Các phương pháp tinh sạch enzyme

LỜI MỞ ĐẦU Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, các chế phẩm enzyme được sản xuất càng nhiều và được sử dụng trong hầu hết trong các lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Hàng năm lượng enzyme được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn với giá trị trên 500 triệu USD, được phân phối trong các lĩnh vực khác nhau. . Phần lớn enzyme được sản xuất ở quy mô công nghiệp đều thuộc loại enzyme đơn cấu tử, xúc tác cho phản ứng phân hủy. Khoảng 75% chế phẩm là enzyme thủy phân được sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên .Protease là enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành sản xuất như: chế biến thực phẩm (đông tụ sữa làm pho mát, làm mềm thịt, bổ sung để làm tăng chất lượng sản phẩm trong sản xuất bia, xử lý phế phụ phẩm trong chế biến thực phẩm…), sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da, y tế, nông nghiệp…  Qua nhiều năm, việc gia tăng sử dụng vi sinh vật như là một nguồn cung cấp protease đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm được tạo ra nhiều hơn. Tuy nhiên giá thành chế phẩm protease còn khá cao, do đó cũng hạn chế việc sử dụng rộng rãi enzyme trong sản xuất. Các chế phẩm thu được sau quá trình nuôi cấy sản xuất enzyme chưa phải là chế phẩm có độ tinh khiết cao vì protein chỉ chiếm 20-30% .Vì vậy, việc nghiên cứu cải tiến phương pháp tách và tinh chế enzyme nhằm thu được chế phẩm có độ tinh khiết cao rất cần thiết. Để tách và tinh chế enzyme nói riêng và protein nói chung thường có một loạt phương pháp hóa-lý và hóa học khác nhau. Có thể chia làm năm nhóm phương pháp sau: - Phương pháp biến tính chọn lọc- Phương pháp kết tủa phân đọan- Phương pháp hấp thụ chọn lọc- Phương pháp sắc ký - Phương pháp tách hệ hai pha nước Cho đến nay không có phương pháp tách và làm sạch chung cho các enzyme. Để xây dựng phương pháp tách và làm sạch một enzyme nào dó cần biết lựa chọn và phối hợp một cách có hiệu quả nhất các biện pháp tách và làm sạch khác nhau. PHẦN I: TỔNG QUAN I/Khái niệm enzyme - Enzyme là những protein có khả năng xúc tác cho các phản ứng hoá học với mức độ đặc hiệu khác nhau ở nhiệt độ tương đối thấp. - Enzyme có trong tất cả các tế bào sống, là các chất xúc tác sinh học. - Enzyme có đầy đủ các tính chất của chất xúc tác, nhưng enzyme có hiệu suất xúc tác lớn hơn tất cả các chất xúc tác hữu cơ và vô cơ khác.Enzyme không những có thể xúc tác cho các phản ứng xảy ra trong cơ thể sống, mà sau khi tách khỏi hệ thống sống, ở những điều kiện nhất định chúng vẫn giữ được hoạt tính xúc tác. Như vậy,có thể nói một cách khái quát, enzyme là những phân tử lớn tồn tại trong tự nhiên, hay được tổng hợp có khả năng xúc tác cho một hay nhiều phản ứng với mức độ đặc hiệu khác nhau ở nhiệt độ và áp suất bình thường. II/Những tiêu chuẩn tinh sạch của enzyme Để xác định xem protein được chiết tách ra có phải là enzyme tinh khiết không hay còn chứa những tạp chất protein không họat động, người ta sử dụng một số phương pháp chủ yếu dựa trên việc nghiên cứu những tính chất vật lý của protein. Làm lắng (kết tủa) dung dịch protein trong phần quay phân tích của máy siêu ly tâm: phát hiện một đỉnh của protein thì đó là protein thuần nhất. Tuy nhiên một số protein tuy khác nhau nhưng có cùng trọng lượng phân tử và có hình dạng tiểu phân ( hoặc có khi có sự bù phụ của các ảnh hưởng của khối lượng và hình dạng) thì có hằng số lắng trùng nhau. Vì thế khi siêu ly tâm, chúng có thể lắng với tốc độ như nhau và cho một đỉnh chung. Điện li ( phương pháp ranh giới di động): phương pháp này rất hiệu quả. Tuy nhiên khó mà phân biệt được những protein giống nhau về trị số di động điện li. Dung dịch enzyme khi được điện li khu vực trong jela tinh bột hoặc thạch chỉ ra một đỉnh cân đối thì đó là dấu hiệu của enzyme thuần nhất. Thế nhưng khi hàm lượng những protein tạp nhỏ(<=1%) thì khó phát hiện ra đúng. Xác định họat độ riêng, mật độ quang học riêng trong những đỉnh quang phổ đặc trưng cùng hàm lượng các nhóm ngọai đặc hiệu. Biện pháp khá nhạy cảm để xác định mức độ thuần nhất của enzyme ( cũng như protein khác) là kết hợp sự phân tích điện li và những phản ứng miễn dịch hóa học đặc hiệu, đặc biệt điện di trên thạch theo grabar. Biện pháp nghiên cứu có triển vọng nhưng tương đối ít nhạy về độ thuần nhất của protein là sự xác định độ hòa tan của nó theo norchrop. Thường để xét độ thuần nhất của enzyme, người ta dựa trên sự so sánh những kết quả thu được từ một vài phương pháp khác nhau. Đặc biệt, những chế phẩm enzyme càng tinh khiết thì càng dễ hỏng và khi bảo quản trong các dung dịch ở 40C đều nhanh chóng mất hoạt tính. Vì thế, khi tái kết tinh enzyme lặp lại ta thường thấy có sự giảm hoạt độ riêng vì các tinh thể đã bị ô nhiễm bởi phần enzyme bị ức chế. PHẦN II TÁCH CHIẾT& TINH SẠCH ENZYME I. Các điều cần lưu ý khi tách chiết và tinh sạch enzyme Có 3 khó khăn trong khi tách enzyme khỏi tế bào cần phải hết sức lưu ý. - Enzyme có trong tế bào sinh vật với lượng không lớn so với các thành phần khác. - Enzyme là chất hữu cơ không bền, chúng rất dễ bị biến tính khi bị tác động của các yếu tố bên ngoài. - Enzyme là prôtêin. Prôtêin enzyme luôn luôn đi cùng những loại prôtêin không phải enzyme nhưng lại có tính chất lý hoá rất giống prôtêin enzyme. Do đó, rất dễ mất hoạt tính sinh học khi bị tách ra khỏi tế bào và cơ thề.Việc mất hoạt tính có thể do nhiệt độ cao, sự thuỷ phân bởi các enzyme proteolytic, tác dụng của pH thấp, các chất oxy hoá hay chất khử, các chất gây biến tính,các chất ức chế bất thuận nghịch…Tuy nhiên, các enzyme khác nhau có thể nhạy cảm với những tác nhân nêu trên ở các mức độ rất khác nhau. Trong sản xuất chế phẩm enzyme thì việc giữ được hoạt tính của enzyme là một trong những yêu cầu hàng đầu.Thông thường qua mỗi bước tinh sạch thì một phần enzyme cũng như hoạt động của chế phẩmbị mất đi, giá thành cao lên do chiphí về thiết bị, nguyên liệu, công sức và do mất hoạt độ. Với enzyme dùng trong mục đích công nghiệp, không phải lúc nào cũng cần phế phẩm có độ tinh sạch cao,trong một số trường hợp có thể dùng phế phẩm enzyme ở dạng thô. Để hạn chế tối đa sự giảm hoạt độ enzyme trong quá trình tinh sạch thì thường cần chọn dung dịch chiết rút enzyme thích hợp, vừa cho hiệu suất chiết suất enzyme cao, vừa không làm biến tính enzyme. Các bước tinh sạch thường được tiến hành ở nhiệt độ thấp ( khoảng 40C hoặc thấp hơn, tuỳ yếu tố gây kết tủa) để vừa hạn chế sự biện tính enzyme cũng như tác dụng phân giải của các enzyme proteolytic có mặt trong dịch chiết.