Chuẩn doán visus Viêm não Nhật Bản bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM CHẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC GIA CẦM BẰNG SHPT - 1 - BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC GVHD: PGS.TS. NGUYỄN NGỌC HẢI Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Hoa Thùy (MSSV: 06126151) Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 10 năm 2009 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM CHẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC GIA CẦM BẰNG SHPT - 2 - ĐẶT VẤN ĐỀ Chúng ta thấy ở nước ta, mùa hè là mùa dễ phát sinh nhiều loại bệnh như dịch tả, thương hàn, sốt xuất huyết,… và đặc biệt một bệnh rất nguy hiểm là bệnh viêm não Nhật bản, hay gặp ở trẻ dưới 15 tuổi và nhóm có nguy cơ cao nhất là trẻ từ 2 – 6 tuổi (chiếm 75% tổng số trẻ mắc bệnh). Theo thông báo của Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, mỗi năm có khoảng 3000 trẻ em mắc bệnh viêm não, trong đó có 30 – 40% bị bệnh viêm não Nhật bản. Bệnh viêm não Nhật Bản do muỗi truyền virus và phát triển mạnh vào mùa nắng nóng nên thường gọi là bệnh viêm não mùa hè hay bệnh viêm não B. Hiện nay bệnh viêm não Nhật Bản chưa có thuốc đặc trị nên thường có tỷ lệ tử vong cao (10-20%) hay là để lại những di chứng nặng nề như động kinh, giảm học lực, đần độn, liệt, thất ngôn. Những di chứng này thường chiếm 50% người mắc bệnh, thường gây tàn phế, mất khả năng lao động để lại gánh nặng cho gia đình, xã hội. Ở chuyên đề này, tôi xin trình bày kỹ hơn về virus và bệnh viêm não Nhật Bản, đặc biệt là phương pháp chuẩn đoán virus này bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào. TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM CHẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC GIA CẦM BẰNG SHPT - 3 - TỔNG QUAN I-Bệnh viêm não Nhật Bản 1. Khái niệm: Viêm não Nhật Bản (VNNB) là một bệnh truyền nhiễm trùng cấp tính gây ra bởi một loại siêu vi trùng thuộc nhóm Arbovirus có ái tính với tế bào thần kinh, có tên là Japanese Encephalitis Virus (JE Virus). Virus lây truyền qua người nhờ trung gian là muỗi Culex tritaeniorhynchus và Culex vishnui. Bệnh có thể xảy ra rải rác hay thành dịch. Bệnh không truyền từ người này sang người khác.Bệnh có thể dẫn đến tình trạng tổn thương não vĩnh viễn, tỷ lệ tử vong rất cao. Bệnh viêm não đã mô tả từ năm 1871 những mãi đến nam 1935 mới phát hiện và phân lập được từ bệnh nhân ở Tokyo nên được gọi là bệnh viêm não Nhật Bản. Tùy theo mức độ và vị trí tổn thương tại hệ thần kinh trung ương (HTKTW), lâm sàng sẽ có biểu hiện triệu chứng của nơi bị xâm phạm như : viêm não, viêm màng não, viêm sừng trước tủy sống hoặc bệnh cảnh phối hợp: viêm não màng não, viêm não màng não tủy sống. 2. Dịch tễ học Khái quát lịch sử: VNNB là bệnh dẫn đầu trong số các bệnh viêm não do virus ở Châu Á. Nó được lưu hành rộng rãi ở các nước trong vùng Đông Á, Nam Á, và Đông Nam Á trong đó có Việt Nam. Bệnh cũng đã xuất hiện ở phía Tây Thái Bình Dương. Hằng năm vào khoảng 50000 trường hợp mới mắc trên thế giới với con số tử vong ước chừng 10000(1988). Bệnh đã được biết tới vào 1871 nhưng mãi đến năm 1924 mới biết rõ về lâm sàng qua trận dịch lớn với 6000 trường hợp, và tỷ lệ tử vong vào TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM CHẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC GIA CẦM BẰNG