Chẩn đoán bệnh newcastle bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LỚP DH06SH Bài Tiểu Luận: CHẨN ĐOÁN BỆNH NEWCASTLE BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO GVHD: PGS.TS. NGUYỄN NGỌC HẢI SVTH: TRẦN THỊ THANH PHẤN MSSV: 06126110 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 10/2009 Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 2 MỤC LỤC I. ĐẶT VẤN ĐỀ .........................................................................................................4 II. TỔNG QUAN......................................................................................................5 1 Bệnh Newcastle ......................................................................................................5 1.1 Khái quát về bệnh Newcastle ....................................................................................5 1.2 Virus gây bệnh...........................................................................................................6 1.2.1 Hệ thống phân loại..................................................................................................6 1.2.2 Đặc điểm hình thái và lý hóa của virus ..................................................................7 1.2.3. Các đặc tính sinh học.............................................................................................8 1.3 Đặc điểm dịch tễ học của bệnh Newcastle ............................................................12 1.3.1 Phân bố và diễn biến của bệnh ............................................................................12 1.3.2 Vật chủ.................................................................................................................12 1.3.3 Đường xâm nhập và truyền lây của virus............................................................12 1.4 Đặc điểm bệnh học .................................................................................................13 1.4.1 Quá trình sinh bệnh ..............................................................................................13 1.4.2 Triệu chứng và bệnh tích ......................................................................................14 2. Phương pháp nuôi cấy tế bào. ................................................................................16 2.1 Khái niệm ................................................................................................................16 2.2 Các loại tế bào nuôi cấy: Tế bào biểu mô, Nguyên sợi bào, Tế bào cơ, ...............16 2.3 Một số máy móc thiết bị cần thiết ..........................................................................16 2.4 Thành phần môi trường. .........................................................................................16 2.5. Kiểm soát việc nuôi cấp tế bào...............................................................................17 2.6. Thu hoạch tế bào.....................................................................................................18 2.7. Bảo quản tế bào. .....................................................................................................18 Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 3 2.8. Nguyên nhân gây nhiễm trùng trong nuôi cấy tế bào.............................................18 2.9. Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy tế bào ..................................................................18 3. Chẩn đoán bệnh Newcastle bằng phương pháp nuôi cấy tế bào.........................19 1. Thu thập và gởi mẫu đi chuẩn đoán bệnh..................................................................19 1.1 Mẫu cơ .....................................................................................................................19 1.2. Mẫu huyết thanh .....................................................................................................19 2. Xử lý mẫu ..................................................................................................................21 3. Phương pháp chuẩn bị môi trường xơ phôi gà ( CEF) một lớp................................21 3.1 Nguyên liệu..............................................................................................................21 3.2 Trypsin có tế bào .....................................................................................................22 3.3 Cấy tế bào vào chai..................................................................................................23 4. Kiểm tra mẫu bệnh phẩm .......................................................................................23 IV. KẾT LUẬN ............................................................................................................25 V. TÀI LIỆU THAM KHẢO......................................................................................26 I. ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh Newcastle hiện nay đang là mối quan tâm hàng đầu trong chăn nuôi gà bởi bệnh lây lan rất nhanh, tỷ lệ chết cao làm ảnh hưởng trực tiếp đến kinh tế hộ gia đình. Hơn thế bệnh còn là mối nguy cơ bùng phát dịch trên diện rộng gây ô nhiễm môi trường và sức khoẻ cộng đồng. Ảnh hưởng của bệnh Newcastle đối với nền kinh tế gia cầm toàn cầu rất lớn, là một trong những bệnh gây tác hại lớn đến sự phát triển của ngành chăn nuôi gia cầm thế giới. Ngoài ra thiệt hại liên tục do bệnh Newcastle gây ra sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến số lượng cũng như chất lượng thực phẩm cho người dân. Trong thực tế đã có nhiều người thường có tư tưởng chủ quan khi thấy trong thời gian dài trong gia đình nhà mình không bị bệnh Newcastle đã không thực hiện đúng quy trình nhỏ và tiêm phòng vaccine Newcastle từ đó đã dẫn đến nguy cơ mắc bệnh cao.Từ đó mỗi khi có dịch bệnh xảy ra công tác kiểm soát dịch bệnh trở nên khó khăn hơn. Vì vậy việc chẩn đoán mẫu bệnh phẩm để xác định nguyên nhân gây chết của gia cầm có phải là do virus Newcastle gây ra hay không có ý nghĩa thực tế rất lớn nhằm góp phần làm giảm tối đa các rủi ro có thể xảy ra cũng như ngăn chặn không cho dịch bệnh lan tràn sang các khu vực khác và trên thế giới. Vì vậy công tác kiểm soát dịch bệnh sẽ dễ dàng hơn và hiệu quả hơn. Hiện nay có rất nhiều kỷ thuật phân tử để chẩn đoán bệnh Newcastle như dùng phôi gà, phương pháp huyết thanh học, phương pháp thử thách, phương háp kháng thẻ huỳnh quang và một trong những phương pháp chẩn đoán chính xác hiệu quả và đặc trưng nhất chính là phương pháp nuôi cấy tế bào. Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 5 II. TỔNG QUAN 1 Bệnh Newcastle 1.1 Khái quát về bệnh Newcastle Bệnh Newcastle hay còn gọi là bệnh dịch tả hay bệnh gà rù. Bệnh do virus avian paramyxovirus type 1 (APMV-1) gây nên chủ yếu trên các loài gia cầm, trong đó gà là loài mẫn cảm nhất. Trong các tài liệu chuyên môn trước đây, bệnh Newcastle còn gọi là bệnh pseudo-poutry plague, avian pest, avian distemper… Virus newcastle rất đa dạng về độc lực và thường gây ra nhiều dạng bệnh với mức độ nghiêm trọng rất khác nhau. Sự đa dạng này thường gây ra một số khó khăn trong việc nhận dạng được bệnh ngay khi có virus Newcastle xâm nhập vào đàn gia cầm (Trần Đình Từ, 1995). Bệnh Newcastle phức tạp ở chỗ các chủng virus khác nhau có thể gây ra những biến động rất lớn về mức độ nghiêm trọng của bệnh, kể cả một vật chủ đã biết rất rõ như gà. Để phân chia các thể hay các týp bệnh lý của bệnh Newcastle dựa vào các triệu chứng lâm sàng của gà, Beard và Hanson (1984) [72] đã tóm tắt như sau: (1) Thể Doyle (1927) [99] là thể bệnh Newcastle cấp tính, gây tử vong cho gà ở mọi lứa tuổi. Thường xuất huyết ở đường tiêu hóa và thể bệnh này được gọi là thể bệnh Newcastle độc lực cao hướng nội tạng ( VVND: Viscerotropic velogenic Newcastle disease). (2) Thể Beach ( Beach, 1942) [69] cũng là thể bệnh Newcastle cấp tính thường gây tử vong ở gà mọi lứa tuổi. Các triệu chứng hô hấp và thần kinh thường xuất hiện nổi trội vì vậy được gọi là bệnh Newcastle độc lực cao hướng thần kinh (NVND: Neurotropic velogenic Newcastle disease). (3) Thể Beaudette ( Beaudette and Black, 1946) [74] là một thể Newcastle nhẹ hơn, thường chỉ gây tử vong ở gà con. Virus gây ra týp bệnh này thuộc nhóm virus có độc lực trung bình ( Mesogenic NDV) và một số chủng virus thuộc nhóm này đã được sử dụng làm vaccine virus sống dùng để tiêm chủng lặp lại. Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 6 (4) Thể Hitchner ( Hitchner và Johnson,1948) [127] là một thể bệnh đường hô hấp nhẹ gây ra bởi nhóm virus có độc lực thấp ( Lentogenic NDV), thường sử dụng để sản xuất các loại vaccine virus sống. (5) Thể ruột, không triệu chứng ( asymptomatic-enteric form) ( Lancaster, 1981) [156] là thể gây nhiễm ở đường ruột bởi các virus gần như không có độc lực, không gây bệnh rõ ràng ( Apathogenic or avirulent NDV). 1.2 Virus gây bệnh 1.2.1 Hệ thống phân loại APMV-1 hay virus Newcastle được xếp vào chi Rubulavirus thuộc họ phụ Paramyxovirinae của họ Paramyxoviridae. Các họ virus Paramyxoviridae, Filoviridae, Rhabdoviridae và Bornaviridae tạo nên bộ Mononegavirales, có bộ gen là một RNA chuỗi đơn âm ( negative single strained RNA) không phân đoạn, với nucleocapside có cấu trúc đối xứng xoắn ( Murphy và ctv, 1999) [176]. Có chín nhóm huyết thanh Avian Paramyxovirus đã được công nhận và ký hiệu từ APMV-1 đến APMV-9 (Alexander, 1988) [48]. Trong số này virus Newcastle ( APMV-1) là tác nhân gây bệnh quan trọng nhất đối với gia cầm, nhưng APMV-2, APMV-3, APMV-6 và APMV-7 cũng có vai trò gây bệnh nhất định Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 7 1.2.2 Đặc điểm hình thái và lý hóa của virus Soi kính hiển vi điện tử tương phản âm thấy các tiểu thể virus Newcastle có dạng đa hình thái, tiêu biểu cho các thành viên của chi Rubulavirus. Các hạt dạng tròn có kích thước khoảng 100-500 nm, còn các dạng sợi có bề ngang khoảng 100 nm với chiều dài thay đổi mỗi khi quan sát. Bề mặt hạt virus được bao bọc với các mấu lồi dài khoảng 8 nm. Trong hầu hết các vi ảnh điện tử, Nucleocapside thường có “dạng xương cá trích” điển hình cho Paramyxovirus với chiều dài khoảng 18 nm, cấu trúc đối xứng xoắn, có thể được quan sát dưới dạng sợi tự do hoặc nhô ra từ các tiểu thể virus bị đứt gãy ( Murphy và ctv, 1999; Alexander, 2003) [176, 53] . Bộ gen của Avian Paramyxovirus chứa một RNA đặc trưng duy nhất, chuỗi âm với trọng lượng phân tử khoảng 5.106 Da ( Kolakofsky và ctv, 1974) [151], chiếm khoảng 0,5 % trọng lượng hạt virus. Giải mã trình tự Nucleotide của bộ gen của virus Newcastle cho thấy có độ dài bao gồm 15.186 Nucleotide ( Philips và ctv, 1998) [188]. Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 8 Hạt virus có khoảng 20-25% Lipid có nguồn gốc từ tế bào vật chủ và khoảng 6% carbonhydrade. Tổng trọng lượng phân tử của một hạt virus trung bình là khoảng 5.108 Da, tỉ trọng trong đường Sucrose là 1,18-1,2 g/l ( Alexander, 2003) [53]. Điện di các tiểu thể virus Newcastle tinh sạch đã bị phá vỡ trên gel Polyacryamid thường cho thấy ít nhất 7 chuỗi Polypeptide. Tuy nhiên một trong 7 chuỗi này là Protein actin của vật chủ tích hợp vào hạt virus. 1.2.3. Các đặc tính sinh học a. Hoạt tính gây ngưng kết hồng cầu Khả năng gây nhưng kết hồng cầu ( Haemagglutination: HA) của virus Newcastle và các APMV khác là do Protein HN bám dính vào các thụ thể nằm trên bề mặt hồng cầu. Đặc tính này và sự ức chế ngưng kết đặc hiệu bởi huyết thanh miễn dịch đã được chứng minh là công cụ hiệu quả trong chẩn đoán bệnh Newcastle. Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 9 Hồng cầu gà thường được dùng trong phản ứng HA nhưng virus Newcastle có thể gây ngưng kết hồng cầu của các loài lưỡng thê, bò sát và những loài chim khác ( Lancaster, 1966) [154]. Avian Paramyxovirus còn có thể làm ngưng kết các tế bào không phải là hồng cầu nếu chúng có thụ thể phù hợp. a. Hoạt tính Neuraminidase Enzyme neuraminidase cũng là một thành phần của phân tử HN. Enzyme này có khả năng lấy đi các thụ thể từ tế bào vật chủ nhằm ngăn cản sự bám trở lại vào bề mặt tế bào của các hạt virus đã được giải phóng và sự ngưng tụ virus. b. Sự dung hợp tế bào và sự tan huyết Virus Newcastle và các APMV khác có thể làm tan vỡ hồng cầu hay sự dung hợp với tế bào khác bởi cùng một cơ chế. Hiện tượng bám vào vị trí thụ thể khi tái sản được tiếp nối bởi sự dung hợp màng của virus với màng tế bào dẫn đến sự dung hợp của ít nhất hai hay nhiều tế bào, hình thành các tế bào khổng lồ khi các tiểu thể virus mọc chồi từ các màng tế bào. Màng rắn chắc của hồng cầu thường bị vỡ bởi sự dung hợp của virus (Alexander, 2003) [53]. c. Sự tạo mảng của virus Sự tạo mảng ở môi trường tế bào của các chủng virus Newcastle khác nhau cả về hình dạng lẫn kích thước có hai hình thái của mảng: sang hoặc đỏ và kích thước Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 10 của mảng tương quan với độc lực của chủng virus đối với gà ( Reeve và postr, 1971) [194]. d. Độc lực của virus Khả năng mẫn cảm với virus Newcastle thay đổi theo loài vật chủ. Gà rất nhạy cảm với virus Newcastle Ở gà khả năng mắc bệnh Newcastle chủ yếu được quyết định bởi chủng virus, mặc dù liều nhiễm, đường lây nhiễm, tuổi và các yếu tố môi trường cũng có tác động. Gà càng non thể bệnh càng cấp tính. Giống gà không có ảnh hưởng nhiều đến tính mẫn cảm của gà đối với bệnh. Con đường lây nhiễm tự nhiên ( mũi, mắt, miệng) thường dẫn đến các triệu chứng hô hấp, trong khi tiêm vào bắp thịt, tĩnh mạch, màng não thì tăng các triệu chứng thần kinh. Hanson và Bradly (1955) [121] đã xếp các chủng virus Newcastle vào ba nhóm có độc lực khác nhau: virus Newcastle độc lực cao, virus Newcastle độc lực trung bình và virus Newcastle độc lực thấp dựa vào ba mốc thời gian gây chết phôi gà sau khi virus được tiêm vào túi niệu là < 60 giờ, từ 60-90 giờ và trên 90 giờ. Những nghiên cứu tiếp theo bởi khả năng gây bệnh của virus Newcastle dựa vào giá trị MDT ( Mean Death Time), ICPI ( Intracerebra Pathogenicity Index), IVPI ( Intravenous Pathogenicity Index) đã củng cố và sáng tạo thêm sự phân nhóm này ( bảng 1.2). Bảng 1.2: Phân loại nhóm độc lực của virus Newcastle được đánh giá qua các chỉ số độc lực cơ bản Nhóm độc lực MDT (giờ) ICPI IVPI Viscerotropic VNDV* <60 1.5-2.0 2.0-3.0 Neurotropic VNDV* <60 1.5-2.0 2.0-3.0 Mesogenic NDV 60-90 1.0-1.5 0.0-0.5 Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 11 Lentogenic NDV >90 0.2-0.5 0.0 Asymptomaic NDV >90 0.0-0.2 0.0 Nguồn: Alexander, 1989 [89] VNDV*: Velogenic NDV d. Đặc tính nuôi cấy Tất cả APMV đều có thể nhân lên trong phôi trứng gà. Các virus Newcastle có khả năng và thời gian gây chết phôi gà rất khác nhau. Khi có virus Newcastle vào xoang niệu mô của phôi gà ấp từ 9-11 ngày, tùy theo độc lực của từng chủng mà có thể làm chết phôi từ 48 -100h. Hiệu giá virus cũng thay đổi theo chủng virus và những chủng gây chết phôi chậm hoặc không gây chết phôi sẽ cho hiệu giá cao nhất ( Gough và ctv, 1974) [115]. Đường tiêm cũng rất quan trọng, khi tiêm vào túi lòng đỏ thường gây chết phôi nhanh hơn khi tiêm virus Newcastle vào túi niệu ( Estupinan và ctv, 1968; Beard và Hanson, 1984) [101, 72]. g. Sức đề kháng: Ở 600C virus Newcastle bị diệt trong 30 phút, ở 1000C thì bị diệt trong 1 phút. Nhiệt độ môi trường từ 4-200C, virus có thể tồn tại trong 1 tháng và ở nhiệt độ âm virus tồn tại nhiều năm. Khả năng chịu nhiệt của từng chủng virus Newcastle là một đặc tính di truyền, các chủng khác nhau có khả năng chịu nhiệt khác nhau ( Trần Đình Từ, 1995) [31]. Ở nhiệt độ 560C có một số chủng virus chịu nhiệt tới 6 giờ mà vẫn còn khả năng gây nhiễm. Trong thịt thối rữa, phân, xác chết, virus tồn tại không quá 24 giờ. Trong phôi gà bệnh ở trạng thái khô lạnh, virus vẫn có khả năng gây bệnh trong 2 năm. Do virus Newcastle có màng bọc ngoài