Chuyển nạp gen vào lục lạp

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẰNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG MÔN: KỸ THUẬT DI TRUYỀN ĐỀ TÀI: CHUYỂN NẠP GEN VÀO LỤC LẠP GVHD: TRẦN THỊ DUNG Thành viên nhóm: Phạm Xuân Khả 61003209 Nguyễn Quốc Duy 61103029 Phan Mỹ Hoàng Mai 61003080 PHỤ LỤC A: BỘ GEN LỤC LẠP I: GIỚI THIỆU II: TIỀM NĂNG B: CÔNG NGHỆ GEN LỤC LẠP I: ƯU ĐIỂM VÀ THÀNH TỰU II: CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN VÀO LỤC LẠP C: KẾT LUẬN D: TÀI LIỆU THAM KHẢO A: GIỚI THIỆU I: Bộ gen của lạp thể lục lạp: Tế bào thực vật bậccao chứa 3 cơ quan di truyền đó là: nhân, ty thể và lạp thể. Mỗi cơ quan tử chứ bộ gen riêng của nó. Di truyền gen ty thể và lục lạp không tuân theo quy luật mendel và thường di truyên theo kiểu đơn bố mẹ cho thế hệ sau. Hiện tại các nhà khoa học tập trung nghiên cứu lạp thể nhất là lục lạp. Ris và Plaut(1962) là những người đầu tiên khám phá ra sự hiện dienj của DNA của lục lạp bằng quan sát dưới kính hiển vi tảo xanh Chlamydomonas moewusii. Bộ gen lạp thể của thực vật bậc cao là phân tử DNA mach vòng có kích thước khoảng 120-165 kilobases(kb) và chứa khoảng 130gen phụ thuộc vào từng giống, trung bình khoàng 150kb( Dyer, 1985). ở trường hợp thuốc lábộ gen lục lạp có kích thước khoảng 160kb chia ra làm 2 vùng lớn và nhỏ . các bản sao của bộ gen hiện diện ở tất cả tế bào và ở các loại plastis khac nhau như tiền-plastid biệt hóa, lục lạp quang hợp, sắc lạp chứa cảotenoidbottj lạp. đặt tính nổi trội của bộ gen plastid là mức bội thể cực cao: tế nào ddwo lá thuốc lá có thể chứ 100 lục lạp, mỗi lục lạp chứa khoảng 100 bản sao của bộ gen plastid. Như vậy có khoảng 10.000 bộ gen plastid/ tế bào. Lạp thể có chứ diệp lục còn gọi là lục lạp làm cho cây có màu xanh. Lục lạp có cấu trúc phức tạp và giữ vai trò quan trong trong quang hợp. lạp thể có màu đỏ or màu vàng gọi là sắc lạp tạo màu ở vỏ hoa và quả, lạp thể không mau hay còn gọi là vô sắc lạp nơi hình thành tinh bột. lục lạp là 1 trong ba dạng lạp thể chỉ có trong các tế bào có chức năng quang hợp ở thực vật. lục lạp thường có hình bầu dục. mỗi lục lạp được bao bọc bởi màng kép, bên trong là khối ơ chất không màu- gọi là chất nên chưa protein ưa nước và các hạt nhỏ. Số lượng lục lạp trong mỗi tế bào không giống nhau, phụ thuộc vào điều kiện chiếu sáng của môi trường và loài. Lục lạp là nơi thwucj hiện chức năng quang hợp quan hợp của tế nào thực vật, tạo ra năng lượng cho tế bào thực vật. Dưới kính hiển vi điện tử ta thấy mỗi hạt grana nhỏ có dạng như 1 chồng tiền xu gồm các túi dẹp( gọi là tilacoit). TRên bề mặt của màng có hệ saccws tố và các hệ ez sắp xếp 1 cách trật tự tạo thành vô số các đơn vị cơ swor dnagj hạt hình cầu, kích thước từ 10-20nm gọi là đơn vị quang hợp.trong lục lạp có chứa nhiều AND và riboxom nên có khả năng tổng hợp protein cần thiết cho mình. Lục lạp chứa