Các phương pháp phát hiện EColi trong thực phẩm

Trường Đại Học Kỹ Thuật – Công Nghệ TP.HCM Khoa Công Nghê Thực Phẩm ›©š Đề tài: -Tp.HCM tháng 11/2011- Mục lục Chương 1 : Tổng quan 4 I. Sơ lược về vi khuẩn E.coli 4 1. Đặc điểm sinh học 4 1.1 Hình thái 4 1.2 Tính chất nuôi cấy 4 1.3 Tính chất hóa sinh 5 1.4 Kháng nguyên 6 1.5 Phân loại 6 2. Khả năng gây bệnh 7 3. Chẩn đoán vi sinh vật 12 3.1 Chẩn đoán trực tiếp 12 3.2 Chẩn đoán gián tiếp 12 4. Nguyên tắc điều trị và phòng bệnh 13 4.1 Điều trị 13 4.2 Phòng bệnh 13 Chương II : Các phương pháp phát hiện E.coli 14 I. Phương pháp truyền thống 14 1. Định lượng E.coli bằng phương pháp MPN 14 1.1 Nguyên tắc 14 1.2 Quy trình phân tích 14 1.3 Cách đọc kết quả 15 2. Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 15 2.1 Nguyên tắc 15 2.2 Môi trường và hóa chất 15 2.3 Quy hoạch phân tích 16 2.4 Cách tính kết quả 16 3. Phương pháp làm giàu vi khuẩn 17 3.1 Nguyên lý 17 3.2 Thiết bị và đồ thủy tinh 17 3.3 Môi trường và thuốc thử 17 3.4 Cách làm 17 II. Phương pháp hiện đại 22 1. Phương pháp PCR 22 1.1 Nguyên tắc 22 1.2 Môi trường tăng sinh 22 1.3 Môi trường phân lập 22 1.4 Trích ly DNA 22 1.5 Qui trình multiplex-PCR 24 1.6 Ưu và nhược điểm của phương pháp PCR 24 2. Phương pháp ELISA 25 2.1 Nguyên tắc 25 2.2 Các phương pháp ELISA 26 2.3 Phát hiện E.coli O157:H7 bằng phương pháp Elisa 29 2.4 Ứng dụng của kháng thể đơn dòng trong xác định E.coli O157:H7 30 2.5 Ưu điểm của phương pháp E.lisa 30 3. Phát hiện E.coli bằng phức hợp kháng thể + hạt nano silica phát quang 30 Kết Luận 34 Phụ Lục 35 Tài liệu tham khảo 47 Chương I: TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI SƠ LƯỢC VỀ VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI (E.COLI) Escherichia coli do Theodore Escherich (1857-1911), một nhà vi khuẩn học người Áo, phát hiện lần đầu tiên năm 1885. Chi Escherichia thuộc họ vi khuẩn đường ruột. Trong các loài thuộc chi này, E.coli được chọn làm điển hình và có vai trò quan trọng nhất trong y học. Hình 1.1: Hình chụp vi khuẩn E.coli dưới kính hiển vi với kích thước 2 µm E.coli là một trong những thành viên chính của hệ vi khuẩn bình thường ở ruột nhưng cũng là căn nguyên của nhiều bệnh nhiễm trùng, trong đó có những bệnh nó là căn nguyên đứng đầu. E.coli đã được sử dụng làm mô hình nghiên cứu về sinh học phân tử trong lĩnh vực vi sinh học nói riêng và sinh học nói chung. E.coli K12 là vi khuẩn được sử dụng làm mô hình nghiên cứu nhiều nhất. nhiều thành tựu về di truyền học, hóa sinh học đã được thu trên cơ sở nghiên cứu vi khuẩn này. Ngày nay E.coli cũng được sử dụng nhiều trong công nghệ sinh học. Mặc dù E.coli là loài vi khuẩn được nghiên cứu sâu nhất, cho đến nay nó vẫn tiếp tục được quan tâm nghiên cứu, với rất nhiều phát hiện mới ở tầm phân tử, đặc biệt cơ chế bệnh sinh của các type gây bệnh (pathotype). Đặc