Đề tài Bước đầu nghiên cứu qui trình tách và nuôi cấy tế bào gốc phôi chuột

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HCM KHOA SINH HỌC *****  ***** BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP CƠ SỞ ĐỀ TÀI : BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH TÁCH VÀ NUÔI CẤY TẾ BÀO GỐC PHÔI CHUỘT MÃ SỐ : CS.2004.23.64 CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: TS. Dương Thị Bạch Tuyết Thành Phố Hồ Chí Minh - 12/2005 ThS.Nguyễn Đăng Quân CN.Phạm Văn Phúc (ĐHKHTN Tp. HCM) CN.Lê Phan Quốc CN.Trương Văn Trí (ĐHSP Tp.HCM) ThS.Phan Kim Ngọc Cộng tác viên: DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT AS Adult stem cell Tế bào mầm trưởng thành D`MEM Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium Môi trường D`MEM dpc day postcoitum Ngày sau giao phối Ebs Embryonic bodys Thể phôi EC Embryonic carcinoma Tế bào khối u EGC Embryonic germ cell Tế bào mầm phôi ES Embryonic stem cell Tế bào gốc phôi FBS Fetal bovine serum Huyết thanh bào thai bò FGF Fibroblast growth factor Nhân tố tăng trưởng nguyên bào sợi GC Germ cell Tế bào mầm ICM Inner mass cell Khối tế bào bên trong LIF Leukimia inhibitory factor Nhân tố ức chế bạch cầu MEF Mouse embryonic fibroblast Tế bào fibroblast phôi chuột MHC Major Histocompatibitity complex Phức hợp tương hợp mô PGC Primordial germ cell Tế bào mầm sinh dục sơ khai LỜI MỞ ĐẦU Thế kỷ 21 - với sự bùng nổ của thành tựu Công Nghệ Sinh học đã đem lại nguồn lợi to lớn cho cuộc sống nhân loại. Con người không ngừng tìm kiếm những hướng nghiên cứu mới trong Sinh học Phân tử và Sinh học tế bào. Đặc biệt là việc nghiên cứu tế bào gốc (Stem cell) nhằm tận dụng nguồn giá trị vô tận của loại tế bào này trong công tác chữa bệnh nhất là bệnh nan y. “Tế bào gốc” đã trở thành một khái niệm không còn xa lạ trong lĩnh vực Y- Sinh học do những đặc tính ưu việt của nó. Tuy nhiên Công nghệ tế bào gốc (Stem cell biotech) cũng đã trở thành nỗi băn khoăn cho nhân loại khi nó được nghiên cứu và thao tác trên chính con người. Nhiều quốc gia trên thế giới đã cho phép tiến hành các thao tác trên tế bào gốc phôi người (Human embryo) và cũng có nhiều nước cấm, trong đó có Việt Nam. Vấn đề này còn đang có nhiều tranh cãi và hiển nhiên sẽ còn bị hạn chế cho đến khi tìm ra các phương pháp kiểm soát chặt chẽ. Trong các đối tượng nghiên cứu phổ biến hiện nay, chuột nhắt trắng có lẽ là khá quen thuộc trong phòng thí nghiệm vì những đặc tính thuận lợi của nó: kích thước nhỏ, vòng đời ngắn, đặc điểm sinh lý gần với người Việc thu nhận tế bào gốc từ phôi chuột đã được thực hiện từ rất lâu trên thế giới và đã đạt được nhiều thành tựu. Tuy nhiên, lĩnh vực nghiên cứu này còn rất hạn chế ở Việt Nam. Để bắt đầu tiếp cận với đối tượng nghiên cứu mới này, chúng tôi bước đầu nghiên cứu qui trình tách và nuôi cấy tế bào gốc phôi chuột. Mặc dù bước đầu đã đạt được một số kết quả nhất định nhưng chắc chắn rằng còn nhiều điều chưa hoàn thiện. Rất mong sự quan tâm và góp ý của những ai quan tâm đến vấn đề này để đề tài được hoàn thiện hơn. Chân thành cảm ơn. TP HCM, tháng 12/2005 Thay mặt nhóm tác giả Dương Thị Bạch Tuyết PHẦN 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. TẾ BÀO GỐC 1.1. Khái niệm Tế bào gốc là một loại tế bào chưa chuyên hoá, có khả năng phân chia vô hạn trong các tổ chức sống, có nguồn gốc từ phôi, bào thai hay mô cơ thể trưởng thành. Dưới điều kiện thích hợp hay có tín hiệu kích thích, tế bào gốc sẽ phát triển thành nhiều loại tế bào chuyên hoá tạo thành các cơ quan hay tổ chức của cơ thể. [1][2] 1.2. Đặc điểm  Có khả năng phân chia vô hạn.  