.59 0.28 0.15 1.09 0.65 (Số liệu được lấy từ USDA(bộ nông nghiệp Mĩ) 4.2.Vai trò của các acid amine không thay thế đối với cơ thể. Bảng 4.2: Vai trò của các acid amine và các bệnh lý gặp phải khi thiếu các loại acid amine tương ứng Acid amine Vai trò Bệnh lý gặp phải khi thiếu Histidine Cần thiết cho sự tổng hợp Axitnucleotit Hemoglobin,điều chỉnh quá trình trao đổi chất. Gây thiếu máu ,giảm tính thèm ăn, dẫn đến chậm phát triển. Phenylalanine Duy trì hoạt động bình thường của tuyến giáp,tuyến thượng thận Lysine. Làm tăng sinh trưởng,tổng hợp Nucleo protein, tạo sắc tố da. Cơ thể chậm phát triển,chuyển hóa canxi và photpho kém,gây còi xương có thể dẫn tới thoái hóa Leucine Tổng hợp protein,duy trì hoạt động của tuyến nội tiết. Làm mất cân bằng Azot,giảm tốc độ sinh trưởng,giảm tính them ăn. Methionine Làm tăng sinh trưởng,ảnh hưởng đến chức năng của gan và tụy,điều hòa quá trình trao đổi mỡ,chống mỡ hóa gan,cần thiết cho quá trình đồng hóa và dị hóa Gây thiếu máu,mất tính thèm ăn,gan nhiễm mỡ,thoái hóa cơ,giảm sự phân giải các chất độc tronng cơ thể. Isoleucine Cần thiết cho việc sử dụng và trao đổi các acid amine trong thức ăn. Mất tính thèm ăn,cản trở sự phân hủy các chất chứa Azot. Threonine Cần thiết cho sự trao đổi và sử dụng đầy đủ các acid amine trong thức ăn,kích thích sự phát triển. Valine Cần thiết cho sự hoạt động bình thường của hệ thần kinh. Tryptophan Kích thích cho sự phát triển,duy trì sức sống,điều hòa chức năng nội tiết,đảm bảo cho sự phát triển của tinh trùng,tham gia tổng Hemoglobin của hồng cầu. Phá hủy tuyến nội tiết,giảm khôi lượng cơ thể. Arginine Ảnh hưởng tới quá trình tạo sụn, xương. Gây rối loạn trao đổi chất hydratcacbon và protein,làm giảm sự phát triển,nhất là ở trẻ em. 4.3 Nhu cầu các loại acid amine của cơ thể Bảng 4.3:Nhu cầu hằng ngày về các loại acid amine không thay thế theo trọng lượng thể (đơn vị : mg/kg/ngày) Acid amine Đối tượng Trẻ em (2-4tháng tuổi) Trẻ (2-5 tuổi) Trẻ (10-12 tuổi) Người trưởng thành Histidine 29 ? ? 8-10 Isoleucine 88 31 28 10 Leucine 150 73 44 14 Lysine 99 64 44 12 Methionine 72 27 22 13 Phenylalanine 120 69 22 14 Threonine 74 37 28 7 Tryptophan 19 12.5 3.3 3.5 Valine 93 38 25 10 (Theo ước tính của tổ chức FAO và WHO ,số liệu được đánh giá năm 1985) 5.Những biến đổi của các acid amine không thay thế trong chế biến và sản xuất . 5.1Biến đổi do nhiệt Trong quá trình gia công kĩ thuật các nguyên liệu giàu protein ,bên cạnh những biến đổi có định hướng và mong muốn ,còn xảy ra những phản ứng phụ ngoài dự định và nhiều khi cũng không mong muốn liên quan đến nhiệt độ .Đó là những biến đổi trong quá trình gia nhiệt ,một công đoạn phổ biến trong mọi quá trình tạo thành sản phẩm thực phẩm.Đối với các loại thực phẩm có chứa protein thì những biến đổi của thành phần acid amine không thay thế,chỉ số quan trọng trong đánh giá chất lượng sinh học của thực phẩm có protein, có thể làm giảm đáng kể chất lượng thực phẩm . Khi gia nhiệt khan các protein ở nhiệt độ trên 200oC(nhiệt độ đạt được khi rán thịt và cá ) thì tryptophan sẽ bị vòng hóa để tạo ra α ,β hoặc γ carbolin. Khi gia nhiệt ở nhiệt độ cao (t > 200oC) các thực phẩm giàu protein có pH trung tính hoặc gia nhiệt các thực phẩm giàu protein có môi trường kiềm thì sẽ xảy ra một số chuyển hóa của các acid amine không thay thế : -Phá hủy một số acid amine không thay thế:như arginine chuyển thành ornitin ,ure,sitrulin và amoniac;threonine và lysine cũng bị phá hủy. -Protein có chứa lysine có thể tạo ra các cầu nối đồng hóa trị giữa mạch polypeptid có chứa gốc lysine và mạch polypeptid có chứa gốc DHA ,tạo thành liên kết lizinoalanin: Khi xử lý nhiệt thịt hoặc cá ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ thanh trùng (>110-115oC) thì còn tạo ra các cầu đồng hóa trị kiểu izopeptid giữa gốc lysine của chuỗi polypeptid này với gốc glutamic hoặc gốc aspartic của chuỗi peptid khác: Về phương diện dinh dưỡng ,việc tạo ra các cầu đông hóa trị izopeptid trong cùng một phân tử hoặc giữa các phân tử sẽ làm giảm độ tiêu hóa của nitơ, giảm hệ số sử dụng protein và giá trị sinh học của protein .Hơn nữa do hiệu ứng không gian việc tạo ra các cầu đồng hóa trị sẽ ngăn cản không cho các protease đến được vùng đặc hiệu để thủy phân ,do đó làm cho quá trình tiêu hóa protein bị chậm lại . 