nhiều ez chứng tỏ có nhiều phản ứng trao đổi chất khac nhau xảy ra trong đó. Những ez này là: invectaza, amilaza, proteaza, catalaza, cũng như những phức hợp ez thực hiện phản ứng Hill fotforin hóa hợp, sự tổng hợp lien kết peptit, những lien kết axit béo và sự tổng hợp photpho, lipit Lục lạp không chỉ là bộ máy quang hợp hoàn chỉnh mà có cả hệ thống tổng hợp pr0tein riêng. Màng lục lạp trao đổi chất và chuyên hóa sinh chất giữa chất nền với tế bào chất, và ngay cả những thông tin di truyền dưới dạng DNA lạp thể. Hiện nay, các nhà khoa học đã giãi maz trình tự DNA bộ gen plastid của khoảng hơn 100 giống cây. Ví dụ: giống địa tiền( liverwort) 121.024bp, thuốc lá 155.939bp, ngô 140.387 bp, khoai tây 155.371bp, bèo tấm 165.955bp.. Hình: cấu trúc hoàn chỉnh bộ gen lục lạp thuốc lá ( Shinozaki et al., 1986) Bộ gen có kích thước 155,939 bp bao gồm 1 đoạn bản sao lớn (LSC) có kích thước 86,684 bp và 1 đoạn bảo sao nhở kích thước 18,482 bp( SSC) và có đoạn lặp lại kích thước của mỗi đoạn 25,339 bp và bao gồm các gen II: Tiềm năng công nghệ gen lục lạp: Công nghệ gen lục lạp đã trên 20 năm nghiên cứu và phát triển. thành công ban đầu chủ yếu thu nhận được những dòng thuốc lá chuyển gen lục lạp và cây họ cà. Ngày nay, công nghệ gen lục lạp được nghiên cứu thành công ở nhiều cây trồng quan trọng khác. Cùng với những ưu điểm như mức độ biểu hiện gen cao dẫn đến biểu hiện protein tái tổ hợp cao, tính di truyền theo mẹ( thân thiện với môi trường), ddnhj hướng chính xác gen chuyển nạp, có thể loại bỏ được gen chọn lọc kháng kháng sinh, có thể chuyển các gen có nguồn gốc tiền nhân, và có khả năng chuyển đồng thời nhiều gen( cassette gến). vì vậy, công nghệ gen lục lạp có nhiều triển vọng trong việc khắc phục nguy cơ lan truyền gen từ các cây chuyển gen sang cây trồng ngoài tự nhiên, tạo ra giống cây trồng có các tính trạng nông học quan trọng như kháng sâu, côn trùng, kháng chất diệt cỏ và chống chịu ngoại cảnh bất lợi.. Những năm gần đây công nghệ gen vào lục lạp đã thu được nhiều kết quả quan trọng trong chuyển gen lục lạp tạo ra các kháng nguyên tái tổ hợp cho phép sản xuất vắc xin và protein tái tổ hợp chữa bệnh cho người và động vật trong lục lạp. vì vậy, công nghệ gen lục lạp trở thành công cụ đầy triển vọng trong sản xuất vác xin ăn được nói riêng và trong sản suất dược liệu.. B: công nghệ gen lục lạp: Lục lạp là nơi xảy ra quá trình quang hợp của thực vật, lục lạp có hệ gen riêng và có cấu trúc phân tử mạch vòng sợi đôi DNA. Mặc dù kích thước nhỏ hơn so với hệ gen nhân tế nào, DNA lục lạp chiếm khoảng 10-20% tổng số DNA của tế bào và chứa khoảng 120-130 gen. I: Những ưu điểm và thành tựu của công nghệ gen lục lạp: Sự phát triển của nghiên cứu di truyền gen lục lạp, trong giai đoạn đầu, ở đối tượng tảo xanh Chlamydomonas reinhardii và thuốc lá Nicotiana tabacum dẫn đến các nghiên cứu ở lĩnh vực chuyển gen vào lục lạp sau đó và mở ra tiềm năng vô cùng to lớn trong lĩnh vực công nghệ sinh học trong tương lai. Công nghệ lục lạp mang lại nhiều ứng dụng đặt biệt trong công tác cải thiện giống cây trồng: tạo ra các giống cây cây kháng virus, nấm, vi khuẩn, côn trùng và kháng thuốc diệt sâu, diệt cỏ;biến đổi các gen lien quan đến quang hợp làm tăng năng suất cây trồng: chuyển gen cố định nitrogen vào lục lạp tạo ra lạp thể quang hợp ở ban ngày và cố định đạm vào ban đêm: chuyển gen tạo tinh bột làm tang hàm lượng tinh bột và giảm nồng độ đường trong cây: chuyên gen mã hóa protein vào lục lạp để tạo ra cây chuyển gen giàu chất dinh dưỡng, vitamins. Công nghệ gen lục lạp đã và đang được ứng dụng trong ngành dược phân tử tạo ra vắc xin và protein tái tổ hợp trong phòng và điều trị bệnh cho người và động vật. công nghệ chuyển nạp gen lục lạp có tiềm năng rất to lớn và có nhiều ưu điểm nổi trội hơn so với chuyển gen vào nhân tế nào như sau: Có kiểu di truyền mẹ( meternal inheritance): đặc điểm di truyền gen chuyển theo kiểu di truyền mẹ ở hầu hết thwucj vật bật cao, ngoại trừ 1 số ít loài như có linh lăng, lúa, đậu Hà lan ở trường hợp chuyển gen vào nhân, có thể có sự giao phấn ở các đối tượng khác. Nhờ ưu điểm này mà từ năm 1998 các nhà khoa học đã khuyến cáo việc ngăn chặn sự lan truyền của các gen chuyển nạp bằng công nghệ chuyển nạp gen vào lục lạp thực vật. Mức độ biểu hiện gen chuyển nạp cao: trong 1 tế nào có hang trăm lục lạp, mỗi lục lạp chứ khoảng 100 bản sao của bộ plastid, và như vậy có khoảng 10.000 bộ gen plastid/ tế bào( Maloga,1993). Chính vì vậy mà mức độ biểu hiện của gen chuyển nạp rất cao khoảng 5% gen GFP ở các dòng khoai tây chuyện nạp gen( Sidorov et al.,1999), 5% gen Bt. Hàm lượng protein mục tiêu có thể lên đến 50% trên tổng số protein hòa tan ở trường hợp cây cà chua chuyển nạ gen lạp thể ( RUf et al., 2001). Gần đây, Wurbs và đồng tác giả ( 2008) đã chuyển thành công gen HIV-1 p24 vào cây cà chua, mức biểu hiện protein p24 là 40%. Như vậy, công nghệ chuyển gen lục lạp cho phép san suất ra được các loại protein tái tổ hợp có giá trị từ thực vật. Vị trí gắn đặt hiệu( Site-specific integration): ảnh hưởng của hiệu ứng vị trí trên cự biểu hiện của gen chuyển nạp; không có hiệu ứng vị trí ở plastid do gen tích hợp vào vị trí đặt hiệu thông qua hiện tượng tái tổ hợp tương dồng( homologous recombibation event). Các dòng chuyển gen lục lạp thường đồng nhất( homoplasmic). Sự đồng nhất thường nhận được qua sự chọn lọc nghiêm ngặt.. Ở trường hợp chuyển gen vào nhân, sự tích hợp ngẫu nhiên của gen chuyển nạp ở nhiễm sắc thể thường dẫn đến sự hình thành các mực biểu hiện khác nhau, các dòng chuyện gen thường mang tính đồng hợp hay dị hợp nhận được qua sự tự thụ phâns hoặc lai hữu tính. Như vậy sự biểu hiện gen đồng nhất ở các dòng chuyển nạp gen lục lạp. Ngược lại ở trường hợp chuyển gen vào