Đánh giá ảnh hưởng cấp và bán cấp của chế phẩm GHA lên hệ tim - Mạch trên động vật thực nghiệm

mục lục các chữ viết tắt được sử dụng 1 TóM TắT Đề TàI 2 tính sáng tạo, ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3 i. Đặt vấn đề 4 II. Tổng quan 6 2.1. Huyết áp, các yếu tố ảnh hưởng đến huyết áp động mạch 6 2.2. Quan điểm của y học hiện đại về bệnh tăng huyết áp 7 2.3. Biện chứng luận trị bệnh tăng huyết áp của y học cổ truyền 8 2.4. Tổng quan một số vị thuốc trong bài thuốc GHA 9 III. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 13 3.1. Đối tượng nghiên cứu 13 3.2. Chất liệu nghiên cứu và liều dùng 13 3.3. Phương pháp nghiên cứu 14 IV. Kết quả nghiên cứu và bàn luận 19 4.1. Kết quả nghiên cứu độc tính cấp (LD50) của chế phẩm GHA 19 4.2. Kết quả nghiên cứu độc tính bán cấp của chế phẩm GHA 20 4.3. ảnh hưởng của thuốc GHA lên một số chỉ số tim mạch trên động vật thực nghiệm cấp và bán cấp 23 V. Kết luận 31 Vi. Kiến nghị 31 tài liệu tham khảo 32 các chữ viết tắt được sử dụng Viết tắt Viết hoàn chỉnh ECG: Điện tim HA: Huyết áp HATTh: Huyết áp tâm thu HATTr: Huyết áp tâm trương n: Số lượng SD: Độ lệch chuẩn Tg: Thời gian : Giá trị trung bình YHCT: Y học cổ truyền YHHĐ: Y học hiện đại Tóm tắt đề tài Nghiên cứu độc tính cấp, bán cấp và tác dụng của chế phẩm GHA lên hệ tim mạch được tiến hành trên 60 chuột nhắt trắng, 23 thỏ và 15 ếch. Kết quả nghiên cứu cho thấy: - Chưa tìm được LD50 của chế phẩm thuốc GHA dạng cao lỏng 1/1 bằng đường uống trên chuột nhắt trắng, chứng tỏ thuốc rất ít độc. - Thuốc không ảnh hưởng đến các chỉ số huyết học và hoá sinh máu đánh giá chức năng gan, có tác dụng cải thiện chức năng thải độc của thận ở thỏ thực nghiệm. - Chế phẩm GHA dạng cao lỏng 1/1 uống một lần liều 4ml/kg trong thí nghiệm cấp và liều 3ml/kg liên tục 21 ngày trong thí nghiệm bán cấp đều có tác dụng làm hạ HA mà không ảnh hưởng lên nhịp tim và điện tim thỏ thực nghiệm. - Trong thí nghiệm tiếp lưu trên ếch và trên tai thỏ cô lập cho thấy chế phẩm GHA có tác dụng làm giãn cơ trơn thành mạch. tính sáng tạo, ý nghĩa khoa họcvà thực tiễn của đề tài 1. Bằng phương pháp khoa học hiện đại đã chứng minh được tác dụng và cơ chế tác dụng của bài thuốc nguồn gốc thảo mộc,góp phần hiện đại hoá y học cổ truyền. 2. Chế phẩm thuốc GHA rất ít độc và có tác dụng hạ huyết áp trên động vật thực nghiệm. Vì vậy nếu được thử nghiệm trên lâm sàng sẽ hứa hẹn trở thành bài thuốc điều trị tăng huyết áp đạt hiệu quả cao, giá thành rẻ, nguyên liệu dễ kiếm, dễ sử dụng. 3. Kết quả nghiên cứu của đề tài có thể làm tài liệu tham khảo cho các nghiên cứu khác liên quan đến điều trị bệnh tăng huyết áp. i. Đặt vấn đề Các bệnh tim mạch, đặc biệt là bệnh tăng huyết áp (HA) đang là mối đe doạ rất lớn đối với sức khoẻ của nhân dân các nước trên thế giới, là nguyên nhân gây tàn phế và tử vong hàng đầu đối với những người lớn tuổi