Cấu trúc di truyền (Bộ NST lưỡng bội) trong các tế bào vẫn duy trì và ổn định với mỗi loài.  Có thể biệt hoá thành các loại tế bào chuyên hoá khác nhau thu từ 3 lớp mầm nguyên thủy.  Có khả năng nhân dòng tế bào.[1][2] 1.3. Phân loại Gồm 2 nhóm chính : [7][9]  Tế bào gốc phôi (Embryonic Stem Cell – ES)  Tế bào gốc phôi – ES  Tế bào mầm phôi (Embryonic Germ Cell – EGC)  Tế bào gốc trưởng thành (Adult Stem Cell – AS) 1.4. Sơ lược tình hình nghiên cứu Các tế bào gốc phôi (ES _ Embryo stem cell, ) lần đầu tiên được cô lập vào những năm 1980 bởi nhiều nhóm nghiên cứu làm việc độc lập. Những nhà nghiên cứu này đã nhận ra đặc tính biệt hóa đa hướng của tế bào ES để cho ra các loại tế bào của cả ba lớp mầm sơ khởi. Gossler và cộng sự đã miêu tả khả năng và lợi điểm của việc dùng tế bào ES để tạo ra được các động vật chuyển gene. Thomas và Capechi đã báo cáo về khả năng biến đổi bộ gene của các tế bào ES bằng tái tổ hợp tương đồng. Smithies và các đồng nghiệp sau đó đã chứng minh rằng các tế bào ES được biến đổi gen khi vào Blastocyst, có thể truyền lại những biến đổi di truyền này qua các dòng tế bào . Ngày nay các biến đổi di truyền trên bộ gene chuột bằng kỹ thuật tế bào ES là một cách tiếp cận quan trọng để tìm hiểu chức năng của các tế bào động vật hữu nhũ in vivo. Các nghiên cứu về các tế bào ES của các động vật hữu nhũ: chuột đồng, chuột, chồn, heo và bò đã được công bố; tuy nhiên, chỉ có tế bào ES chuột là thành công trong việc truyền lại các biến đổi di truyền từ tế bào ES thông qua dòng tế bào mầm sinh dục. Gần đây, các quan tâm về các tế bào gốc đã tăng mạnh nhờ những báo cáo về cô lập tế bào ES ở người và linh trưởng. Các công trình tạo phôi lai giữa người và thỏ, biến tế bào gốc thành trứng và tinh trùng, thu tế bào mầm mà không làm chết phôi đã thu được nhiều kết quả khả quan trong hai thập kỷ qua. Đặc biệt, vào tháng 5/2004 A. Melton và cộng sự đã biệt hoá 17 loại tế bào khác nhau từ ES thu nhận từ khối tế bào bên trong của blastocyst ở người. Các nhà khoa học Hàn quốc đã tỏ ra vượt trội và đã có các công trình có tính tiên phong trong lĩnh vực thu nhận tế bào gốc phôi người. Tính đến nay, trên thế giới, ít nhất đã có 4 ngân hàng tế bào gốc ra đời và đi vào hoạt động (Hàn quốc, Anh, Mỹ, Trung quốc). Hình 1.1 : a) Blastocyst b) phôi người giai đoạn 8 tế bào Riêng ở Việt Nam, việc nghiên cứu tế bào gốc chỉ mới đang trong giai đoạn khởi đầu và được tập trung chủ yếu tại hai trung tâm lớn (Đại học Khoa học Tự nhiên Hà nội và Đại học Khoa học Tự nhiên TP HCM). Mặc dầu vậy, các phòng Thí nghiệm công nghệ cao của hai Trường nói trên cũng đã đạt được một số thành tựu làm tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn về tế bào gốc. Chẳng hạn như xây dựng các quy trình thu nhận nguồn phôi in vitro, in vivo từ động vật làm nguyên liệu cho khai thác tế bào