Đối với nhiều enzyme,có thể bổ sung các chất ức chế của enzyme proteolytic vào dịch chiết để hạn chế sự thuỷ phân đối với các enzyme quan tâm. Các enzyme proteolytic được phân thành 4 lớp là: + protease serine + protease cystein + protease axit + protease chứa kim loại. Trên cơ sở của 4 lớp protease này, nhười ta cũng cha các chất ức chế của các enzyme này theo 4 lớp tưong ứng. Tuy vậy, do sự phổ biến của 2 loại protease serine và protease cystein, nên việc bổ sung vào dịch chiết protein enzyme các chất ức chế của hai loại protease này là phổ biến. Trong một số trường hợp, đối với các enzyme nhạy cảm với các phân cắt proteolytic, thì cả 4 loại chất ức chế đều được sử dụng. Bổ sung các yếu tố làm bền ( như CaCl2, hay MgCl2 ở nồng độ 2-5mM, glycerol 10-20%...) chất chống oxy hoá, xây dựng quy trình tinh sạch đơn giản ít bước nhất cũng là những cách để hạn chế sự giảm hoạt động của enzyme. Đối với một số enzyme bền nhiệt thì có thể dùng bước xử lý nhiệt ( 70-800C, trong vòng 15-30 phút) ở ngay giai doạn đầu để vừa hạn chế tác dụng phân cắt proteolytic, vừa loại bỏ một số protein không monh muốn khác. Tương tự có thể dùng bước xử lý axit 9 đưa pH xuống 3-4) ở giai đoạn đầu đối với các enzyme bền ở pH thấp. III. Thu nhận chế phẩm enzyme thô Ngoài trừ một số trường hợp enzyme quan tâm là enzyme ngoại bào từ vi sinh vật ( enzyme được tiết vào môi trường trong quá trình nuôi cấy tế bào) và các enzyme ngoại bào từ các dịch của động vật và thực vật, các trường hợp còn lại, bước đầu tiên trong nghiên cứu enzyme là phải thu nhận dịch chiết enzyme từ nguyên liệu.Để thu dịch chiết mô hoặc tế bào chứa enzyme, trước hết phải phá vỡ tế bào. Để thu nhận enzyme nội bào, người ta phải phá vỡ tế bào bằng nhiều phương pháp.Các phương pháp phá vỡ tế bào thường được sử dụng để phá vỡ tế bào như: + Phương pháp cơ học. Nghiền bi, nghiền có chất trợ nghiền như bột thuỷ tinh, cát thạch anh, đồng hoá bằng thiết bị đồng hoá… + Phương pháp vật lý như dùng sóng siêu âm … + Phương pháp hoá học như dùng các loại dung môi, butylic, aceton, glycerol, ethylacetate. Sau khi phá vỡ tế bào, người ta thường sử dụng nước, dung dịch đệm, dung dịch muối trung tính để tách enzyme ra khỏi sinh khối đã xử lý theo những phương pháp trên. Dịch chiết thu được,người ta gọi là chế phẩm enzyme thô. Sở dĩ gọi là chế phẩm enzyme thô vì trong chế phẩm này,ngoài enzyme ra còn có nước, protein không phải enzyme các thành phần của tế bào. Chế phẩm thu được ở các bước ban đầu này thường chứa rất nhiều protein và các hợp chất không mong muốn, nồng độ enzyme quan tâm thấp. Dịch chiết có thể được cô đặc ở nhiệt độ thấp để làm tăng nồng độ enzyme, hoặc được bổ sung tác nhân gây kết tủa protein enzyme để loại bỏ một số chất không mong muốn, sau đó hoà tan enzyme trong một thể tích nhỏ dung dịch đệm thích hợp. Để kết tủa protein cho mục đích tinh sạch, người ta thường dùng dung môi hữu cơ như ethanol hay aceton hoặc muối trung tính. Các dung môi hữu cơ khi thêm vào dung dịch nước sẽ làm giảm hằng số điện môi của dung dịch, do đó làm thay đổi tính tan của protein và dẫn đến làm kết tủa protein. Nồng độ của các dung môi gây kết tủa protein thường từ 80% (V/V) trở lên. Sự kết tủa có thể có tính chọn lọcmột phần, nghĩa là các protein khác nhau có thể được kết tủa bằng các nồng độ khác nhau của dung môi. Dung môi hữu cơ sau đó có thể được loại bằng cách cho bay hoi trong chân không, hay thậm chí trong hkông khí. Để kết tủa enzyme từ dịch chiết thô, người ta cũng