5.2.Biến đổi do pH Trong quá trình chế biến một số sản phẩm như: nước tương, xì dầu, tàu vị yểu…có nguồn gốc từ protein thực vật, sự thủy phân protein được ứng dụng để thu nhận các sản phẩm thủy phân hoàn toàn hoặc thu nhận các sản phẩm thủy phân chưa hoàn toàn. -Quá trình thuỷ phân ở nhiệt độ cao với xúc tác axit HCl đặc, sẽ làm phân hủy hoàn toàn Trp và một phần Thr, Ser, Met, Cys. -Nếu tiến hành thủy phân protein bằng kiềm thì tryptophan được bảo toàn, nhưng xảy ra hiện tượng racemic hóa. Sản phẩm thủy phân là hỗn hợp racemic D,L-aminoacid, làm giảm giá trị dinh dưỡng. 5.3. Biến đổi do enzyme Trong quá trình bảo quản các thực phẩm giàu protein thường xảy ra hiện tượng ôi thối làm mất giá trị dinh dưỡng của thực phẩm .Nguyên nhân gây ra hiện tượng trên là do tác dụng của enzyme có sẵn trong thực phẩm cũng như của vi sinh vật xâm nhập từ môi trường ngoài vào .Các acid amine bị chuyển hóa theo những phản ứng cơ bản sau: Phản ứng khử amine :thường xảy ra trong điều kiện hiếu khí (qua trình hiếu khí),tạo thành sản phẩm là acid hữu cơ tương ứng với acid amine bị phân giải và khí amoniac gây mùi khó chịu. Phản ứng khử nhóm carboxyl: thường xảy ra trong điều kiện yếm khí (quá trình yếm khí),sản phẩm cuối cùng là các amine và CO2 Nếu acid amine có mạch hở thì amine được hình thành là những amine ít độc .Nhưng nếu acid amine là mạch kín thì amine được hình thành là những amine rất độc .Các acid amine này có tên chung là promain.Ví dụ : Từ Lyzine cacdaverin Tryptophan tryptamin Histidine histadine Trong đó tryptamin làm co giãn động mạch.Histamin có tính kích thích tiết dịch vị của dạ dày ,làm nở vi huyết quản ,gây nổi ban,dị ứng . Ngoài các phản ứng trên ,trong quá trình thối rửa cong cosd một số phản ứng phụ.Các phản ứng phụ này sẽ hình thành các amine có thêm một hoặc nhiều gốc metyl gọi là betain.ThưỜNG thì mỗi một acid amine sẽ có một betain tương ứng.Các betain thường là chất độc gây hiện tượng co giật và bài tiết nước dãi. Trong quá trình họat động sống ,các vi sinh vật gây thối rửa thường gặp trong đường ruột và trong quá trình cất giữ protein,acid amine có mạch vòng như tryptophan chuyển hóa thành các sản phẩm độc có mùi khó chịu như:scatol,indol. Phản ứng tạo thành scatol, indol của tryptophan gây mùi khó chịu và có tính độc. 6. Xác định hàm lượng các acid amine. Để đánh giá chất lượng toàn diện của sản phẩm thực phẩm đã qua quá trình chế biến người ta thường xác định thành phần và hàm lượng các acid amine không thay thế có mặt trong các sản phẩm,trong đó phương pháp sắc kí giấy là đơn giản và nhanh hơn cả và thường được áp dụng.Phương pháp sắc kí giấy để xác định các acid amine được xây dựng dựa trên những đặc tính và biến đổi của acid amine trong quá trình thủy phân và phản ứng với các thuốc thử tạo màu.Các bước cơ bản của phương pháp sắc kí giấy: -Thủy phân thực phẩm có chứa protein ,phá vỡ các liên kết peptid để tạo ra dung dịch có chứa acid amine ở dạng tự do. +Khi thủy phân bằng acid ,tryptophan bị phá hủy hoàn toàn ;từ 5-10% xerin ,threonine bị phá hủy. +Khi thủy phân bằng kiềm tất cả các acid amine (trừ tryptophan )đều bị phá hủy. -Định tính các acid amine bằng cách chạy sắc kí: Khi đặt giải giấy có chấm chất tan (dung dịch chứa các acid amine)vào bình chứa dung môi thích hợp (dung môi n-Butanol,acid acetic,nước hoặc dung môi phenol,nước ) ,dưới tác dụng của lực mao dẫn ,dung môi sẽ chuyển theo chiều dọc giấy ,kéo theo chất cần phân chia(các acid amine ) và đồng thời phân tích chúng ra thành các thành phần khác nhau.Các chất tan (acid amin ) có hệ số phân bố khác nhau ,dù rất nhỏ cũng được tách ra khỏi nhau.Do đó các chất tan sẽ tách ra khỏi nhau ở dạng các vết màu khi được nhuộm màu bằng thuốc thử thích hợp : +Đối với dịch thủy phân bằng acid nhuộm màu bằng thuốc thử Ninhydrin. +Đối với dịch thủy phân bằng basơ ( chứa tryptophan) nhuộm màu bằng thuốc thử Eclich. -Định lượng các acid amine:sau khi được nhuộm màu bằng thuốc thử thích hợp ,dùng bút chì khoanh tròn những vòng tròn diện tích bằng nhau quanh vết màu chất cần xác định và chất chuẩn (chấm trên cùng một giấy sắc kí và cùng một điều kiện chạy sắc kí );đồng thời khoanh 1 hoặc 2 vòng trên khoảnh giấy trắng (không có vết màu )để làm mẫu trắng .Sau đó