gốc, cấy ghép da thu được từ nuôi cấy tế bào để điều trị các ca bỏng, ghép tế bào gốc CD34+ máu ngoại vi để để điều trị bệnh lý ác tính, thu tế bào gốc sinh máu từ tuỷ xương, cuống rốn [7][9] 2. TẾ BÀO GỐC PHÔI 2.1. Khái niệm và đặc điểm Tế bào gốc phôi được định nghĩa bởi nguồn gốc của nó, chúng có nguồn gốc từ dạng blastocyst của phôi. Blastocyst là một dạng phát triển tất yếu của phôi trước khi bám vào thành tử cung. Ở giai đoạn này, phôi chuột gồm lớp tế bào ngoài (ngoại phôi bì), khoang phôi và khối tế bào bên trong. Tế bào gốc tăng nhanh về số lượng và biệt hóa chức năng thành các cơ quan trưởng thành. Nếu tách tế bào gốc ra khỏi phôi và chuyển chúng vào một cơ quan khác hay cơ thể trưởng thành, chúng có thể hòa nhập, tiếp tục phân chia và thể hiện khả năng chuyên biệt theo cơ quan đó. Tương tự, nếu các tế bào này được cô lập invitro, tạo dòng (colony) và tác động biệt hóa, chúng sẽ có khả năng biến đổi hình thái và đặc điểm sinh lý để cho các dạng tế bào khác trong phòng thí nghiệm.[1][2] Hầu hết những tế bào trong cơ thể đều có nguồn gốc từ sự tự sao chép tế bào gốc. Do đó, các nhà khoa học nhận thấy cần phải phát triển đặc điểm đặc biệt này để giúp tế bào gốc biệt hóa tốt hơn. Austin Smith đã xác định các đặc điểm cụ thể của tế bào gốc phôi như sau:  Chuyển hóa từ lớp tế bào bên trong hay nội phôi bì của blastocyst.  Tồn tại và duy trì ổn định bộ nhiễm sắc thể ở dạng lưỡng bội.  Có thể phát triển thành các loại tế bào khác nhau và xuất phát từ 3 lớp mầm riêng biệt của phôi (nội bì, trung bì và ngoại bì).  Có khả năng hợp thành một thể thống nhất trong tất cả các mô thai trong suốt thời kỳ phát triển.  Có khả năng nhân dòng tế bào và phát triển thành tế bào trứng và tinh trùng.  Biểu hiện nhân tố sao chép Octo-4, làm hoạt hóa hay kìm hãm một gene đích và duy trì sự phát triển nhanh của tế bào gốc phôi không biệt hóa.  Có thể tiếp tục phát triển và tự đổi mới chính nó.  Dòng các tế bào gốc phôi đơn bào có thể phát triển thành dòng tế bào thuần hay dòng tế bào có nguồn gốc như nhau.  Trong tổng hợp DNA, khác với tế bào sinh dưỡng, tế bào gốc phôi không đòi hỏi các tác nhân kích thích bên ngoài khi bắt đầu sao chép DNA.  Ở mỗi tế bào sinh dưỡng của động vật hữu nhũ cái, một trong hai nhiễm xắc thể X trở nên bất hoạt hoàn toàn , nhưng sự bất hoạt của nhiễm sắc thể X không xuất hiện ở tế bào ES.[1][2][7][9] Hình 1.2: Sơ đồ biệt hóa các tế bào từ túi phôi ở người 2.2. Nguồn gốc của tế bào gốc phôi Phôi động vật có vú khi phát triển thì từng đám tế bào trong đám đại phôi bào chìm xuống, trước khi phôi bám vào thành tử cung. Đây là các tế bào đa năng, có nghĩa là chúng có khả năng phát triển thành các tế bào của 3 lớp mầm sơ cấp. Các tế bào đa năng này được hình thành từ khối tế bào bên trong của phôi ở giai đọan túi phôi, sau đó một số trong chúng di chuyển ra phía ngoài để tạo ngoại phôi bì. Mặt khác các tế bào đa năng này cũng có khả năng kéo dài sự tự đổi mới tức là chúng có thể không biệt hóa theo sơ đồ định sẵn. Các tế bào ở vùng nằm sát giữa ngoại phôi bì và khối tế bào bên trong sẽ tạo ra tế bào gốc phôi tốt nhất.