điểm sinh học 1.1 Hình thái E.coli là trực khuẩn Gram âm. Kích thước trung bình từ 2 đến 3µm x 0,5µm; trong những điều kiện không thích hợp (ví dụ như trong môi trường có kháng sinh) vi khuẩn có thể rất dài như sợi chỉ. Rất ít chủng E.coli có vỏ, nhưng hầu hết có lông và có khả năng di động. 1.2. Tính chất nuôi cấy E.coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường. Một số có thể phát triển trên môi trường tổng hợp rất nghèo chất dinh dưỡng. Hiếu kỵ khí tùy ý. Có thể phát triển ở nhiệt độ từ 5-400C. Nhiệt độ thích hợp xung quanh 370C. Trong điều kiện thích hợp E.coli phát triển rất nhanh, thời gian thế hệ chỉ khoảng 20 đến 30 phút. Cấy vào môi trường lỏng (như canh thang) sau 3 đến 4 giờ đã làm đục nhẹ môi trường, sau 24 giờ làm đục đều; sau hai ngày trên mặt môi trường có váng mỏng. Những ngày sau, dưới đáy ống có thể thấy lắng cặn. E.coli không mọc trên canh thang Selenit. Trên môi trường thạch thường, sau khoảng 8 đến 10 giờ, dung kính lúp đã có thể quan sát được khuẩn lạc. Sau 24 giờ khuẩn lạc có kích thước khoảng 1,5mm. Hình thái khuẩn lạc điển hình dạng S, nhưng có thể gặp dạng R, hoặc M. Trên môi trường phân lập, tùy theo chất chỉ thị màu, E.coli có khuẩn lạc màu vàng (như trên thạch lactose) hoặc màu đỏ (như trên thạch MacConkey). Không mọc được trên môi trường SS. Một số loại E.coli có tính chất nuôi cấy riêng có giá trị trong sàng lọc nhanh, như EAEC tạo thành váng đặc trường khi nuôi cấy trên canh thang Muller-Hinton. 1.3. Tính chất hóa sinh E.coli có khả năng lên men nhiều loại đường và có sinh hơi. Hầu hết E.coli đều lên men lactose và sinh hơi, trừ E.coli trơ (inactive) (trong đó có EIEC) không hoặc lên men rất chậm. Một số chi khác trong họ vi khuẩn đường ruột cũng có khả năng lên men nhanh lactose (như Klebsiella, Enterobacter, Serratia và Citrobacter) được gộp vào một nhóm vi khuẩn có tên chung là coliform. E.coli có khả năng sinh indole. Không sinh H2S. Không sử dụng được nguồn carbon của citrate trong môi trường Simmons. Có decarboxylase, vì vậy có khả năng khử carboxyl của lysine, ornithin, arginin và acid glutamic. Betagalactosidase dương tính. Thử nghiệm VP (Voges Proskauer) sau 24 giờ âm tính, sau 48 giờ có thể dương tính. Bảng 1.1: Tính chất hóa sinh của một số loài thuộc chi Escherichia Thử nghiệm Các loài E.coli (bình thường) E.coli (inactive) E.blattae E.fergusonii E.hermannii E.vulneris E.albertii CNPG + T - T + + - Indole + T - + + - - Đỏ methyl + + + + + + ? Voges-Proskauer - - - - - - - Citrate (Simmons) - - T T - - - Lysine decarboxylase T T + + - T + Arginine dihydrolase T - - - - T - Ornithine decarboxylase T T + + + - + Di động + - - + + + - D-Glucose acid + + + + + + + D-Glucose sinh hơi + - + + + + + Lactose + T - - T T - Sucrose T T - - T - - D-Mannitol + + - + + + + Adonitol - - - + - - - Cellobiose - - - + + + - D-Sorbitol + T - - - - - D-Arabitol - - - - - - - L-Ramnose T T + + + + + Sinh sắc tố vàng - - - - + T - ONPG: Ortho-nitrophenyl-beta-Dgalactopyranoside +: >90% dương tính -: < 10% dương tính. T: 10-90% dương tính 1.4. Kháng nguyên Kháng nguyên O: người ta đã biết tới gần 160 yếu tố kháng nguyên O của E.coli. Kháng nguyên K: Khoảng 100 yếu tố kháng nguyên K đã được xác định và được chia thành ba loại: A, B và L, trong đó A dưới dạng vỏ quan sát được bằng kính hiển vi quang học thông thường, B và L dưới dạng màng rất mỏng chỉ có thể quan sát được nhờ kính hiển vi điện tử. Kháng nguyên H: hơn 50 yếu tố kháng nguyên H đã được xác định. 1.5 Phân loại Dựa vào cấu trúc kháng nguyên, E.coli được chia thành các type huyết thanh. Với sự tổ hợp của các yếu tố kháng nguyên O, K và H sẽ có rất nhiều type huyết thanh khác nhau. Mỗi type huyết thanh được ký hiệu bằng kháng nguyên O và K, ví dụ O86B7 (yếu tố kháng nguyên O số 86, yếu tố kháng nguyên K số 7 loại B). Dựa vào vị trí gây bệnh các E.coli có khả năng gây bệnh ở người được chia thành 2 nhóm: thứ nhất là nhóm gây bệnh đường ruột (IPEC-intestinal pathogenic E.coli) hay E.coli gây tiên chảy (DEC-Dierrheagenic E.coli), thứ hai là nhóm gây bệnh ngoài đường ruột (ExPEC-extraintestinal pathogenic E.coli). Các loại E.coli gây bệnh đường ruột (IPEC) đã được biết gồm: EPEC (Enteropathogenic E.coli): E.coli gây bệnh đường ruột ETEC (Enterotoxigenic E.coli): E.coli sinh độc tố ruột EIEC (Enteroinvasive E.coli): E.coli xâm nhập ruột EAEC (Enteroaggregative E.coli): E.coli ngưng tập ruột DAEC (Diffusely adherent E.coli): E.coli bám dính phân tán EHEC (Enterohaemorrhagic E.coli): E.coli gây xuất huyết ruột Hai loại E.coli gây bệnh ngoài đường ruột quan trọng nhất là: MAEC (Meningitidis-associated E.coli): E.coli gây viêm màng não UPEC (Uropathogenic E.coli): E.coli gây nhiễm khuẩn đường tiết niệu Khả năng gây bệnh E.coli là thành viên thuộc nhóm vi hệ bình thường của đường tiêu hóa, chiếm tỷ lệ cao nhất trong số các vi khuẩn hiếu khí (khoảng 80%). Tuy nhiên, E.coli cũng là 1 vi khuẩn gây bệnh quan trọng, nó đứng đầu trong các vi khuẩn gây tiêu chảy, viêm đường tiết niệu, viêm đường mật; đứng hàng đầu trong các căn nguyên gây nhiễm khuẩn huyết. E.coli là căn nguyên thường gặp trong viêm màng não, viêm phổi ở trẻ mới sinh. E.coli còn gặp trong nhiễm trùng ngoại khoa, nhiễm trùng trong bỏng. Theo báo cáo của chương trình quốc gia giám sát tính kháng thuốc của các vi khuẩn gây bệnh thường gặp (1988-1994) thì E.coli đứng thứ hai (sau S.aureus) về tỷ lệ phân lập được (tính chung tất cả các loại bệnh phẩm) ở nước ta. Những type huyết thanh có khả năng gây bệnh thường gặp trên lâm sàng là: O111B4, O86B7, O126B16, O55B5, O119B4, O127B8, O26B6, O25B15, O128B12. Cơ chế gây bệnh của E.coli khác nhau tùy loại: Ø ETEC-E.coli sinh độc tố ruột