SHPT - 4 - khoảng 60% (ở Nhật Bản), bệnh được gọi là “ viêm não mùa hè”. Năm 1935 người ta phân lập được virus từ não của một bệnh nhân tử vong tại Tokyo, và cung cấp được chủng Nakayama nguyên mẫu. Virus này được gọi là virus VNNB B có liên quan đến viêm não mùa hè tại Nhật Bản. Năm 1952, virus VNNB đầu tiên được phân lập từ một lính viễn chinh Pháp tại miền Bắc Việt Nam, tiếp theo đó năm 1953 có 98 trường hợp VNNB trong quân đội viễn chinh Pháp. Trong thập kỉ 1960 có nhiều trận dịch viêm não siêu vi được gọi là hội chứng viêm não cấp tính gọi tắt là hội chứng não cấp (HCNC), xảy ra tại hầu hết các địa phương ở miền Bắc, nhất là ở miền trung du và vùng đồng bằng châu thổ sông Hồng, có nơi tỷ lệ mắc bệnh hằng năm lên tới 6-10/100000 dân với tỷ lệ tử vong từ 5,7% - 28,5% và siêu vi VNNB là tác nhân gây ra 50% - 70% HCNC. Tại miền Nam viêm não siêu vi xảy ra rải rác quanh năm, số mắc cao nhất vào năm 1980 với tỷ lệ 4,95/100000 dân và tỷ lệ tử vong 27,46% thường tập trung nhiều ở đồng bằng sông Cửu Long, nơi có thói quen nuôi heo gần nhà. Chưa tiến hành nghiên cứu có hệ thống tại đây, nhưng qua kết quả báo cáo sơ bộ của bệnh viện lớn tại TP.HCM, từ 64% - 69% hội chứng não cấp nhập viện có tác nhân gây bệnh là virus VNNB, với tỷ lệ tử vong vào khoảng 16%. Về mặt dịch tễ học bệnh VNNB có đặc điểm: a. Nguồn lây Các loài chim hoang dã như cò, diệc, cò quặm, liếu điếu… và các loài chim khác sống gần các vùng đầm lầy là những vật chủ quan trọng mang mầm bệnh virus VNNB. Các nhà khoa học đã xác định và phân lập được virus VNNB từ nội tạng của chim hoang dã. Mặc dù mang virus trong máu kéo dài nhưng các loài chim này không biểu hiện bệnh, và nó là nguồn lây nhiễm cho các loài muỗi TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM CHẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC GIA CẦM BẰNG SHPT - 5 - trong thiên nhiên. Các loài chim di cư có thể lây truyền mầm bệnh virus từ vùng này qua vùng khác. Qua điều tra giám sát về huyết thanh, hầu hết gia súc như trâu bò, dê, cừu, chó, đều có thể nhiễm virus VNNB, nhưng chỉ có heo, ngựa có biểu hiện bệnh như: viêm não ở ngựa, virus có thể qua nhau, nhiễm bào thai ở heo nái gây chết thai, hoặc xảy thai. Tuy nhiên chỉ có heo là nguồn nhiễm virus huyết quan trọng truyền cho muỗi vì những lý do sau: - Heo đẻ được nhiều lứa, tạo ra số lượng một quần thể heo cảm nhiễm virus mới - Luân chuyển thường xuyên mỗi 6-8 tháng - Chỉ số heo nhiễm virus trong tự nhiên cao hơn tất cả gia súc khác - Nhiễm virus máu ở heo thường cao nên dễ truyền virus qua muỗi TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM CHẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC GIA CẦM BẰNG SHPT - 6 - b. Trung gian truyền bệnh Đối với virus VNNB thì muỗi là con vật trung gian truyền bệnh quan trọng. Hiện nay người ta đã phát hiện có 30 loài muỗi khác nhau thuộc 5 họ Culex, Anopheles, Aedes, Mansoni và Amergeres là trung gian truyền bệnh VNNB do virus, trong đó có 2 loại C.tritae, C.vishui là vật chủ trung gian có khả năng truyền bệnh cao nhất. Nhiều nghiên cứu đã khẳng định muỗi Culex Tritaeniorhynchus là vật chủ trung gian chính lan truyền virus VNNB tại Việt Nam. C.Tritae có nhiều ở vùng nông thôn nơi mương máng, đồng ruộng ngập nước. Về đêm muỗi cái ưa hút máu động vật có xương sống như gia súc, chim, và cả người, sau đó bay phát tán