là lipid nên dễ mẫn cảm với các hóa chất như ether, chloroform, cồn, formol, phenol, beta-propiolacton làm mất khả năng gây nhiễm nhưng không ảnh hưởng đến tính miễn dịch của virus. Chất sát trùng như crezyl 5%, sữa vôi 10% có khả năng diệt virus ( Nguyễn Vĩnh Phước, 1977 và 1978) [25, 26] Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 12 Dung dịch Glycerin 50% có thể giữ virus trong bệnh phẩm 7 ngày ở 370C nhưng không còn khả năng gây nhiễm. Ở pH 10, virus mất khả năng gây nhiễm, virus cũng dễ bị diệt bởi các tia tử ngoại ( Nguyễn Lương, 1994) [21] 1.3 Đặc điểm dịch tễ học của bệnh Newcastle 1.3.1 Phân bố và diễn biến của bệnh Việc sử dụng rộng rãi phòng bệnh Newcastle ở nhiều nước trên thế giới là một bằng chứng về sự phổ biến của bệnh này trên thế giới. Hiện tại, vẫn có thể nói rằng bệnh Newcastle hiện diện ở khắp thế giới nhưng xảy ra thường xuyên chủ yếu là ở châu Phi, châu Á, Trung Mỹ, và một số vùng của Nam Mỹ. Do vậy, bệnh này vẫn được quan tâm giám sát và việc nghiên cứu cải tiến các kỹ thuật chuẩn đoán và biện pháp phòng bệnh luôn luôn được khuyến khích ( Falcon, 2004) [104]. 1.3.2 Vật chủ Bên cạnh gà, có lẽ hầu hết chim nuôi và chim hoang dã đều có thể bị nhiễm với các dòng virus Newcastle. Gà là vật chủ quan trọng nhất đối với virus Newcastle đồng thời có thể có vai trò của các loài chim khác như vịt, ngỗng, gà lôi, chim cút, bồ câu, gà tây. Virus newcastle cũng có thể gây nhiễm các loài động vật hữu nhũ. Con người cũng nhiễm bệnh, kể cả với các loài virus có độc lực cao lẫn độc lực thấp và sự nhiễm bệnh cũng có thể gây nên chứng viêm kết mạc nặng ( Chang, 1981) [88] 1.3.3 Đường xâm nhập và truyền lây của virus Virus Newcastle xâm nhập vào cơ thể gà qua đường hô hấp, kết mạc mắt và đường tiêu hóa. Có giả định cho rằng gà mẫn cảm hơn đối với virus Newcastle khi Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 13 xâm nhập vào đường hô hấp ( Spradbrow, 2001) [221]. Virus bài xuất ra khỏi cơ thể qua đường hô hấp hoặc qua phân. Lancaster (1966) [154] và Alexander (1988) [48] đã liệt kê những phương thức lây lan chủ yếu của bệnh Newcastle như sau: (1) Sự vận chuyển chim sống như buôn bán gia cầm, chim cảnh, bồ câu, chim hoang dã, (2) Tiếp xúc giữa những động vật khác, (3) Di chuyển người và phương tiện, (4) Luân chuyển sản phẩm gia cầm, (5) Truyền lây qua đường không khí, (6) Thức ăn gia cầm bị vấy nhiễm, (7) Nước uống, (8) Vaccine 1.4 Đặc điểm bệnh học 1.4.1 Quá trình sinh bệnh Virus Newcastle xâm nhập vào cơ thể qua đường hô hấp và tiêu hóa. Những hạt < 5 micron trong không khí có thể phân tán vào trong toàn bộ khí quan hô hấp của gia cầm, kể cả túi khí. Các hạt > 5 micron bị giữ lại ở kết mạc, niêm mạc mũi và khí quản ( Kouwenhoven, 1993) [152]. Trong khí quản, virus lan truyền bằng cách nhiễm từ tế bào này sang tế bào khác do hoạt động của các lông tơ. Hiệu giá virus cao nhất được phát hiện 24 – 96h sau khi nhiễm, sau đó giảm dần có thể do kháng thể được tạo thành từ ngày thứ 5, nhưng virus vẫn còn hiện diện tới ngày thứ 12. Sự lan truyền tiếp theo phụ thuộc rất lớn vào độc lực của chủng virus. Trong khi các chủng virus độc lực thấp chỉ hiện diện trong hệ thống tuần hoàn với hiệu giá thấp, các chủng độc lực trung bình có thể xâm nhập vào thận, phổi, túi Fabricius và lách. Còn các chủng virus độc lực cao có thể phát hiện trong vòng 22 – 24h trong tất cả các mô bào với hiệu giá cao nhất ở trong tuyến ức ( Thymus) và thấp nhất ở trong mô cơ và não (Singh và El – Zein, 1978) [214]. Sau khi nhân lên ban đầu ở vị trí xâm nhập virus độc lực cao xâm nhập vào máu, tới lách, gan, thận và phổi. Từ giờ thứ 36 sau khi nhiễm, sự nhân lên virus bị cản trở trong khoảng 12 – 24h và hiệu giá virus tụt xuống. Virus xâm nhập vào não sau khi quá trình nhân lên ở các mô ngoài hệ thống thần kinh ngừng lại từ giờ thứ 60 sau khi nhiễm và gà bắt đầu chết ( Asdell và Hanson, 1960) [65]. Đa số virus xâm nhập vào hệ thống Chẩn đoán bệnh Ne