Hai yếu tố động lực quyết định khả năng gây bệnh của ETEC là: khả năng bám dính vào niêm mac ruột và sản xuất độc tố. Khả năng bám dính và cư trú trên tế bào biểu mô ruột non là điều kiện đầu tiên để có thể gây bệnh. Khả năng này có vai trò của kháng nguyên CFA (clonisation factor antigen) đã được mã hóa bởi gen trên plasmid. Quyết định khả năng gây tiêu chảy của ETEC là độc tố ruột. Có hai loại độc tố ruột: loại không chịu nhiệt LT (heat labile toxin) và loại chịu nhiệt ST (heat stable toxin). Một chủng E.coli có thể sinh một trong hai hoặc cả hai độc tố đó. Độc tố ruột LT là ngoại độc tố, gồm hai loại LT I được mã hóa bởi gen trên plasmid và LT II được mã hóa bởi gen trên nhiễm sắc thể. LT I và LT II có cấu trúc và cơ chế tác động giống nhau và giống với độc tố ruột của vi khuẩn tả. Cấu tạo của LT gồm 1 tiểu phần A (active) với phân tử lượng 25.000 Dalton và năm tiển phần B (binding) với phân tử lượng 11.500 Dalton. LT bám vào thụ thể GM1 của tế bào biểu mô ruột non nhờ tiểu phần B. Tiều phần A được đẩy vào tế bào biểu mô hoạt hóa enzyme adenylate cyclase làm tăng AMP vòng (cAMP-cyclic adenosine monophosphate), dẫn đến làm giảm hấp thu Na+, tăng tiết Cl-. Hậu quả của quá trình này là áp lực thẩm thấu trong lòng ruột tăng, nước được kéo từ tế bào ra lòng ruột gây tiêu chảy. Độc tố chịu nhiệt ST có trọng lượng phân tử xấp xỉ 5000 Dalton. ST tác động lên ruột bằng sự hoạt hóa enzyme guanylate cyclase làm tăng GMP vòng (cGMP-cyclic guanosine monophosphate). GMP vòng gây rối loạn chuyển hóa nước và điện giải giống như AMP vòng. ST còn làm mất hoặc làm teo một phần nhung mao của tế bào biểu mô ruột. Người ta đã nói đến ST-I và ST-II. ST-I gồm ST-Ia và ST-Ib. Hầu hết các chủng sản xuất ra ST-Ib phân lập được từ người, còn ST-Ia thì hầu hết từ động vật hoặc các thức ăn có nguồn gốc động vật. Chưa gặp các chủng sinh ST-II gây tiêu chảy ở người. Tiêu chảy do ETEC thường khởi phát đột ngột, phân toàn nước không có nhày, máu. Ø EIEC-Ecoli xâm nhập ruột EIEC gây bệnh chủ yếu do khả năng xâm nhập vào niêm mạc đại tràng. Khả năng xâm nhập được mã hóa bởi gen trên plasmid 140MDa. Các gen trên plasmid này mã hóa cho các kháng nguyên xâm nhập (IpaA đến IpaD, Ipa-Invasion plasmid antigen). EIEC cho kết quả (+) tính trong thử nghiệm khả năng gây viêm kết giác mạc chuột lang (thử nghiệm Sereny). EIEC còn có khả năng sản xuất độc tố ruột giống một số Shigela. Gen mã hóa cho độc tố này có tên là sen (Shigella enterotoxin). Cơ chế gây bệnh giống vi khuẩn lỵ. Vì vậy trong y văn hiện nay viết căn nguyên gây bệnh lỵ trực khuẩn (bacillary dysentery) gồm Shigella và EIEC. EIEC xâm nhập vào trong tế bào biểu mô đại tràng, làm tiêu các túi thực bào và nhân lên trong bào tương, phá hủy tế bào rối mới xâm lấn sang các tế bào khác. Tổn thương nhất chính là viêm loét hoại tử niêm mạc đại tràng. Triệu chứng lâm sàng điển hình là đi ngoài phân ít, có lẫn nhày máu. ØEAEC-E.coli bám dính kết tập ruột EAEC thường gây tiêu chảy kéo dài hoặc mạn tính, nhất là ở trẻ em. Nó cũng là một trong những căn nguyên quan trọng của nhiễm khuẩn đường tiêu hóa ở khách du lịch. Cơ chế bệnh sinh trong tiêu chảy do EAEC vẫn chưa được sáng tỏ hoàn toàn. Những yếu tố động lực chính của EAEC được nói đến gồm các diềm bám dính kết tập AAF (aggregative adhesion fimbriae), Yếu tố điều hòa bám dính kết tập aggR, protein Pet và độc tố EAST-1 (enteroaggregative heat-stable toxin-1). Diềm bám dính kết tập được cho là yếu tố quyết định độc lực. Ba loại AAF đã được nói đến là AAF/I, AAF/II và AFF/III, trong đó loại I và II có cấu trúc bó, loại III có dạng sợi riêng biệt. Các AFF tạo nên kiểu bám dính hình chồng gạch trên tế bào Hep-2. Yếu tố aggR có vai trò điều hòa sự biểu hiện của các AFF. Protein Pet được tiết qua màng ngoài vi khuẩn, gây tích tụ dịch và gây độc cho biểu mô tiêu hóa. EAST-1 có khả năng phá hủy tế bào biểu mô. Ngoài các yếu tố dộc lực nêu trên EAEC còn tiết ra 1 protein có khả năng làm tan máu và làm mất thăng bằng vận chuyển ion qua màng. Các yếu tố độc lực nêu trên của EAEC phần lớn được mã hóa bởi các gen nằm trên plasmid có phân tử lượng 60 MDa. Một số yếu tố độc lực đực mã hóa bởi các gen trên nhiễm sắc thể đang được nghiên cứu. Khi nuôi cấy trên canh thang Muller-Hinton, EAEC tạo thành váng đặc trưng. Tính chất này được dùng để sàng lọc nhanh các chủng E.coli thuộc loại EAEC. Bảng 1.2: Tóm tắt các đặc điểm liên quan đến khả năng gây bệnh của các E.coli gây bệnh đường ruột Loại E.coli Gen động lực hoặc yếu tố độc lực Cơ chế gây bệnh Đặc điểm lâm sàng EPEC Plasmid 50-70 MDa (EAF): Mã hóa BFP (bundle-forming pilus), Per (plasmid-encoded regulator) và Ler (LEE-encoded regulator. PAI nhiễm sắc thể (LEE) TTSS gồm: intimin (eaeA), các protein tiết; Tir, EspA, EspB, EspD, EspF, EspG và MAP (mitochondria-associated protein) EAST-1 CDT (Cytolethal distending toxin) Bám dính tại chỗ nhờ BFP Tổn thương mô A/E Các tổn thương A/E Tiêu chảy cấp ETEC ETEC Các CFA mã hóa bởi plasmid: CFA-I (fimbriae cứng), CFA-III (tạo bó), CFA-II và CFA-IV (fimbriae mềm) và pili dài liên quan với type IV Độc tố chịu nhiệt LT I và LT II (mã hóa bởi plasmid) Độc tố vững bền với nhiệt STa và STb (mã hóa bởi plasmid và transposon) Bám vào niêm mạc ruột non (CFA I-IV) và sản xuất các độc tố ruột LTI, LTII, STa, STb Hoạt hóa adenylate cyclase- tăng cAMP – giảm hấp thu Na+/tăng tiết Cl- - tiêu chảy Hoạt hóa guanylate cyclase- tăng cGMP – tiết chloride và/hoặc giảm hấp thu NaCl – tiêu chảy Tiêu chảy cấp, phân thường toàn nước không có nhầy máu EIEC Các gen trên plasmid 140 MDa mã hóa các kháng nguyên xâm nhập (invasion plasmid antigen) IPaA – IpaD Vi khuẩn bám và xâm nhập vào biểu mô đại tràng, nhân lên