đi xa. Muỗi hút máu động vật là heo, chim, trong thời kỳ nhiễm virus huyết, virus nhân lên trong muỗi với hiệu quả cao, sau đó có khả năng truyền bệnh suốt đời và có thể truyền virus sang thế hệ sau qua trứng. Muỗi truyền mầm bệnh virus từ chim sang lợn và người khi đốt, muỗi cũng có thể truyền mầm bệnh virus từ lợn sang người. TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM CHẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC GIA CẦM BẰNG SHPT - 7 - c. Chu trình lây truyền virus VNNB Virus VNNB được bảo tồn trong thiên nhiên do truyền sinh học từ động vật có xương sống này sang động vật có xương sống khác qua trung gian côn trùng hút máu là muỗi. Tuy chim là động vật chủ cơ bản của quá trình trong việc duy trì virus VNNB trong tự nhiên nhưng chưa có nghiên cứu rõ về vai trò quan trọng của chim trong việc truyền virus VNNB qua muỗi đến người. Heo là vật chủ quan trọng nhất có khả năng làm lan rộng virus VNNB, và chu trình tồn tại quanh năm. Người sống gần chu trình sinh thái tự nhiên này có thể mắc bệnh khi bị muỗi đốt. Người được coi là vật chủ cuối cùng đối với virus VNNB và có vai trò rất quan trọng trong dịch tễ học bệnh này. Virus VNNB trong máu người tồn tại trong thời gian ngắn với nồng độ thấp, nên không thể lây bệnh từ người này sang người khác qua muỗi đốt. TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM CHẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC GIA CẦM BẰNG SHPT - 8 - d. Phân bố bệnh Phân bố theo mùa: ¾ Virus VNNB lan truyền theo mùa trên hầu hết các vùng của Châu Á. ¾ Khí hậu với những yếu tố nhiệt độ và mưa có ảnh hưởng đến tình hình bệnh. Ở vùng ôn hòa, virus Japansese encephalitis lan truyền vào mùa hè và đầu mùa thu(vào khoảng từ tháng 5-9). Ở vùng cận nhiệt và nhiệt đới, sự lan truyền virus theo mùa có liên quan đến sự thừa thải trung gian truyền bệnh là muỗi và vật chủ lan truyền có xương sống.Vào mùa mưa ruộng lúa đầy nước tạo điều kiện tốt cho muỗi sinh sản và phát triển mạnh trong thiên nhiên, trùng hợp với thời điểm bệnh xảy ra nhiều. ¾ Vào mùa hè thời tiết nóng, ở nhiệt độ từ 270C - 300C virus thường phát triển tốt trong cơ thể muỗi. Nếu dưới 200C thì sự phát triển của virus dừng lại. ¾ Mô hình dịch tễ học lại khác nhau giữa các vùng miền, cụ thể là ở 2 miền Nam Bắc Việt Nam. Tại miền Bắc bệnh giảm nhiều vào những tháng lạnh, tăng vào những tháng hè và đỉnh cao vào tháng 5-6-7. Tại miền Nam, thời tiết nóng bệnh rải rác quanh năm. TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM CHẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC GIA CẦM BẰNG SHPT - 9 - Phân bố theo tuổi và giới tính : ¾ Tất cả mọi lứa tuổi chưa có miễn dịch đều có thể mắc bệnh. Ở những vùng có bệnh VNNB lưu hành, trẻ em sớm tiếp xúc với tác nhân gây bệnh nên tỷ lệ mắc bệnh ở trẻ cao thường từ 2-10 tuổi, phần đông ở thể không triệu chứng lâm sàng, số lượng trẻ có kháng thể đặc hiệu tăng theo tuổi nên tỷ lệ mắc bệnh giảm ở trẻ lớn và người lớn. Những người nếu chưa có miễn dịch đặc hiệu đều có thể mắc khi đến vùng có VNNB lưu hành. Bệnh không liên quan tới giới tính tuy nhiên trong thực tế số bệnh nam thường nhiều hơn nữ. Tuy chu trình sinh thái của virus VNNB trong thiên nhiên không thay đổi, nhưng tình hình dịch tễ có biến đổi trước tác động của con người, như thay đổi lề lối canh tác và chăn nuôi, đô thị hóa, điều kiện kinh tế xã hội được nâng cao, sử dụng thuốc diệt trừ côn trùng trong canh nông, và cuối cùng là vaccine chủng ngừa VNNB đã được sử dụng. TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM CHẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC GIA CẦM BẰNG SHPT - 10 - 3. Cách sinh bệnh Khi bị muỗi đốt, virus từ nước bọt của muỗi qua da. Giai đoạn đầu virus nhân lên tại chỗ và ở hạch lympho vùng, đây là nguồn dẫn đến virus huyết đầu tiên. Từ máu virus đi đến các tổ chức và nội tạng khác như tổ chức lympho, mô liên kết, cơ vân, cơ tim, tuyến nội và ngoại tiết. Virus tiếp tục nhân lên tại tổ chức ngoài thần kinh đưa đến virus huyết lần nữa kéo dài 3-5 ngày, thường với nồng độ thấp ở người. Nếu kháng thể trung hòa tăng kịp thì xảy ra hiện tượng virus huyết ngưng. Chưa biết rõ cơ chế xâm nhập hệ thần kinh trung ương của virus. Tuy nhiên, não bộ bị nhiễm lan tỏa chứng tỏ virus xâm nhập qua đường mạch máu. Mặt khác khi hàng rào mạch máu não bị tổn thương trong giai đoạn tiềm ẩn dễ tạo cơ hội cho virus xâm nhập thần kinh, như mắc bệnh VNNB trong trường hợp có sẵn bệnh cysticercosis não, hoặc sau chấn thương sọ não. Những biến đổi bệnh lý trong quá trình phát triển của virus trong hệ thần kinh trung ương như sau : ¾ Virus nhân lên trong tế bào thần kinh với nồng độ trong não gấp triệu lần so với ở vị trí khác ngoài thần kinh. Trong giai đoạn cấp tính, nói chung màng não bình thường hoặc thoáng mờ, não bị xung huyết , phù nề, xuất hiện điểm xuất huyết hoặc chảy máu tại chất xám, hoại tử ở đồi thị, nhân xám nền sọ, não giữa, tiểu não, nhân xám thân não, chất xám của võ não, không thấy tổn thương của chất trắng. Sừng trước tủy sống bị tổn thương giống như trong sốt bại liệt. ¾ Về mặt vi thể, hiện tượng tế bào thần kinh đệm thực bào thần kinh chết tạo ra những nốt điển hình do quá sản tế bào thần kinh đệm, khi bệnh kéo dài tế bào viêm bao quanh huyết quản tạo thành những hình ảnh vỏ ngoại quản, cuối cùng xuất hiện những ổ hoại tử khan hiếm tế bào do những tế bào thần kinh bị thoái hóa, tiêu hủy tạo ra, đôi khi có chất vôi ứ đọng bên trong. TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM CHẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC GIA CẦM BẰNG SHPT - 11 - 4. Đặc trưng bệnh VNNB có một thời kì ủ bệnh từ 5-15 ngày. Bệnh nhân có triệu chứng giống như cảm cúm. Sốt và lạnh run, sổ mũi là những dấu hiệu ban đầu của bệnh này. Sau đó là một số triệu chứng như nhức đầu, khó chịu, nôn mửa...,có thể rối loạn tâm lý. Trẻ em thường kém ăn. Trong trường hợp nặng có thể suy nhược, liệt nhẹ, co giật, sốt cao 39-41oC, có thể dẫn đến hôn mê và tử vong. Ở trẻ có tình trạng rối loạn ý thức, nôn mửa, cứng gáy, sảng, ảo giác, co giật, động kinh và lâm vào tình trạng rối loạn nhịp thở, hôn mê. Nếu có dấu hiệu nghi ngờ nhiễm bệnh, bệnh nhân cần được đến bệnh viện càng sớm càng tốt để tiến hành các xét nghiệm chẩn đoán bệnh ( như xét nghiệm máu, dịch não tủy, huyết thanh học, điện não đồ.... 5. Điều trị Cho đến nay chưa có một phương pháp điều trị đặc hiệu nào cho bệnh này. Chủ yếu là điều trị triệu chứng, nâng đỡ bệnh nhân trong các đơn vị hồi sức cấp cứu (chống sốt, chống co giật, chống phù não, trợ tim mạch, hô hấp, chống rối loạn thần kinh thực vật, chăm sóc tích cực, dinh dưỡng tốt...). Trong giai đoạn phục hồi, người bệnh cũng cần được huấn luyện phục hồi các di chứng. II. Virus viêm não Nhật Bản và phương pháp chuẩn đoán virus đó bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 1.Virus viêm não Nhật Bản a) Giới thiệu chung Virus viêm não Nhật Bản thuộc họ Flaviridae. Nó có quan hệ gần gũi với West Nile virus và ST.Louis encephalitis virus. TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM CHẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC GIA CẦM BẰNG SHPT - 12 - Virus viêm não Nhật Bản hình cầu, nhân chứa RNA mạch đơn, kích thước 45-50nm, bao quanh bởi cấu trúc hình khối gọi là capsid, phần vỏ giàu chất lipid. Virus viêm não Nhật Bản dễ mất hoạt lực ở nhiệt độ 56oC trong nửa giờ hoặc trong formalin 0,2%, ether, natrideoxycholate và cũng bị bất hoạt nhanh bởi tia tử ngoại. Virus này có thể được nuôi cấy trên tế bào thận heo, thận chuột Hamster, trên não chuột TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM CHẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC GIA CẦM BẰNG SHPT - 13 - bạch sơ sinh, chuột bạch trưởng thành hay trên tế bào của tổ chức côn trùng như muỗi. Virus viêm não Nhật Bản có 3 loại protein kháng nguyên: protein màng M, protein lõi C, protein vỏ E trong đó kháng nguyên vỏ E đóng vai trò quan trọng nhất trong bước đầu tiên của phản ứng với tế bào kí chủ và tạo ra kích thích miễn dịch bảo vệ cơ thể. b) Bộ gen virus VNNB Bộ máy di truyền của virus viêm não Nhật Bản là 1 RNA mạch đơn 2. Chuẩn đoán virus VNNB bằng kỹ thuật Shell vial culture (SVC) Shell vial culture (SVC) là sự biến đổi của công nghệ nuôi cấy tế bào thông thường cho phát hiện nhanh virus trong ống nghiệm. Kỹ thuật này gồm TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM CHẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC GIA CẦM BẰNG SHPT - 14 - có sự tiêm nhiễm mẫu lâm sàng vào tế bào một lớp phát triển trên một lá kính đậy (lamen) trong ống nuôi cấy SVC, sau đó đem đi ly tâm ở tốc độ chậm rồi ủ. Hệ thống này làm việc trên nguyên lý ly tâm tốc độ chậm làm tăng tính nhiễm virus vào những tế bào nhạy cảm. Người ta nghĩ rằng chấn thương nhỏ trên bề mặt tế bào đưa đến kết quả của việc ly tâm tốc độ chậm làm gia tăng lực cho virus vào trong tế bào, việc này làm giảm tổng thời gian mà virus xâm nhiễm vào tế bào. Trước tiên SVC được mô tả cho cytomegalovirus ở chuột. Sau đó, nguyên lý này được dùng trong lĩnh vực dược phẩm vi sinh cho phân lập Chlamydia trachomatis từ vùng sinh dục của người. Phát hiện nhanh cytomagelovirus trong mẫu nước tiểu ở người đã nhiễm sử dụng sự biểu hiện của tế bào nguyên bào sợi lưỡng bội của người (MRC-5), nó có ích trong chuẩn đoán virus. Sự nhanh của kỹ thuật này mà không giảm tính nhạy đã làm SVC trở nên phổ biến trong trường hợp bệnh lâm sàng do virus. SVC được dùng để chuẩn đoán nhanh nhiều loại virus khác nhau như cytomegalovirus, Herpes Zoster, Mumps (quai bị), Measles (bệnh sởi) và virus hợp bào hệ hô hấp. Trong tất cả các nghiên cứu, kỹ thuật SVC biểu hiện gia tăng tốc độ phân lập virus mà không làm giảm độ nhạy. Kỹ thuật SVC làm giảm thời gian so với kỹ thuật nuôi cấy tế bào thông thường. Kỹ thuật SVC tốn khoảng 36 giờ trong khi kỹ thuật nuôi cấy thông thường cần đến 3-7 ngày cho chuẩn đoán một mẫu quan trọng. Trong 50 mẫu lấy từ 50 bệnh nhân, SVC có thể chuẩn đoán tất cả 24 trường hợp dương tính chuẩn đoán bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang trực tiếp. Ngoài ra, SVC còn chuẩn đoán được thêm 5 trường hợp mà phương phâp miễn dịch huỳnh quang trực tiếp không chuẩn đoán được. Nguyên liệu và phương pháp ¾ Mẫu: TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM CHẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC GIA CẦM BẰNG SHPT - 15 - Dịch não-tủy được lấy từ việc tiêm chích vào thắt lưng 50 bệnh nhân, bao gồm 46 bệnh nhân khoa nhi từ 18 tháng tuổi đến 12 tuổi và 4 người trưởng thành từ 13 đến 40 tuổi. Tất cả các bệnh nhân này đến từ Pondicherry và quận lân cận của Tamil Nadu State. ¾ Dòng tế bào: Tế bào thận lợn (PS-Porcine Kidney) lấy từ trung tâm quốc tế về khoa học tế bào được sử dụng trong nghiên cứu. Tế bào phát triển trong bình nuôi cấy mô plastic và bình Roux ở 37oC. ¾ Dung môi: Eagle’s modified MEM, NEAA, phenol red không có l-glutamine, NaHCO3 và kháng sinh được sử dụng. L-glutamine (3%), NaHCO3, vitamine, glucose (10%), huyết thanh bào thai bò (10%) và hỗn hợp kháng sinh (Penicillin 100U/ml, Gentamicin 4 mg/ml, Streptomycin 100µg/ml, Ciprofloxacin 2mg/ml và Amphoterincin-B5 mg/ml) được thêm vào sau khi Eagle’s modified MEM được hấp. ¾ Shell vials Shell vials hình trụ phần đáy được dát mỏng và tiệt trùng (4.5 cm x 1.5 cm), với lamen đường kính 13mm lấy từ Flow Laboratories, Scotland. Mouse Ascitic Fluid (MAF) và Rabbit IgG FITC kết hợp được dùng cho việc nhuộm đốm CSF và tế bào một lớp trong shell vial. ¾ Controls (Sự thử lại): Virus VNNB gây nhiễm vào tế bào não chuột lấy từ Viện sức khỏe tâm thần và khoa học thần kinh quốc tế (Nation Institute of Mental Health and Neurosciences), Bangalore, nó được gây nhiễm vào não chuột sơ sinh. Rồi sau đó giống được làm thích ứng với dòng tế bào thận lợn trong phòng thí nghiệm. Tế bào thận lợn nhiễm virus VNNB được nhuộm màu bằng kỹ thuật huỳnh quang miễn dịch trực tiếp phù hợp với sự thử lại dương tính với thí nghiệm huỳnh quang miễn dịch trực tiếp trong những mẫu bệnh lâm sàng. TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM CHẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC GIA CẦM BẰNG SHPT - 16 - Shell vial culture positive ¾ Sự tiêu chuẩn hóa Shell vial culture Sau khi nhiễm virus VNNB vào tế bào thận lợn, giống được sử dụng trong sự tiêu chuẩn hóa SVC. Tế bào thận lợn một lớp được phát triển trên lamen của shell vial. Sau khi ly tâm 1000 rpm trong 45 phút, shell vials được ủ tại những thời điểm khác nhau 12h, 24h, 36h và 48h tại nhiệt độ phòng. Tế bào một lớp được cố định lại với acetone lạnh và nhuộm màu bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp. Người ta thấy rằng kết quả sớm nhất là sau 36h ủ. ¾ Phương thức của thử nghiệm Shell vial 1ml tế bào thận (4 x 105 tế bào/ml) trong dung môi phát triển được thêm vào mỗi shell vial và ủ ở 37oC cho tới khi tế bào một lớp hợp dòng được tạo thành. Dung môi phát triển của virus được lấy ra. 300 µl mẫu xét nghiệm được tiêm nhiễm vào shell vial và nhuộm màu bằng kỹ thuật miễm dịch huỳnh quang trực tiếp. Shell vial được đem đi ly tâm 1000 rpm trong 45 phút tại nhiệt độ phòng sau đó thêm 1 ml dung môi bảo quản vào shell vial rồi đem ủ ở 37oC trong vòng 36h. Dung môi bảo quản được lấy ra cẩn thận khỏi shell vial và loại bỏ. Tế bào một lớp được rửa với PBS (pH 7.2) 3 – 4 lần sấy khô và cố định bằng acetone trong 30 phút. Lamen được nhuộm bằng phương pháp miễn dịch huỳnh