[9][10] 3. TẾ BÀO MẦM SINH DỤC 3.1. Khái niệm Tế bào mầm sinh dục (gọi tắt tế bào mầm – Germ Cell ) là những tế bào gốc đa năng có thể phân chia liên tục vừa tự làm mới vừa biệt hóa tạo thành các giao tử (tinh trùng, trứng) từ đó tạo ra cơ thể mới.[5] 3.2. Sự hình thành và tồn tại của các tế bào mầm Trong quá trình phát triển của phôi, hợp tử sau khi được tạo thành, qua những lần phân chia đầu tiên các tế bào con được sinh ra. Những tế bào này sẽ phát triển theo các hướng khác nhau với cấu trúc và chức năng riêng biệt. Một trong những hướng biệt hóa là hướng hình thành nên các tế bào mầm sơ khai (tế bào mầm sinh dục sơ khai – Primordial Germ Cell – PGC ). Nguyên nhân tạo ra hướng biệt hóa là vì trong tế bào chất của hợp tử chứa nhiều nhân tố ‘‘quyết định’’ (determint factor), các nhân tố này lại phân bố không đồng đều. Do đó, khi hợp tử phân cắt thì mỗi tế bào con sẽ nhận được một phần tế bào chất có chứa các nhân tố ‘‘quyết định’’ có thành phần và hàm lượng không giống nhau. Những tế bào con nào nhận được nhân tố này sẽ biệt hóa theo hướng mà nhân tố quyết định quy định.[4][5] Các tế bào mầm sinh dục xuất hiện từ giai đoạn khá sớm trong sự phát triển của phôi, đó là giai đoạn phôi vị hóa (phôi ba lá). Các tế bào ở rãnh sinh dục (PGC) là nền tảng cho dòng tế bào mầm sinh dục. Thế hệ con cháu của chúng sẽ hình thành nên các giao tử ở động vật trưởng thành. Các tế bào PGC giữ vai trò quan trọng trong sự sống sót của một loài. Ở động vật hữu nhũ nói chung và chuột nói riêng, PGC là một quần thể các tế bào di động. Chúng được hình thành trong quá trình phát triển của phôi, sau đó di chuyển, khếch đại và định cư ở bộ phận sinh dục. Các tế bào mầm lần đầu tiên được xác định khi có một dấu hiệu yếu của những tế bào dương tính với phản ứng alkaline phosphatase tại rãnh sinh dục nguyên thủy vào ngày 7 dpc (day postcoitum). Số lượng tế bào mầm sinh dục nguyên thủy chừng 50 – 80 tế bào vào cuối giai đoạn phôi vị hóa (giai đoạn ba lá phôi). Vào giai đoạn 8 – 8,5 dpc thì số lượng tế bào của chúng chừng 100 tế bào, định vị tại lớp trong ruột sau và di chuyển lên lớp biểu mô ruột sau vào ngày 9 – 9,5 dpc, tại đây số lượng của chúng tăng lên chừng 350 tế bào. Từ đây, chúng di chuyển theo hướng lưng dọc theo các niêm mạc ruột sau về phía cầu sinh dục phát triển (genital ridge) và định cư ở đây vào ngày 10,5 dpc, khi đó số lượng của chúng khoảng 1000. Bên trong bộ phận sinh dục, các tế bào mầm sinh dục tiếp tục phân chia và quần thể tế bào đạt chừng 25000 tế bào vào ngày 13,5 dpc. [5] Cầu sinh dục (genital ridge) là tiền thân của cơ quan sinh dục sau này. Các tế bào mầm tồn tại trong cầu sinh dục sẽ di chuyển về cơ quan sinh dục đang hình thành trong các giai đoạn phát triển của phôi. Ở giai đoạn 12.5 dpc, cầu sinh dục bám vào trung thận (mesonephros) hay còn gọi là thận thai (fetus kidney). Sau khi bỏ hết phần nội quan, cầu sinh dục và trung thận nằm gần sát vào lưng. Có thể quan sát bằng mắt thường hay qua kính lúp hoặc kính hiển vi soi nổi để thấy hai bộ phận này. Kích thước của cầu sinh dục và trung thận chừng 1 – 2 mm tuỳ thuộc trọng lượng, kích thước phôi. Khi chưa tách rời, cầu sinh dục và trung thận tạo thành hình lưỡi liềm. Dưới kính hiển vi, lưỡi liềm có hai lớp: một lớp bên phía chiều cong bên trong có màu sáng hơn là cầu sinh dục, một lớp có màu sