Chuyên đề Kỹ thuật tái tổ hợp ADN

Báo cáo chuyên đề KỸ THUẬT TÁI TỔ HỢP ADN TRƯỜNG ĐẠI HỌC BẠC LIÊU KHOA NÔNG NGHIỆP - MÔN DI TRUYỀN ĐẠI CƯƠNG LỚP 2NT1 – TỔ 1 CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN KỸ THUẬT TÁI TỔ HỢP ADN LÀ GÌ?Khái niệm: ADN tái tổ hợp được dùng để chỉ các phân tử ADN được tạo ra từ hai hay nhiều phân đoạn ADN xuất xứ từ các nguồn gốc khác nhau.  Kỹ thuật tái tổ hợp ADN còn được gọi là tạo dòng phân tử (molecular cloning) CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN LỚP 2NT1 – TỔ 1 Kỹ thuật tái tổ hợp ADN được thực hiện như thế nào? Bao gồm 6 bước: 1. Hai loại ADN được ly trích: ADN có chứa gen cần tạo dòng và plasmid của vi khuẩn đóng vai trò của một vector. 2. Cả ADN và plasmid được xử lý với cùng một loại enzyme giới hạn. Enzyme giới hạn tạo ra đầu dính ở plasmid và ADN cần tạo dòng. 3. Đoạn ADN cần tạo dòng được trộn với plasmid. 4. Nhờ enzyme ligase, các base ở đầu dính của plasmid sẽ gắn với các base bổ sung ở đầu dính của ADN tạo thành plasmid tái tổ hợp. 5. Plasmid tái tổ hợp được chèn vào tế bào vi khuẩn. 6. Sự tạo dòng gen. Vi khuẩn có chứa plasmid tái tổ hợp sẽ sinh sản. Khi vi khuẩn tạo thành một dòng tế bào, tất cả các gen của plasmid tái tổ hợp cũng được tạo dòng. Hình 1: tr49 LỚP 2NT1 – TỔ 1 CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN Các enzyme giới hạn Phương pháp điện di Các vector chuyển gen Sự tạo ADN tái tổ hợp Chèn ADN tái tổ hợp vào tế bào chủ CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN NỘI DUNG: LỚP 2NT1 – TỔ 1 Enzym giới hạn là enzym có khả năng nhận biết những đoạn trình tự ADN nhất định và cắt ADN ở ngay thời điểm này hay ở điểm kế cận.   Có 2 đặc tính: - Không cắt các liên kết photphodieste ở đầu tận cùng, thay vào đó là cắt bên trong phân tử ADN. - Chỉ cắt khi nhận ra các trình tự đặc thù (trình tự nhận biết) bao gồm 4 đến 8 nucleotide ( thường là 4 hay 6). CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN LỚP 2NT1 – TỔ 1 Các enzyme giới hạn: (retriction enzyme) 1. Hiện tượng giới hạn: Các phage xâm nhiễm tế bào vi khuẩn và sinh sôi nhờ bộ máy sinh tổng hợp của vi khuẩn. Khi số lượng phage tăng lên hàng triệu bản sao, chúng sẽ phá vỡ tế bào vi khuẩn. Tuy nhiên, trong một số trường hợp tế bào vi khuẩn vẫn nguyên vẹn và phage cũng không sinh sôi. Nguyên nhân là do ADN của phage bị một hệ thống bảo vệ của vi khuẩn tiêu diệt khi vừa mới xâm nhập. Đây chính là hiện tượng giới hạn. CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN LỚP 2NT1 – TỔ 1 Gồm 2 loại enzyme:  Các enzyme giới hạn cắt ADN của phage ở những vị trí chuyên biệt, tạo thành những trình tự có kích thước xác định.  Methylase là enzyme có vai trò gắn nhóm methyl (-CH3) vào base A hoặc C ở vị trí cắt của các enzyme giới hạn. Khi A và C được methyl hoá, enzyme giới hạn không còn nhận biết được vị trí cắt. Nhờ cơ chế này mà ADN của vi khuẩn không bị phá huỷ bởi chính các enzyme giới hạn của chúng. CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN LỚP 2NT1 – TỔ 1 2. Tên gọi: Nguyên tắc: - Chữ thứ nhất viết hoa là chữ đầu tên của giống vi khuẩn từ đó enzyme giới hạn được ly trích. - Chữ thứ hai và thứ ba không viết hoa, ứng với tên loài của vi khuẩn nói trên. - Chữ thứ tư viết hoa để chỉ chủng vi khuẩn sử dụng (nếu có).  - Chữ số La mã chỉ thứ tự enzyme giới hạn được phát hiện ( trong trường hợp nhiều enzyme giới hạn cùng được tìm thấy ở một loài vi khuẩn). ☺Ví dụ tr50: enzyme EcoRI E = giống Escherichia co = loài coli R = chủng RYI3 I = enzyme đầu tiên được tìm thấy ở E.coli CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN LỚP 2NT1 – TỔ 1 3. Phân loại:  Có 3 nhóm chính: - Loại I: Khi enzyme nhận biết được trình tự, nó sẽ di chuyển trên ADN đến cách đó khoảng 1000 -5000nucleotide. - Loại II: Enzyme nhận biết trình tự và cắt ngay vị trí đó. - Loại III: Enzyme nhận biết trình tự và cắt ADN ở vị trí cách đó khoảng 20 nucleotide. Enzyme giới hạn loại II được sử dụng chủ yếu vì nó cắt tại vị trí giới hạn. Thường cắt ở trình tự chiều xuôi – ngược như nhau. VD: EcoRI CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN LỚP 2NT1 – TỔ 1 CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN LỚP 2NT1 – TỔ 1 Bảng 1: Nguồn, trình tự nhận biết và vị trí cắt của một số enzyme giới hạn. (tr51) Phương pháp điện di: (electrophoresis) Phương pháp điện di là quá trình phân tách một hỗn hợp các phân tử ADN nhờ một chất nền cố định (gel) trong một điện trường.  Điện di ADN: - Ở độ pH gần trung tính, ADN tích điện âm nên khi chịu tác động của điện trường chúng sẽ di chuyển về điện dương của điện trường. CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN LỚP 2NT1 – TỔ 1  Điện di ADN Bản gel hoạt động như một giá thể phân tách các đoạn ADN. Các lỗ được tạo ra trong bản gel được xem như các giếng chứa dung dich ADN. Hai loại gel thường được sử dụng trong nghiên cứu ADN là gel polyacrylamide và gel agarose CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN LỚP 2NT1 – TỔ 1 Gel polyacrylamide và gel agarose:  Agarose: Có khả năng phân tách các phân tử AND có chiều dài giữa 70 cặp và 10.000 cặp nucleotide. Không độc  Polyacrylamide: Có độ phân giả cao hơn song chỉ phân tách được các đoạn AND có kích thước từ 6 cặp đến 1000 cặp nucleotide. Rất độc CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN LỚP 2NT1 – TỔ 1 Dung dịch ADN chứa hỗn hợp các đoạn ADN có kích thước khác nhau được đổ vào các giếng trong bản gel. Chất nền gel hoạt động như một tấm sàng (sieve). Các phân tử AND lớn đi qua các lỗ trong bản gel khó khăn hơn và sẽ bị chậm lại so với các phân tử AND nhỏ. CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN LỚP 2NT1 – TỔ 1  Điện di ADN Tốc độ di chuyển phụ thuộc bào kích thước của đoạn ADN, điện thế, thành phần dung dịch đệm, nồng độ của gel và nhiệt độ. CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN LỚP 2NT1 – TỔ 1  Điện di ADN Phương pháp điện di: (electrophoresis) Các đoạn ADN trong gel sẽ được hiện hình dưới tia tử ngoại nhờ một hoá chất có tên là ethidium bromide. Thuốc thử này tạo liên kết nhuộm với các base nitơ và chúng sẽ phát huỳnh quang dưới tác dụng của tia tử ngoại (bước sóng 260 nm), các đoạn ADN hiện hình dưới dạng những vạch màu đỏ cam. Ngoài ra thì còn một phương pháp khác để hiện hình các đoạn ADN trên bản gel điện di đó là phương pháp nhuộm bạc.  Phương pháp nhuộm bạc: Bản gel sau điện di được ngâm vào dung dich AgNO3, ADN sẽ tương tác với AgNO3, khi bổ sung formaldehyt ở pH kiềm, ion bạc chuyển thành bạc nguyên tử, tạo các hạt bạc kết tủa có màu xám, có thể phát hiện dễ dàng. CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN LỚP 2NT1 – TỔ 1 CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN LỚP 2NT1 – TỔ 1 Điện di: Gel được đặc trên giá đỡ, cho vào hộp điện di có dung dich đệm. Dung dịch ADN được cho vào các giếng. Cho điện trường chạy qua gel. CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN LỚP 2NT1 – TỔ 1 Các đoạn ADN sau khi điện di được nhuôm ethidium bromide. Các vector chuyển gen: Muốn chuyển được gen mong muốn từ thể cho sang thể nhận hoặc tách dòng gen, điều cơ bản là cần phải có vật chuyển gen (vector chuyển gen). Vector chuyển gen là phân tử ADN có khả năng mang được gen cần thiết, thường có dạng vòng và có một số đặc tính sau: - Có điểm khởi đầu sao chép (origin of replication) để tự sao chép mà tồn tại độc lập trong tế bào. - Có các đoạn trình tự nhận biết cho enzyme giới hạn rồi để hỡ tạo nơi lắp ráo cho các đoạn gen lạ. - Cos trình tự khởi điểm (promoter). - Có dấu chuẩn chọn lọc cho phép dễ dàng phát hiện nhận biết chúng trong tế bào chủ nhận. Thông thường đó là tính kháng với kháng sinh giúp vi khuẩn có mang vector sống được trên môi trường có kháng sinh. CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN LỚP 2NT1 – TỔ 1 Có nhiều loại vector: plasmid, thực khuẩn thể, cosmid, YAC…Loại vector được chọn sử dụng tùy thuộc vào kích thước của đoạn ADN cần tạo dòng và mục đích tạo dòng.  Plasmid là những đoạn ADN ngắn (2-5 kb), dạngv òng, mạch đôi, nằm ngoài NST, sao chép độc lập với sự sao chép NST của vi khuẩn. Có thể nhận các ADN tạo dòng tới 10 kb.  Thực khuẩn thể (phage) là virus xâm nhiễm và làm phân giải vi khuẩn. Phần lớn các phage được dùng làm vector hiện nay đều bắt nguồn từ phage .Việc dùng phage làm vector có nhiều ưu điểm hơn so với các vector plasmid vì: - Hiệu quả xâm nhiễm của thực khuẩn thể vào tế bào cao hơn nhiều so với chuyển plasmid vào tế bào vi khuẩn. - Kích thước đoạn ADN mà vector có thể tiếp nhận lớn hơn (20 kb) CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN LỚP 2NT1 – TỔ 1 Các vector chuyển gen: CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN LỚP 2NT1 – TỔ 1 Các vector chuyển gen: VD: - Vector plasmid: pBR332 do Bolivar và Rodiguez (1977) thiết kế cho phép mang đoạn ADN dài đến 6 kb. - Phage: M13 thường được sử dụng làm vector tách dòng nó có ADN sợi đơn chứa 10 gen, có kích thước khoảng 6.4 kb, chỉ sâm nhiễm vào E.coli.  Cosmid là vector lai của plasmid và phage, mang các ưu điểm của hai vector: (1) khả năng tự tái bản số lượng lớn của plasmid, (2) có khả năng đóng gói in-vitro như phage. Có khả năng mang các đoạn ADN có kích thước dài đến 35 – 45 kb. CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN LỚP 2NT1 – TỔ 1 Các vector chuyển gen:  Các NST nhân tạo của nấm men (YAC- Yeast Artificiak Chromomes). Ở nấm men các Saccharomces cerevisae các NST muốn nhân đôi và phân ly tốt cần có 3 trình tự là: TEL (telomeric sequence – trình tự đầu cuối của NST), CEN (centromerie sequence – trình tự trung tâm của NST) và ARS ( Autonomous Replicating Sequence – trình tự sao chép tự chủ). YAC cho phép tạo dòng những đoạn NST có kích thước lớn từ 150 – 1000kb. CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN LỚP 2NT1 – TỔ 1 Các vector chuyển gen:  Các vector chuyển gen có các ứng dụng chủ yếu: - Tạo dòng, nhân dòng các đoạn trình tự hoặc gen để tạo nhiều bản sao giống nhau. - Nghiên cứu sự biểu hiện của một đoạn trình tự ADN, hoặc một gen. - Chuyển gen vào tế bào vi sinh vật khác ( vật chủ nhận). - Sản xuất các ARN. - Sản xuất protein được tổng hợp từ gen đã được tạo dòng CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN LỚP 2NT1 – TỔ 1 Sự tạo ADN tái tổ hợp CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN LỚP 2NT1 – TỔ 1 CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN LỚP 2NT1 – TỔ 1 CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN LỚP 2NT1 – TỔ 1 CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN LỚP 2NT1 – TỔ 1 CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN LỚP 2NT1 – TỔ 1 CHƯƠNG V: KỸ THUẬT DI TRUYỀN LỚP 2NT1 – TỔ 1