có thể dùng một số muối trung tính, thường dùng nhất là ammonium sulfatese, do muối này có mức độ hoà tan rất cao trong nước, ít làm mất hoạt tính enzyme, thậm chí còn có tác dụng làm bền enzyme. Một số ưư điểm nữa của muối ammonium sulfate là khả năng kết tủa chọn lọc protein, do đó sẽ loại bỏ được nhiều protein không mong muốn trong dịch chiết. Lưu ý khi sử dụng muối ammonium sulfate là phải bổ sung vào dung dịch enzyme một cách từ từ, kết hợp khuấy đều để tránh khả năng tăng quá nhanh cục bộ của nồng độ muối, làm mất di tính kết tủa chọn lọc của nó, thậm chí có thể làm biến tính một số enzyme kém bền. Hạn chế của phương pháp sử dụng ammonium sulfate chính là mất nhiều thời gian, do nồng độ ammonium sulfate cao nên tỷ trọng của dung môi lớn, để kết tủa được các protein cần phải ly tâm ở tốc độ cao và nhiệt độ thấp, sau đó cần loại muối khỏi chế phẩm khi chuyển sang bước tinh sạch tiếp theo. IV/Các phương pháp tách chiết và tinh sạch enzyme *Khái niệm Việc làm sạch enzyme chính là việc loại protêin không phải là enzyme, nước,các thành phần khác của tế bào khỏi enzyme. Công vịêc này hoàn toàn không dễ dàng. Do đó, việc làm sạch enzyme đòi hỏi người làm nghiên cứu về enzyme, ngoài sự hiểu biết về enzyme ra còn phải nắm vững rất nhiều thao tác kỹ thuật khác nhau để tránh gây mất tính hoạt động của enzyme. Trong dịch chiết, ngoài enzyme còn chứa các protein tạp và nhiều chất khác, để loại bỏ chúng phải sử dụng phối hợp nhiều biện pháp khác nhau. Để loại bỏ muối và các tạp chất có phân tử lượng thấp thường dùng các biện pháp thẩm tích đối với nước hay đối với các dung dịch đệm loãng hoặc bằng cách lọc qua gel sephadex. Để loại bỏ các protein tạp và các tạp chất có phân tử lượng cao khác, thường dùng kết hợp nhiều biện pháp khác nhau: phương pháp biện tính chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc pH của môi trường, phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ, các hpương pháp sắc ký( sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion),điện di, phương pháp lọc gel. 1/Phương pháp biến tính chọn lọc Phương pháp này dựa trên sự tác động của nhiệt độ, pH làm biến tính các loại protein tạp. Phương pháp này chỉ thích hợp với enzyme chịu axít và bền nhiệt.Người ta đưa nhiệt độ của dung dịch enzyme lên 50-700C và pH <=5.Ở điều kiện này những enzyme không bền nhiệt và không chịu được pH thấp sẽ bị biến tính.Sau đó, bằng phương pháp ly tâm hoặc phương pháp lọc để loại bỏ các thành phần không phải là enzyme mà ta mong muốn. 2/Phương pháp kết tủa phân đọan Phương pháp kết tủa phân đoạn bằng (NH4)2 SO4 dựa trên cơ sở sự khác nhau về khả năng kết tủa của các protein enzyme ở một nồng độ muối (tính theo phần % nồng độ bão hòa) xác định được dùng phổ biến để loại bỏ bước đầu protein tạp của các dịch enzyme. Các loại muối có thể được dùng là (NH4)2 SO4, Na2 SO4, MgSO4 ... người ta đã nhận thấy muối (NH4)2 SO4 là tốt nhất vì nó không làm hại mà làm ổn định (làm bền) hầu hết các loại enzyme. Loại muối này lại rẻ và phổ biến. Độ hòa tan của nó lại rất lớn (bão hòa 767g/l ở 250C). Phương pháp này chỉ dùng vói những enzyme ít bị biến tính bởi các dung môi được chọn dùng. Để giữ cho enzyme khỏi bị mất khả năng hoạt động, quá trình kết tủa phải được thực hiện ở nhiệt độ thấp (-50C). 3/Phương pháp hấp phụ chọn lọc Người ta có thể cho chất hấp phụ trực tiếp vào dung dịch enzyme, hoặc cho dung dịch enzyme chảy qua một cột, trong cột có chứa chất hấp phụ. Chất hấp thụ được sử dụng rộng rãi là hyđrocyapatite. Người ta có thể thực hiện một trong hai cách sau: hoặc là hấp phụ enzyme hoặc là hấp phụ protein tạp. Để tránh làm biến tính enzyme, người ta thường thực hiện quá trình hấp phụ ở nhiệt độ 00C.Sau khi hấp phụ, người ta lại tiến hành chiết enzyme (quá trình phản hấp phụ) bằng các dung môi thích hợp. 4/Phương pháp sắc ký * Phương pháp sắc ký trao đổi ion Dựa trên cơ sở của phản ứng trao đổi ion giữa protein tan trong nước hoặc dung dịch đệm loãng và tác nhân trao đổi ion, người ta áp dụng phương pháp sắc ký trao đổi ion để làm sạch enzym. Người ta thường sử dụng các tác nhân trao đổi ion sau: Nhựa trao đổi ion Dẫn xuất ester của cellulose như carboxymethyl-cellulose, diethylamino-ethyl-cellulose (DEAE-cellulose), triethylamino-ethyl-cellulose. Người ta thường sử dụng dietylaminoetylxelluloza (DEAE-cellulose) hơn cả. Ưu điểm của DEAE-cellulose là với dịch chiết thích hợp ngoài tạp chất protein còn có khả năng loại bỏ các tạp chất axit nucleic.Điều đó cho phép không cần dùng đến các biện pháp nhằm loại bỏ axit nucleic khó và phức tạp như kết tủa protamin hoặc streptomixin sunfat thường được dùng trước đây. Sephadex là dẫn xuất của polysaccharide dextran.Trong chất này, các phân tử của chúng thường liên kết vói nhau bởi các liên kết ngang nhờ tác dụng của epiclohydrin, tao thành “sàng phân tử”. Số lượng liên kết ngang tạo thành càng nhiều, kích thước của lỗ sàng phân tử càng nhỏ.Khi tiến hành lọc, các chất phân tử có khích thước nhỏ sẽ khuếch tán vào bên trong các hạt sephadex đã được ngâm trong dung dịch đệm, còn các phân tử có kích thước lớn hơn không có khả năng đi vào các hạt sẽ được chiết nhanh ra khỏi cột. Vậy cơ sở của phương pháp lọc gel sephadex dựa vào sự khác nhau về kích thước, hình dáng và phân tử lượng của các chất có trong hỗn hợp.Phương pháp này được áp dụng rộng rãi trong kỹ thuật enzyme. * Phương pháp sắc ký cột Dịch chiết enzyme đã được loại bỏ phần lớn các protein tạp nhưng vẫn chưa đảm bảo độ đồng nhất cần thiết. Do đó dịch chiết enzyme được tiếp tục làm sạch bằng phương pháp sắc ký cột.  Phương pháp dùng chất rây phân tử (lọc gel - gel filtration). Để đảm bảo cho việc tách enzyme được tốt, chất rây phân tử phải là chất trơ, không phản ứng với protein enzyme. Chất này cũng không hòa tan và tương đối bền với các yếu tố về cơ học cũng như sinh học. Ngoài ra chất được sử dụng cho mục đích lọc phân tử phải là chất không có tính đàn hồi (không co) và phải là chất ưa nước (hydrophyl). 5/Phương pháp tách hệ hai pha nước.  Cơ sở kỹ thuật này dựa vào sự phân bố khác nhau của hỗn hợp trong dung dịch hai pha không hòa tan vào nhau. Các hệ hai pha đặc trưng bằng cách trộn các hệ dung môi vào nhau để tạo thành hai pha riêng biệt. Hệ dung môi được sử dụng trong phương pháp này có thể là polymer/polymer như: polyethylene glycol (PEG) và dextran hoặc polymer/muối như PEG và potassium phosphate, sodium sulphate, sodium phosphate,... Các protein và mảnh vỡ tế bào có khả năng hòa tan khác nhau giữa hai pha, vì vậy phương pháp này có thể được dùng cho cả hai trường hợp: phân tách protein khỏi mảnh vỡ tế bào và phân chia các enzyme trong suốt quá trình tinh sạch protein. Hệ hai pha nước được xem là phương pháp tốt cho việc phân tách và tinh sạch các hỗn hợp, vì phân tách chất lỏng có mật độ khác nhau dễ dàng hơn phân tách các chất rắn ra khỏi các chất lỏng. So với các phương pháp tinh sạch khác thì hệ hai pha nước có một số ưu điểm hơn như: có độ hòa tan trong nước của hai pha lớn (70-80%), đạt độ tinh sạch cao, hiệu suất cao, dễ dàng sử dụng ở quy mô lớn và đặc biệt polymer được tái sử dụng. Sự phân tách đạt hiệu quả cao tùy thuộc vào các thông số như khối lượng phân tử và điện tích của đối tượng nghiên cứu, nồng độ và khối lượng phân tử của các polymer, nhiệt độ, pH, thời gian, lực ion của hỗn hợp và sự hiện diện của các loại muối đa hóa trị như phosphaste hoặc sulphate... 6/ Ngoài ra còn có các phương pháp :- Phương pháp dùng chất hấp phụ đặc hiệu sinh học - Phương pháp sắc ký ái lực (affinity chromatography) Hiện nay, chưa có một phương pháp chuẩn nào thật sự có hiệu quả trong việc làm sạch enzyme.Do đó, việc làm sạch chỉ thật sự có hiệu quả khi ta biết lựa chọn các phương pháp riêng,kết hợp với nhau, tạo ra hệ thống phương pháp nối tiếp với nhau một cách hài hòa nhất. V/Quy trình sản xuất 1/Từ nguồn thực vật a.Enzyme bromel Bromelin là tên gọi chung cho nhóm enzyme thực vật chứa nhóm sulfhydryl, có khả năng phân giải protein được thu nhận từ họ bromeliaceae, đặc biệt là ở cây dứa (thân và trái). Enzyme bromelin có thể thu được từ trong thân, trong phần thịt quả và trong chồi quả. Tùy theo nguồn thu nhận mà người ta phân biệt bromelin thân hay bromelin quả và bromelin thân là nhóm có giá trị kinh tế. Ở mỗi bộ phận khác nhau trên cây dứa, bromelin có pH tối ưu khác nhau và có cấu tạo khác nhau. Bromelin chiếm 50% protein trong quả dứa. Nó có khả năng thủy phân khá mạnh và hoạt động tốt ở pH từ 6-8. Bromelin có hoạt tính xúc tác sự phân giải protein tương tự như papain trong mủ đu đủ hay ficin trong cây thuộc họ Sung. Enzyme bromelin có trọng lượng phân tử khoảng 33.000 DA, lớn gấp 1,5 lần so với papain. Thịt quả dứa chỉ có hoạt tính enzyme bromelin khoảng từ 3 tháng trước khi chín, trong đó hoạt tính bromelin cao nhất là khoảng 20 ngày tước khi chín. Khi trái chín, hoạt tính bromelin giảm xuống nhưng không mất hẳn. Bromelin còn có thể thu được từ trong thân dứa(trung bình có thể thu được 3,6 kg bromelin từ 378l nước rút ra từ thân cây dứa. Việc thu nhận và tinh sạch bromelin có thể thực hiện theo sơ đồ sau: Dịch ly tâm Quả/thân/chồi dứa Xay nhuyễn, lọc Dịch lọc Ly tâm Bã Kết tủa Sản phẩm enzym tinh khiết Chế phẩm brommelin Sấy khô Tinh sạch Thu dịch enzyme thô Quả dứa hoặc thân được xoay nhuyễn, vắt kỹ, lọc bỏ bã và thu dịch lọc, ly tâm dịch lọc với tốc độ 6.000 vòng/phút trong 10 phút để lọai bỏ chát xơ sẽ thu được dịch chiết có chứa bromelin. Các phương pháp tách bromelin * Phương pháp kết tủa enzyme Đối với enzyme protein cũng như các protein enzyme khác, để có thể thu được enzyme, điều cần thiết là phải phá vỡ lớp nước liên kết xung quanh phân tử này bằng cách bổ sung vào dung dịch protein enzyme các dung môi hoặc các hoá chất ưa nước có ái lực với nước mạnh hơn protein để lôi kéo nước ra khỏi phân tử protein đó, giúp cho protein kết tủa xuống. Các dung môi thường được sử dụng để kết tủa bromelin là acetone và ethanol, còn các hóa chất khác như các muối trung tính ở nồng độ cao cũng có thể kết tủa được enzyme. Heinicker và Gortner đã dùng acetone để kết t