ở các nước phát triển. Tỷ lệ bệnh tăng HA ở các nước này chiếm từ 10-15% dân số. Tại Việt Nam, theo điều tra của Trần Đỗ Trinh (1990) ở 4,6 triệu người trên 15 tuổi, có 11,5% tăng HA. Phạm Gia Khải và cộng sự (2001) điều tra 1138 cán bộ công nhân viên chức, thấy có 264 người bị tăng HA, chiếm tỉ lệ 23%. Bệnh tăng HA tiến triển lâu ngày sẽ làm tổn thương các mạch máu, ảnh hưởng xấu đến nhiều cơ quan như tim, não, thận… và dễ gây nên những biến chứng hết sức nặng nề như chảy máu não, suy tim… Tình trạng đó đã gây ảnh hưởng không nhỏ cho thu nhập và sức khoẻ của người lao động. Điều trị bệnh tăng HA theo y học hiện đại đã có những thành công nhất định. Tuy nhiên kết quả điều trị không duy trì được lâu, bệnh thường tái phát khi ngừng thuốc, hơn nữa các thuốc tân dược thường có tác dụng phụ ảnh hưởng đến sức khoẻ của bệnh nhân [10]. Theo y học cổ truyền, tăng HA đã được mô tả rất lâu đời (Hoàng Đế - Nội kinh) trong phạm trù “huyễn vựng” , “đầu thống”, “ can phong”, “can hoả”. Y học cổ truyền đã có nhiều bài thuốc cổ phương, nghiệm phương và gia truyền để điều trị chứng huyễn vựng. Tại Trung Quốc đã có hàng trăm chế phẩm và thương phẩm y học cổ truyền để điều trị bệnh tăng HA [11], [15], [16]. ở Việt Nam đã có một số bài thuốc điều trị bệnh tăng HA theo Y học cổ truyền, tuy nhiên chưa có chế phẩm thuốc hạ áp nào có nguồn gốc thảo mộc được đánh giá đầy đủ về tính an toàn và tính hiệu quả. Trên cơ sở kết hợp biện chứng luận trị chứng “huyễn vựng” theo y lý cổ truyền và cơ chế bệnh sinh của y học hiện đại, Bộ môn - Khoa Y học cổ truyền, Bệnh viện 103 đã tiến hành nghiên cứu chế phẩm dạng cao lỏng của bài thuốc “GHA” từ 16 vị thuốc thảo mộc. Theo quy chế đánh giá tính an toàn, tính hiệu quả của chế phẩm thuốc mới trước khi đưa vào điều trị lâm sàng của Bộ Y tế (1993), chúng tôi tiến hành nghiên cứu chế phẩm thuốc trên động vật thực nghiệm. Mục tiêu của đề tài: 1. Xác định độc tính cấp và bán cấp của chế phẩm GHA trên động vật thực nghiệm. 2. Đánh giá ảnh hưởng cấp và bán cấp của chế phẩm GHA lên hệ tim - mạch trên động vật thực nghiệm. II. Tổng quan 2.1. Huyết áp, các yếu tố ảnh hưởng đến huyết áp động mạch. HA là áp lực của máu trong một đoạn mạch nhất định, nó là kết quả của hai yếu tố chính: cung lượng tim và sức cản ngoại vi[3]. 2.1.1. Cung lượng tim: Cung lượng tim được xác định bằng thể tích tống máu cuối thì tâm thu nhân với tần số tim [3], [8]. - Thể tích tống máu tâm thu phụ thuộc vào thể tích máu cuối thì tâm trương ở thất trái và sức bóp của thất trái. - Thể tích máu cuối thì tâm trương phụ thuộc vào thể tích máu toàn bộ và hoạt động của hệ tĩnh mạch ngoại vi. - Thể tích máu toàn bộ phụ thuộc vào thể tích huyết cầu và thể tích huyết tương. - Hoạt động của hệ mạch ngoại vi phụ thuộc vào các thụ cảm thể a-adrenergic, khi kích thích các thụ cảm thể này sẽ gây co mạch. - Tần số tim và sức bóp cơ tim phụ thuộc vào thụ cảm thể b1-adrenergic, khi kích thích sẽ làm tăng nhịp tim, tăng sức co bóp cơ tim . 2.1.2. Sức cản ngoại vi: Sức cản ngoại vi phụ thuộc vào độ nhớt của máu và tình trạng của tiểu động mạch [3], [8]. Tiểu động mạch giãn làm giảm sức cản ngoại vi, chẳng hạn khi kích thích các thụ cảm thể b2 - adrenergic, khi tăng các chất giãn mạch như bradykinin, prostaglandin (PGA, PGE); tiểu động mạch co làm tăng sức cản ngoại vi như khi kích thích các thụ cảm thể a - adrenergic, khi tăng catecholamin máu, khi hoạt hoá hệ renin - angiotensin [3],[8]. 2.2. Quan điểm của y học hiện đại về bệnh tăng huyết áp. Theo hằng số sinh học người Việt Nam; người trưởng thành có HA tâm thu (HATTh) trong giới hạn 90-140 mmHg, HA tâm trương (HATTr) trong giới hạn 60-90 mmHg. Nếu HATTh ³ 140 mmHg và/ hoặc HATTr ³ 90 mmHg là tăng HA [10], [17]. 2.2.1. Cơ chế bệnh sinh của tăng HA: Các nhà sinh lý và lâm sàng tim mạch đã cố gắng nghiên cứu tìm hiểu để giải thích cơ chế bệnh sinh của tăng HA nguyên phát, một số yếu tố đã được công nhận, song còn nhiều điều chưa sáng tỏ. Đến nay, các nhà khoa học đều thừa nhận tăng HA có liên quan đến: [2], [8], [18]. - Vai trò của hệ thần kinh giao cảm: ảnh hưởng đến cung lượng tim và sức cản ngoại vi. - Vai trò của hệ renin - angiotensin - aldosteron (hệ RAA): kiểm soát lượng máu lưu hành. - Các chất nội sinh điều hoà mạch như: oxyt nitric, các endothelin, các kinin, sự thay đổi chức năng của thụ cảm thể áp lực, cơ thể bị giảm chất điều hoà HA CGRP (calcitonin gene relaxted peptid) cũng là yếu tố gây tăng HA và quá trình tự vữa xơ. - Vai trò của yếu tố di truyền: có nhiều giả thuyết cho rằng đây là bệnh lý do đa gen quy định và chịu ảnh hưởng bởi yếu tố môi trường. Các yếu tố trên tác động đến khối lượng máu lưu hành và thành mạch (giai đoạn đầu gây co thắt các tế bào cơ trơn ở thành động mạch, giai đoạn sau gây phì đại tế bào cơ trơn thành mạch, dẫn đến tăng sức cản ngoại vi). 2.2.2. Điều trị: Ngoài điều trị nguyên nhân, việc điều trị tăng HA cần chú ý đến chế độ làm việc, ăn uống, rèn luyện thân thể tự thích nghi, tự điều chỉnh giữ HA ổn định [10]. Trong điều trị tăng HA, các thuốc sau đây thường được xem xét và sử dụng cho phù hợp với từng bệnh nhân và mức độ bệnh [7],[10]. - Nhóm thuốc lợi tiểu: Furosemid, Hypothiazid, Indapamid… - Nhóm thuốc ức chế hoạt động của hệ thần kinh giao cảm: Reserpin, Alphamethyl-dopa, Clonidin, Prazosin, Propranolol, Acebutolol… - Nhóm thuốc làm giãn mạch: Hydralazin, Verapamil, Nifedipin. - Nhóm thuốc ức chế men chuyển: Captopril, Benazepril Enalapril, Perindoprol… - Nhóm thuốc đối kháng các thụ cảm thể của angiotensin II: Losartan, Irbesartan… Các thuốc trên còn một vài tác dụng phụ, hiệu quả điều trị không duy trì lâu dài sau khi ngừng thuốc[1]. 2.3. Biện chứng luận trị bệnh tăng Huyết áp của y học cổ truyền. 2.3.1. Nguyên nhân và cơ chế bệnh sinh: Y học Cổ truyền(YHCT) không có bệnh danh tăng HA mà từ lâu đã mô tả trong các phạm trù “Huyễn vựng”, “Đầu thống”, “Can phong”, “Can hoả” tức là đau đầu, hoa mắt, mặt đỏ, tai ù, hồi hộp đánh trống ngực. Các triệu chứng này tương đương với triệu chứng của bệnh tăng HA theo quan điểm YHHĐ. Về cơ chế bệnh sinh YHCT cho rằng chủ yếu là do rối loạn khí huyết âm dương của hai tạng Can và Thận. Nguyên nhân chủ yếu là do tinh thần căng thẳng kéo dài, hay cáu gắt, giận dữ, ăn uống không điều hoà, làm việc quá sức sẽ tổn thương đến tỳ, vị và rối loạn chức năng tạng phủ, thường có biến chứng não gọi là “Trúng phong”[6]. 2.3.2. Một số bài thuốc điều trị: Nguyên tắc điều trị cơ bản là điều hoà khí huyết, điều hoà âm dương của hai tạng can và thận. Kiện tỳ, an thần, chế độ làm việc, nghỉ ngơi, ăn uống hợp lý. Trong khi vận dụng pháp trị lâm sàng có thể dùng độc pháp có thể phối hợp các phương pháp khác nhau, phải linh hoạt sử dụng tuỳ theo diễn biến kết quả lâm sàng [4]. Một số bài thuốc: [4], [11], [16]. Bài thuốc 1: cỏ nhọ nồi, cỏ xước, măng vòi, lá bạc hà, nước vo gạo. Bài thuốc 2: bạch truật, đẳng sâm, hạt sen, ý dĩ, tâm sen, đăng tâm, xương bồ, hạt muồng, ngưu tất, hoài sơn. Bài thuốc 3: bán hạ chế, trần bì, tinh tre, hạ khô thảo, tỳ giải, rễ cỏ tranh, thảo quyết minh, hoè hoa, ngưu tất. 2.4. Tổng quan một số vị thuốc trong bài thuốc GHA. 2.4.1. Thành phần của chế phẩm “GHA” * Hoa Kim ngân: Flos Lonicerae. Tính vị: ngọt, lạnh. Tác dụng: thanh nhiệt giải độc, sơ tán phong nhiệt, phổ kháng khuẩn rộng, có tác dụng ức chế liên cầu khuẩn, trực khuẩn lỵ… ức chế bệnh do vi rút gây nên, có tác dụng chống viêm, giải độc, giảm cholesterol máu. Chỉ định: điều trị mụn nhọt giai đoạn đầu, sưng nóng đỏ da,viêm ruột thừa cấp, viêm phổi [5], [12], [15]. * Rễ Huyền sâm: Radix Sirophulariae. Tính vị: đắng, ngọt, mặn, hàn. Tác dụng: có tác dụng hạ huyết áp, giảm đường máu mức độ nhẹ. Ngoài ra có tác dụng giãn mạch, tăng cường tuần hoàn cục bộ, dùng để điều trị viêm tắc động tĩnh mạch. Chỉ định: chứng ôn bệnh nhập doanh gây sốt cao về đêm, tâm phiền, miệng khát, lưỡi hồng giáng, mạch sác thường dùng cùng sinh địa [5], [12], [15]. * Thân Rễ Đại hoàng: Rhizoma Rhei. Tính vị: đắng, lạnh. Tác dụng: tả ha công tích, chỉ huyết, giải độc, hoạt huyết khứ ứ. Tăng cường nhu động ruột, ức chế hấp thu nước ở đại tràng. Ngoài ra còn có tác dụng kiện vị, lợi mật, hạ HA, cầm máu, giảm cholesterol máu. Chỉ định: chứng bệnh ôn nhiệt, nhiệt kết tiên bí, sốt cao không giảm. Điều trị lý thực nhiệt gây táo bón kéo dài [5], [12], [15]. * Rễ Phòng kỷ: Radix Stephaniae. Tính vị: đắng, cay, hàn. Tác dụng: khứ phong thấp, chỉ thông, lợi thuỷ chỉ thũng, giảm đau, hạ sốt, tiêu viêm, chống quá mẫn, lợi niệu, giảm HA. Chỉ định: chứng phù thũng toàn thân, tiểu tiện ít. Điều trị thấp nhiệt ủng trệ, bụng chướng có dịch [5], [12], [15]. * Lá Thạch vĩ: Folium Pyrrosiae. Tính vị: đắng, ngọt, hơi hàn. Tác dụng: lợi niệu, thông lâm, thanh phế, chỉ khái. Chỉ định: điều trị thấp nhiệt lâm chứng, thường dùng với sa tiến tử, hoạt thạch [5], [12], [15]. * Vỏ Nhục quế: Cortex Cinamomi. Tính vị: cay, ngọt, nóng. Tác dụng: ôn kinh thông mạch, giãn huyết quản, tăng cường tuần hoàn vành và tuần hoàn não, giảm trợ trệ huyết quản, chống tụ tập tiểu cầu. Chỉ định: điều trị thận dương bất túc, mệnh môn hoả suy gây liệt dương [5], [12], [15]. * Rễ Đan sâm: Radix Salviae Miltiorrhizae. Tính vị: đắng, hơi hàn. Tác dụng: hoạt huyết điều kinh, lương huyết tiêu ung, an thần, giãn động mạch vành tăng lưu lượng tuần hoàn vành, cải thiện thiếu máu cơ tim, điều chỉnh nhịp tim, giãn mạch ngoại vi, chống ngưng kết, ức chế tụ tập tiểu cầu, ức chế hình thành cục máu đông, giảm mỡ máu. Chỉ định: điều trị phụ nữ kinh nguyệt không đều, điều trị mụn nhọt sưng đau, thường dùng cùng với ngân hoa, liên kiều [5], [12], [15]. * Rễ Ngưu tất: Radix Achyranthis Bidentatae. Tính vị: đắng, ngọt. Tác dụng: hoạt huyết thông kinh, bổ can thận cương cân cốt, lợi niệu thông lâm, thực nghiệm trên chuột thấy có tác dụng giảm viêm các khớp và làm giảm sưng nề. Ngoài ra có tác dụng hạ HA, lợi niệu. Chỉ định: điều trị các chứng ứ huyết trở trệ gây kinh bế, điều trị can thận hao hư gây đau lưng mỏi gối. Điều trị đau đầu, hoa mắt , mắt đỏ [5], [12], [15]. * Mẫu lệ (Vỏ con Hà): Concha Ostreae. Tính vị: mặn, sáp, hơi hàn. Tác dụng: bình can tiềm dương. Chỉ định: điều trị chứng can dương thượng cang, đau đầu chóng mặt [5], [12], [15]. * Rễ Hoàng kỳ: Radix Astragali. Tính vị: ngọt, hơi ôn. Tác dụng: bổ khí thăng dương, lợi niệu tiêu thũng, lợi niệu, chống lão suy, hạ HA. Chỉ định: điều trị tỳ vị khí hư, khí đoản, ăn ít, đại tiện lỏng nát, tứ chi mệt mỏi [5], [12], [15]. * Rễ Đương quy: Radix Angelicae Sinensis. Tính vị: ngọt, cay, ấm. Tác dụng: bổ huyết, hoạt huyết, điều kinh, nhuận tràng, giảm tụ tập tiểu cầu, chống lại sự đông máu, tăng cường sản sinh hồng cầu, giảm thiếu máu cơ tim, giãn mạch, cải thiện tuần hoàn ngoại vi, giảm mỡ máu. Chỉ định: điều trị tâm can huyết hư, chóng mặt, hồi hộp [5], [12], [15]. * Rễ Bạch thược: Radix Paconiae Alba. Tính vị: đắng, chua, ngọt, hơi hàn. Tác dụng: dưỡng huyết, điều kinh, bình can, giảm co quắp, ức chế co thắt cơ trơn tử cung, đại trường, trấn tĩnh, giảm đau, giãn mạch, hạ HA. Chỉ định: điều trị chứng huyết hư, âm hư nội nhiệt [5], [12], [15]. * Vỏ quả Ngũ vị tử: Fructus Schisandrae. Tính vị: chua, ngọt, ẩm. Tác dụng: liễm phế, tư thận, an thần, giảm ho, tiêu đàm, giảm HA, lợi đờm, bảo vệ tế bào gan, ức chế một số loại trực khuẩn kể cả trực khuẩn mủ xanh. Chỉ định: điều trị phế thận lưỡng hư, dùng trong chứng tiêu khát [5], [12], [15]. * Kim bất hoán (Củ Bình vôi): Stephania Glabra. Tính vị : đắng, hơi hàn. Tác dụng: trên động vật thực nghiệm có tác dụng trấn tĩnh và gây ngủ giống như diên hồ sách, tác dụng giảm đau rõ rệt [5], [12], [15]. * Thạch quyết minh (Vỏ ốc Cửu khổng): Haliotis Diversicolor Reeve. Tính vị: mặn, hàn. Tác dụng: bình can tiềm dương, thanh can minh mục, trấn tĩnh. ứng dụng: dùng trong can dương thượng cang, đau đầu, chóng mặt [5], [12], [15]. * Cành Câu đằng: Ramulus Pynchophylla. Tính vị: ngọt, hơi hàn. Tác dụng: tức phong chỉ kinh, thanh nhiệt bình can. Chỉ định điều trị trẻ em bị kinh phong gây sốt cao, trị chứng can dương thượng cang gây đau đầu, chóng mặt, buồn nôn [5], [12], [15]. 2.4.2. Công thức và dạng bào chế của “GHA” * Công thức: Vị thuốc Tỷ lệ Thân rễ Đại hoàng Vỏ Nhục quế Vỏ quả Ngũ vị tử Cành Cầu đằng Rễ Bạch thược Rễ Huyền sâm Kim Bất hoán Thạch quyết minh Mẫu lệ Rễ Đan sâm Rễ Hoàng kỳ Rễ Đương quy Rễ Ngưu tất Lá Thạch vĩ Rễ Phòng kỷ Hoa Kim ngân 1 1 1 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 4 4 5 * Dạng bào chế: Cao lỏng 1/1 (1 gam dược liệu khô tương đương với 1ml cao) III. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 3.1. Đối tượng nghiên cứu. Nghiên cứu được tiến hành trên động vật thực nghiệm bao gồm chuột nhắt, thỏ và ếch. * Chuột nhắt trắng: có trọng lượng 22 ± 2 g/con, gồm 60 con không phân biệt giống, chia làm 5 lô, mỗi lô 12 con để nghiên cứu độc tính cấp. * Thỏ trưởng thành: có trọng lượng từ 2,0 ± 0,25 kg/con, số lượng 23 con, chia làm 2 nhóm để nghiên cứu ảnh hưởng của thuốc lên một số chỉ số huyết học, hoá sinh máu, HA và điện tim. Nhóm nghiên cứu cấp diễn: 11 thỏ chia làm 2 lô. - Lô thực nghiệm (uống thuốc): 06 con. - Lô chứng (uống NaCl 0,9%): 05 con. Nhóm nghiên cứu bán cấp diễn: 12 thỏ chia làm 2 lô. - Lô thực nghiệm (uống thuốc): 07 con. - Lô chứng (uống NaCl 0,9%): 05 con. * ếch trưởng thành: có trọng lượng 100-120 g/con, số lượng 15 con để nghiên cứu ảnh hưởng của thuốc lên hệ mạch. * Động vật do Ban Chăn nuôi động vật Học viện Quân y cung cấp, được nuôi trong điều kiện phòng thí nghiệm tại Bộ môn Sinh lý học Học viện Quân y đảm bảo đủ thức ăn, nước uống. 3.2. Chất liệu nghiên cứu và liều dùng. * Chất liệu nghiên cứu: thuốc GHA dạng cao lỏng 1/1 do Bộ môn Dược học quân sự, HVQY cung cấp. * Liều dùng cho nghiên cứu cấp diễn: thỏ uống thuốc một lần với liều 4ml cao lỏng cho 1 kg(tương đương 4 g/kg thể trọng). * Liều dùng cho nghiên cứu bán cấp diễn: thỏ uống thuốc với liều 3ml cao lỏng/kg thể trọng/ngày ´ 21 ngày. * Động vật thuộc lô chứng cho mỗi điều kiện thí nghiệm trên được uống nước muối sinh lý NaCl 0,9% với liều lượng như ở lô uống thuốc. * Dịch truyền tiếp lưu trên ếch và tai thỏ cô lập ở nhóm thực nghiệm là dung dịch thuốc 0,25%, đối chứng là dung dịch Ringer. 3.3. Phương pháp nghiên cứu. 3.3.1. Chỉ tiêu nghiên cứu và cách xác định. 3.3.1.1. Xác định độc tính cấp (LD50): Độc tính cấp (LD50) của thuốc được xác định theo phương pháp của Abraham và Turner R (1965): 60 chuột nhắt được chia làm 5 lô, mỗi lô 12 con, 5 lô chuột được uống thuốc với liều tăng dần từ 15-75 g/kg thể trọng, mức tăng 15 g. Quan sát tình trạng và số chuột thí nghiệm bị chết ở từng lô trong thời gian 72 giờ kể từ thời điểm sau uống thuốc. 3.3.1.2. Xác định độc tính bán cấp. * Độc tính bán cấp của thuốc được đánh giá dựa trên sự thay đổi các chỉ số huyết học, hoá sinh máu. - Máu tĩnh mạch được lấy bằng xi lanh 5 ml đã tráng Heparin (50 UI cho 1 ml máu). - Các chỉ số huyết học: số lượng hồng cầu, hemoglobin, hematocrit, số lượng bạch cầu, số lượng tiểu cầu được xác định bằng máy huyết học tự động K-4500 (Nhật Bản). Các thuốc thử dùng để chuẩn máy do hãng Sysmex (Nhật Bản) cung cấp. - Các chỉ số hoá sinh đánh giá chức năng gan, thận: urê, creatinin, SGOT, SGPT, gGT được đo theo phương pháp động học enzym trên máy xét nghiệm hoá sinh tự động Autohumalyzer 900S Plus của hãng Human (CHLB Đức). - Trọng lượng thỏ được xác định bằng cân đĩa với độ chính xác là 0,05 kg. 3.3.1.3. Xác định các chỉ số hệ tim - mạch. * Đo HA thỏ. + Kỹ thuật đo: HA được đo trực tiếp tại động mạch cảnh gốc theo phương pháp của Ludwig: bộc lộ và thắt động mạch cảnh gốc của thỏ, phía dưới chỗ thắt ta bấm thành động mạch một nhát hình chữ V, luồn vào đó một canuyn thuỷ tinh và cố định lại. Nối canuyn với HA kế Ludwig bằng một ống cao su có chứa dung dịch chống đông Natricitrat 7% và theo dõi HA qua các thời điểm được xác định trong từng loại thí nghiệm. + Trên thí nghiệm cấp diễn: HA thỏ được đo ở các thời điểm: - Ngay sau mổ (xuất phát điểm). - Sau khi uống thuốc 15 phút - 30 phút - 60 phút - 120 phút - 180 phút - 240 phút. + Trên thí nghiệm bán cấp: HA thỏ được đo ở các thời điểm: - Ngay sau mổ (xuất phát điểm). - Sau 15 phút - 30 phút - 45 phút - 60 phút - 90 phút - 120 phút. * Ghi điện tim (ECG) thỏ: Chỉ ghi ECG ở nhóm thỏ nghiên cứu bán cấp diễn. Ghi ECG trước khi uống thuốc và sau 21 ngày uống thuốc bằng máy ghi điện tim một bút Cardiofax của hãng Nihon Kohden (Nhật Bản) với tốc độ giấy chạy 50 mm/s. Ghi ECG ở các đạo trình cơ bản D1, D2, D3. * Tiếp lưu trên tai thỏ cô lập: Tiếp lưu trên tai thỏ cô lập theo phương pháp của Kracop: đặt một ống potylen vào động mạch trung tâm tai thỏ, cô lập tai khỏi cơ thể. Rửa sạch máu trong các mạch máu tai thỏ bằng cách tiếp lưu dung dịch Ringer . Sau đó định chuẩn tốc độ truyền bằng dung dịch Ringer là 14 giọt/phút với độ cao 100 cm và thể tích dịch 500 ml. Sau khi xác định tốc độ dịch Ringer chảy ra từ hệ tĩnh mạch rìa tai thỏ trong 1 phút, ta chuyển sang truyền dung dịch thuốc 0,25%. Theo dõi số giọt dịch chảy ra từ tĩnh mạch trong thời gian 1 phút tại các thời điểm: xuất phát (Truyền dung dịch Ringer) và khi truyền dung dịch thuốc 0,25% tại các thời điểm: sau 1 phút - 5 phút - 10 phút - 15 phút - 30 phút. Và sau khi truyền lại bằng dung d