Chẩn đoán virus dại (rabies virus)

  1 Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM Bộ môn công nghệ sinh học Lớp DH06SH Bài tiểu luận CHẨN ĐOÁN VIRUS DẠI ( RABIES VIRUS) GVHD T.S NGUYỄN NGỌC HẢI SV Trương Thị Huyền Trang – MSSV 06126159   2 I. Đặt vấn đề Bệnh dại là bệnh do virus dại (rabies virus) gây lên. Đây là một bệnh nhiễm virus cấp tính của hệ thần kinh trung ương dẫn đến tử vong chắc chắn. Bệnh dại là một trong những bệnh truyền nhiễm được ghi nhận từ thời cổ xưa, mô tả từ cách đây hơn 3000 năm và là một bệnh truyền nhiễm đáng sợ. Bệnh dại có thể gặp ở tất cả động vật có vú và chỉ xảy ra ở động vật có vú. Bệnh lây truyền chủ yếu do các chất tiết bị nhiễm, thường do vết cắn, vết liếm của động vật mắc bệnh dại vào các vết thương hở Khi virus vào cơ thể, nó sẽ đi theo các dây thần kinh đến não bộ trung ương, chó, mèo, chồn bị nhiễm virus thì có những biểu hiện rất khác nhau như là sợ sệt, hung hăng, chảy nước mũi nước dãi nhiều, nuốt vào khó khăn, choáng và lên cơn những thú hoang dại mắc bệnh dại thì thường có những biểu hiện khác thường như là chúng thường chỉ thấy vào ban đêm còn ban ngày thì chúng sẽ đi lang thang đây đó. Có 2 dạng bệnh dại • Bệnh dại từ động vật nuôi như chó mèo: trên thế giới có khoảng 35.000- 50.000 ca bệnh dại ở người, chủ yếu ở các nước đang phát triển, phần lớn là do chó dại cắn . • Bệnh dại tự nhiên : Là bệnh do động vật hoang dại truyền .Các nước Âu Mỹ có chương trình kiểm soát bệnh dại ở động vật nuôi hiệu quả nên rất ít gặp bệnh dại do cho cắn . Loài dơi rất nguy hiểm vì chúng có thể mang virus dại nhưng biểu hiện hoàn toàn khỏe mạnh, tiết virus dại vào nước bọt rồi truyền đến động vật khác và người .Bệnh dại ở loài dơi có thê gây những trận dịch động vật ở những vùng mới trên trái đất .   3 Theo thống kê tại thành phố HCM : tỉ lệ tử vong do chó dại cắn là 98,2% và mèo dại cắn là 1,8% .Loài gặm nhấm và thỏ không truyền bệnh dại .Tỉ lệ mắc bệnh tăng cao vào mùa nắng. Tóm lại đây là một bệnh vô cùng nguy hiểm nếu phát triển thành dịch II. Rabies virus Thuộc giống lyssavirus, họ Rhabdoviridae Rabies virus có vật chất di truyền là RNA Quan sát dưới kính hiển vi điện tử có hình viên đạn do đó dễ phân biệt với các virus cùng họ Có kích thước xấp xỉ 180 x 75nm Gồm hai cấu phần chính là lõi virus (virus core) có cấu trúc ribonucleoprotein xoắn (RNP) và lớp vỏ bao (virus envelop). Các phần cấu tạo của virus •Lõi virus(ribonucleoprotein) •Chất nền protein •Lớp áo ngoài(envolop) •Các gai glycoprotein Phản ứng với các tác nhân lý hóa Virus dại kém bền vững và nhạy cảm với các yếu tố ngoại cảnh :bị tiêu diệt nhanh chóng bởi tia cực tím hoặc ánh sáng mặt trời, xà phòng đặc 20%, bởi sức nóng (500C /1h),bởi các dung môi lipid,bởi trypsin,chất tẩy, chất oxy hóa và pH quá cao hoặc quá thấp . Virus dại sống được hàng tuần khi lưu trữ ở 40C, bất hoạt bởi CO2 .Trong mô não, virus dại tồn tại vài tháng ở 400C hoặc hàng năm ở 700C .   4 Cấu tạo virus dại Sơ đồ cắt ngang virus Bộ gene virus (khoảng 12kb) mang leader-sequence (trình tự để trắng hay trình tự; trình tự mở đầu) có kích thước khoảng 50 nucleotide tiếp theo là các gene mã hóa cho 5 loại protein N, P, M, G và L với kích thước tương ứng   5 III. Cách gây bệnh của rabies virus Sau khi xâm nhập trong mô, virus nhân lên tại chỗ, đặt biệt trong cơ. Sau 1 thời gian virus bắt đầu phát tán, chúng đến tế bào cơ và những dây chằng tận cùng thần kinh. Virus nhân lên trong những tế bào hạch thần kinh, dây thần kinh, tùng thần kinh. Ngoài mô thần kinh, virus con nhân lên trong biểu mô của tuyến nước bọt, giác mô, da, dịch tiết nước bọt cơ lưỡi… Như vậy sau khi thực hiện sự xâm lấn ly tâm từ hệ thần kinh, virus xâm nhiễm tất cả cơ quan và mô.  Quá trình tấn công vào não bộ nhanh hay chậm tùy thuộc vào vị trí xâm nhập của virus, càng gần não bộ thời gian tấn công đến não càng nhanh. Sự xâm nhiễm từ thú qua thú tương tự như từ thú qua người. Virus nhân lên ở bào tương, các virion nẩy chồi từ màng bào tương tế bào ký sinh chủ .Virus dại tấn công vào các thụ thể acethylcholin trên bề mặt tế bào qua các gai glycoprotein .Men polymerase RNA của virion sao chép bộ gen sợi đơn RNA thành 5 loại RNA thông tin (mRNA) .Bộ gen RNA nằm trong ribonucleoprotein (RNP), được protein N bao quanh chứa các gen sao chép .Các mRNA mã hóa cho 5 protein của virion :nucleocapsit (N), protein của men polymerase (L,P), chất đệm (M) và glycoprotein (G) .RNP của bộ gen làm khuôn mẫu cho RNA sợi bổ sung, tạo ra các RNA con cháu có cực tính âm .Các protein virus đóng vai trò như polymerase cho virus nhân lên vào sao chép . Sự dịch mã cần thiết cho virus nhân lên, đặc biệt là cho protein N và P, RNA mới được nhân lên kết hợp với men transcriptase và nucleprotein của virus để tạo lõi RNP trong bào tương.Các hạt virus có được màng bao bọc trong lúc nẩy chồi qua màng bào tương .Protein đệm của virus tạo 1 lớp ở mặt ngoài và tạo các gai virus   6 IV. Các phương pháp chẩn đoán IV.1. Phương pháp mô bệnh học (histopathology) Một phương pháp nhanh chóng và đơn giản để chẩn đoán rabies là dùng loại thuốc nhuộm thích hợp phát hiện thể Negri. Kĩ thuật mô bệnh học làm được điều này, tuy nhiên ngày nay ở hầu hết các phòng thí nghiệm đều sử dụng phương pháp fluorescent antibody( FA), kĩ thuật này đã được Goldwasser và Kissling lần đầu tiên năm 1958. Thuốc nhuộm huỳnh quang xuyên qua màng tế bào đi vào trong nhân sẽ nhuộm màu thể Negri. Sơ đồ cách gây bệnh của Rabies virus   7 Thể Negri là biểu hiện bệnh lý đặc thù của virus dại Thể Negri trong tế bào thần kinh nhiễm virus (mũi tên chỉ) Tuy vậy, cũng chỉ phát hiện ở khoảng 70% trường hợp nhiễm virus. IV.2. phương pháp Taqman PCR   8 Nguyên tắc của phương pháp này là dựa trên phản ứng PCR có bổ sung tác nhân dò Taqman. Phát hiện mục tiêu thông qua cường độ phát huỳnh quang của Taqman. Các bước tiến hành: 2.1 Ly trích RNA và tạo cDNA Ly trích RNA bằng TRIzol, TRIzol LS với 1μl Glycoblue Reverse transcription toàn bộ RNA thành cDNA 0.5 μl random primer cho 1μl RNA 2.2. Thiết kế mồi và Taqman Đọan mồi được thiết kế đặc hiệu cho vật chất di truyền của virus. Taqman được thiết kế có mạch đơn ngắn (vài nucleotide) có trình tự bắt cặp với cDNA virus Taqman được gắn huỳnh quang ở đầu 5’có hoạt tính, đầu 3’ gắn huỳnh quang không hoạt tính. Huỳnh quang ở đầu 3’ sẽ ức chế sự phát huỳnh quang ở đầu 5’ khi còn trong mạch. Một khi mạch Taqman bị enzyme polymerase phá hủy (khi phản ứng PCR xảy ra) sẽ giải phóng huỳnh quang ở đầu 5’ khi đó cường độ huỳnh quang trong dung dịch phản ứng sẽ tăng lên và có thể đo được bằng máy đo cường độ huỳnh quang. Do đó nếu cường độ huỳnh quang trong dung dịch tăng lên sẽ đồng nghĩa với phản ứng PCR đã xảy ra nghĩa là có virus rabies. 2.3. Tiến hành phản ứng   9 Sản phẩm PCR sẽ được đem đi đo cường độ huỳnh quang, thông qua đó xác định được sự hiện diện của virus Phương pháp này phát hiện đựợc khoảng 95% trường hợp nhiễm virus IV.3. Phương pháp chẩn đoán huyết thanh học: Kháng thể virus dại xuất hiện chậm sau khi cơ thể bị nhiễm nhưng thường có thể phát hiện khi bắt đầu có biểu hiện lâm sàng. Bản chất của phương pháp này là phản ứng ELISA (phản ứng kháng nguyên kháng thể). Virus dại có 1 type kháng nguyên duy nhất .Tuy nhiên, các dòng virus phân lập từ các loài khác nhau ở các vùng địa lý khác nhau có các epitop trên nucleoprotein và glycoprotein khác nhau . Dùng kháng thể đơn dòng hoặc trình tự nucleotide đặc hiệu để xác định những epitop khác nhau . Ở Mỹ, đã tìm thấy 5 biến thể kháng nguyên trong động vật sống trên cạn và 8 biến thể khác trong loài dơi.Vị trí amino acid 333 của glycoprotein mang tính độc đóng vai trò quan trọng trong sinh bệnh học bệnh dại và gây hòa màng tế bào nhiễm virus. Các gai virus chứa glycoprotein, tạo kháng thể trung hòa ở động vật .Kháng huyết thanh kháng nucleocapsit giúp chẩn đoán bệnh dại bằng phản ứng ELISA. Kháng thể trong kháng huyết thanh   10 được nhuôm huỳnh quang rồi được cố định trên giá thể. Sau đó cho huyết thanh mẫu cần chẩn đoán vào để phản ứng ELISA xảy ra, rửa dung dịch phản ứng loại bỏ các phần không bắt cặp. soi dưới kính hiển vi huỳnh quang phát hiện mục tiêu thông qua sự phát huỳnh quang. Chẩn đoán huyết thanh học được cho là có hiệu quả nhất trong chẩn đoán bệnh dại. Phương pháp này phát hiện gần 100% trường hợp nhiễm virus. V. So sánh giữa các phương pháp Trong 3 phương pháp đã trình bày ở trên thì phương pháp chẩn đoán huyết thanh học là phương pháp có hiệu quả nhất vì nó có thể phát hiện được gần 100% trường hợp nhiễm virus. Tuy nhiên mỗi phương pháp đều có ưu và nhược điểm riêng nên tùy trường hợp ta áp dụng cho phù hợp các phương pháp VI. Kết luận   11 Bệnh dại là một bệnh nguy hiểm vì nó là một bệnh truyền nhiễm có tốc độ lây lan cao và gây tử vong chắc chắn nếu không phát hiện kịp thời. do đó cần có những biện pháp phòng bệnh, chẩn đoán bệnh và điều trị một cách kịp thời và có hiệu quả. VII. Tài liệu tham khảo www.techmicrobio.net www.beforethebite.typepad.com