gây viêm loét hoại tử niêm mạc đại tràng Hội chứng lỵ trực khuẩn EAEC Điểm bám dính kết tập AAF (aggregative adhesion fimbriae) Yếu tố điều hòa bám dính kết tập aggr Protein pet Độc tố EAST-1 (enteroaggregative heat-stable toxin-1) Protein làm tan máu và mất thăng bằng vận chuyển ion qua màng AAF tạo nên kiểu bám dính hình chồng gạch aggR điều hòa sự biểu hiện của AAF gây tích tụ dịch và gây độc tố cho biểu mô tiêu hóa EAST-1 phá hủy tế bào biểu mô Protein làm tan máu và làm mất thăng bằng vận chuyển ion qua màng Tiêu chảy kéo dài EHEC/ VTEC Plasmid 60 MDa mã hóa heamolysin, LCT, EspP PAI nhiễm sắc thể Độc tố Shiga (Stx1, Stx2, Stx2v) mã hóa bởi các gen trên nhiễm sắc thể Độc tố Shiga: - Hủy hoại các vi nhung mao hấp thu cả tế bào biểu mô ruột. - ức chế quá trình tổng hợp protein của tế bào biểu mô đại tràng, dẫn đến làm chết tế bào, - gây hội chứng HUS Tiêu chảy ra máu (do xuất huyết đại tràng) DAEC Các yếu tố bám dính Afa/Dr (AIDA) EAST-1 Các geb set (enterotoxin) Có thể có TTSS với esc Afa/Dr gây bám dính phân tán EAST-1 phá hủy tế bào biểu mô Tiêu chảy phân thường không có máu EHEC còn được gọi là E.coli sinh độc tố Shiga. Yếu tố động lực chính của EHEC là độc tố Stx (Shiga toxin) hay độc tố gây độc đối với tế bào Vero VT (veroccytotoxin) vì vậy loại này thuộc nhóm có tên là VTEC – Verocytotoxin E.coli. Hiện nay, có ba loại Stx do EHEC sinh ra đã được xác định là Stx1, Stx2 và Stx2v. Các độc tố này được mã hóa bởi các gen prophage thích hợp trên nhiễm sắc thể. Độc tố Shiga hủy hoại chọn lọc các vi nhung mao hất thu của tế bào biểu mô ruột. Nó cũng xâm nhập vào tế bào biểu mô đại tràng, ức chế quá trình tổng hợp protein dẫn đến làm chết tế bào. Hậu quả là viêm đại tràng xuất huyết, gây tiêu chảy phân như máu. Những trường hợp hoại tử nặng có thể gây thủng ruột. Stx còn có thể gây hội chứng tăng ure huyết tan máu (HUS-haemorrhagic uremic syndrome). Stx vào máu đến thận gây tổn thương tế bào biểu mô tiểu cầu thân, làm hẹp và tắc mao mạch tiểu cầu thận. Hậu quả của quá trình này là mức lọc của thận suy giảm, bệnh nhân bị suy thận cấp. Ø EPEC – E.coli gây bệnh đường ruột EPEC được bắt đầu nghiên cứu rất sớm, từ những năm 1940. EPEC bám dính vào niêm mạc ruột gây tổn thương đặc trưng là sự phá hủy vi nhung mao ở riềm bàn chải của niêm mạc ruột. Loại vi khuẩn này có vai trò rất quan trọng trong viêm dạ dày ruột gây tiêu chảy ở trẻ em. Ø DAEC – E.coli bám dính phân tán DAEC là type gây bệnh được mô tả tương đối gần đây. Nó được xác định là một type gây bệnh riêng vì không có các gen độc lực đặc trưng của các type khác đã được mô tả trước. Khác với E.coli gây bệnh đường ruột (IPEC), các E.coli gây bệnh ngoài đường ruột (ExPEC) là những vi khuẩn gây bệnh cơ hội khi “lạc chỗ”. Chúng có thể là thành viên của hệ vi khuẩn bình thường ở ruột nhưng khi vào máu, vào dịch