nhân, sự biểu hiện gen chuyển có sự biến thiên cao. Biểu hiện đa gen( Multiple gene expression): chuyển gen vào lục lạp không ghi nhận hiện tượng gen im lặng . sự im lặng của gen chuyển nạp thường làm giảm hoặc lọa trừ sự biểu hiện gen chuyển nạp vào nhân tế bào. Độc tính protein của gen chuyển: có thể giảm thiểu bởi sự phân ngăn của lục lạp. Ở trường hợp chuyển gen vào nhân, protein được tích lũy ở tế bào chất, điều này có thể gây ra ảnh hưởng đa hướng. ở lục lạp, có sự hình thành nối lien kết disulfide bond. điều này làm cho lục lạp là nơi lý tưởng sản suất các loại vắc xin,dược phẩm, kháng thể, kháng nguyện tái tổ hợp và như vậy cây chuyển gen lục lạp được xem như là nhà máy sinh học tương lai. II: các phương pháp chuyển gen vào lục lạp: Như chúng ta đã biết, cấu tạo của lục lạp có màng đôi chính cơ chế vật lý đã làm vật cản cho sự chuyển nạp DNA vào lục lạp. Vì vậy, virus và vi khuẩn rất khó thâm nhập vào lục lạp. Năm 1985, De Block và đồng tác giả báo cáo lần đầu tiên về chuyển gen lục lạp vào mô tế bào thuốc lá bằng phương pháp gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterrium tumefaciens. Các tác giả đã nhận được 1 số dòng chuyển gen CAT( chloramphenicol acetyl transferase). Phân tích Southern blot cho thấy gen CAT xâm nhập vào bộ gen lục lạp cây thuốc lá không ổn định và bền vững. Hiện nay, các nhà khoa học nghiên cứu và phát triển nhiều phương pháp chuyển gen vào lcuj lạp bao gồm: phương pháp bắn gen( biolistics), dung hợp tế nào trần bằng polyethylene glycol( PEG), phương pháp vi tiêm ( sử dụng micropipette đẻ tiêm DNA vào lục lạp. Phương pháp bắn gen: Phương pháp bắn gen được gọi với nhiều thuật ngữ như biolistic, bombardment. Đây là phương pháp chuyển gen trực tiếp vào cây trồng. kỹ thuật biolistic do John Stanford ở đại học Cornell phát minh. Đây là phương pháp rát hiệu quả dung để chuyển DNA là vào tế bào cây trồng( Cao etal., 1990). Hiện nay có 2 loại thiết bị bắn gen khác nhau: thiết bị ban đầu sử dụng là bộ phận cung cấp năng lượng giống như khẩu súng, gây nổ bằng 1 kim lửa tên thương phâm Biolistic PDS-100, Dupont Company, wilmintong, DE; thiết bị thứ 2 hoạt động theo nguyên tắc phóng điện, DNA phủ lên các hạt vàng cực mịn( Christou et al., 1988) với thuật ngữ” DNA- coated gold particles ). Thành công đầu tiên trong kỉ thuật chuyển gen lục lạp được Boyuton và đồng tác giả (1988) thwucj hiện trên đối tượng tảo xanh bằng phương pháp bắn gen. năm 1990, Svab và đồng tác giả đã nhận được các dòng thuốc lá chuyển gen 16S ribosom RNA kháng 2 loại kháng sinh là spectinomycin và treptomycin.. cho đến nay, pp bắn gen vào lục lạp đã được tiến hành thành công ở thuốc lá, cà chua, cà tím, khoai tây,các cây họ cải.. Nguyên lý chung của pp này là sử dụng áp lực của xung khí helium đẻ đẩy các viên đạn có kích thước nhỏ mang gen mong muốn ( thường là au, tungsten, titanium or volfram) xuyên qua các lớp tế bào, mô để xâm nhập vào genome thực vật Ưu điểm + nhược điểm: + có thể chuyển nhiều gen vào tế bào và mô, bắn 1 lần được nhiều tế bào, quá trình chuyển gen nhanh, thao tác đơn giản, các vector mang gen tái tổ hợp đươn giản và chỉ cần 1 lượng vector nhỏ. + đòi hỏi thiết bị đắt tiền, có thể gây ra sự xáo trộn trâtj tự của đối tượng chuyển gen, tấn số biến nạp ổn định thấp. Phương pháp PEG: Là pp sử dụng polyethylene glycol( PEG) đã được áp dụng làm yếu tố dung hợp trong việc lai tế bào soma của nhiều loài động vật và thực vật.nó có hiệu quả tương đương với kỹ thuật chuyển DNA vào tế bào trần. trong pp PEG, gen lạ được chuyển vào tế bào trần dưới dạng plasmid DNA, cho kết quả phục hồi tốt vs các cây tái sinh của thuốc lá. O’Neill vjà đồng tác giả đã thành công và nhận được các dòng thuốc lá chuyển nạp gen 16S rRND kháng 2 lọa kháng sinh Spectinomycin và streptomycin.năm 1996, koop và đồng tác giả đã chuyển gen tổng hợp từ vi khuẩn gen aadA kháng spectinomycin và streptomycin thành công vào lục lạp bằng pp PEG. Ưu điểm của pp PEG rẻ tiền hơn so với pp bắn gen, nhưng thời gian chọn lọc tốn kếm nhiều hơn và tần số chuyển gen thường thấp hơn pp bắn gen./ Ưu nhược điểm: +: Hiểu quả chuyển gen cao, ổn định nếu quá trình biến nạp thành công, không đòi hỏi thiết bị đắt tiền. +: tấn số chuyển gen rất thấp do ko kiểm soát được quá trình chuyển gen, dễ xảy ra hiện tượng dung hợp TB trần, gây khó khan trong việc phân tích biểu hiện gen, tái sinh tế bào trận sau chuyển thì khó khăn. Phương pháp vi tiêm( microinjection) : Sử dụng micropopette để tiêm dung dịch DNA là vào tế bào trần dưới áp lực cao, tạo ra cây chuyển gen. Phương pháp này đơn giản nhưng còn nhiểu vấn đề tranh luận, cần tiếp tục hoàn thiện. Nguyên tắc: dung 1 lượng nhỏ DNA tiêm trực tiếp vào nhân của tế bào 1 cách cơ học dưới kính hiển vi. Cho phép đưa gen vào đúng vị trí mong muốn ở từng tế bào với hiệu quá tương đối cao. Ưu nhược điểm: +: có thể tối ưu lượng DNA đưa vào tế bào, quyết định được đưa DNA vào loại tế bào nào, có thể đưa 1 cách chính xác thậm chí vào tận nhân và có thể quan sát được, có thể nuôi riêng lẻ các tế bào vi tiêm và biến nạp được vào mọi giống cây +: mỗi lần tiêm chỉ dc 1 phát tiêm và chỉ 1 tế bào, cần dung các thiết bị có độ chính xác cao và cần kỹ năng phức tạp của người sử dụng Hình: mô tả phương pháp vi tiêm chuyển gen vào lục lạp. C: KẾT LUẬN CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN NÀY VÀO LỤC LẠP NHẰM TẠO RA 1 GIỐNG MỚI CÓ NĂNG SUẤT VÀ CHẤT LƯỢNG TỐT HƠN ĐỂ PHỤC VỤ NHU CẦU CỦA CON NGƯỜI VÀ ĐỒNG THỜI LÀM HOÀN THIỆN HƠN CÁC LOẠI GIỐNG CÂY TRỒNG ĐÓ D: TÀI LIỆU THAM KHẢO Giáo trình: công nghệ gen trong nông nghiệp- Trần Thị Lệ ( chủ biên) Biểu hiện gen HIV-1 p24 ở cây thuốc lá chuyển gen lục lạp- Phan Tường Lộc, Nguyễn Hữu Hổ, ( Viện sinh học nhiệt đới, viện khoa học và công nghệ Việt Nam)