tủy não, vào đường tiết niệu thì trở nên gây bệnh, nhất là ở những người có cơ chế đề kháng bị suy giảm. Tuy nhiên đã xác định được những gen độc lực của ExPEC thường gặp trong các nhiễm trùng ngoài đường ruột. MAEC có kháng nguyên vỏ có liên quan về mặt hóa học và miễn dịch với polysaccharide nhóm B của Neisseria meningitides. Cho đến nay, hiểu biết về sự nhạy cảm của trẻ sơ sinh với loại E.coli này chưa đầy đủ. Nhiều tác giả cho rằng có sự liên quan chủ yếu đến cơ địa của trẻ. Theo kết quả của nhiều nghiên cứu, tới 80% các trường hợp viêm màng não ở trẻ sơ sinh do E.coli. UPEC là nguyên nhân chủ yếu của nhiễm trùng đường tiết niệu. yếu tố độc lực quan trọng của UPEC là P-pili. Nhờ Pili này, E.coli có thể gắn đặc hiệu vào kháng nguyên P, là một trong các kháng nguyên nhóm máu. Ngoài ra nó coàn có một số yếu tố độc lực khác cũng tham gia vào cơ chế gây bệnh. v\các nhóm huyết thanh hay gặp là O1, O2, O4, O6, O7 và O75. Các chủng có kháng nguyên K1, K2, K3, K5, K12,K13 là hay gặp nhất. những vi khuẩn này thường có các gen mã hóa cho các yếu tố độc lực như yếu tố bám dính, vỏ, các độc tố. Chẩn đoán vi sinh vật 3.1. Chẩn đoán trực tiếp Bệnh phẩm khác nhau tùy bệnh: là phân với nhiễm khuẩn đường tiêu hóa, nước tiểu với nhiễm khuẩn đường tiết niệu, máu nếu là nhiễm khuẩn máu… Qui trình chuẩn đoán trực tiếp E.coli cơ bản gống với qui trình chuẩn đoán các vi khuẩn đường ruột. Có thể làm tiêu bản soi trực tiếp đối với một số loại bệnh phẩm như cặn ly tâm nước tiểu hoặc nước não tủy. Đối với viêm màng não mủ có thể phát hiện kháng nguyên đặc hiệu của vi khuẩn bằng phản ứng ngưng kết latex. Dễ làm, cho kết quả rất nhanh và độ tin cậy rất cao. Nguyên lý của phản ứng này như sau: các hạt latex có gắn kháng thể kháng E.coli gây bệnh được trộn dịch nảo tủy, nếu trong bệnh phẩm có kháng nguyên đặc hiệu của E.coli thì phản ứng sẽ dương tính. Đó là phản ứng ngưng kết thụ động. Phương pháp chuẩn đoán chủ yếu nhất là nuôi cấy phân lập. Bệnh phẩm phân được nuôi cấy trên môi trường phân lập có chất ức chế chọn lọc như DCL, Endo. Nước tiểu giữa dòng được tiến hành cấy đếm trên môi trường đặc, trước đây thường sử dụng thạch thường, hiện nay có môi trường uriselect vừa có giá trị cấy đếm, vừa có khả năng định danh. Tiến hành cấy máu khi nghi có nhiễm khuẩn máu. Sau khi đã phân lập được vi khuẩn thuần nhất thì xác định tính chất sinh vật hóa học và định tên bằng phản ứng ngưng kết trên phiến kính với các kháng huyết thanh mẫu. Để xác định các E.coli sinh độc tố người ta có thể sử dụng nhiều phương pháp khác nhau như phương pháp quai ruột, phương pháp thử nghiệm trên tế bào nuôi, phương pháp đồng ngưng kết, ELISA… Kỹ thuật khuếch đại gen PCR cũng đã được áp dụng trong chẩn đoán E.coli. Ở nước ta hiện nay chủ yếu mới sử dụng PCR trong định danh khi vi khuẩn đã được phân lập thuần nhất. Các k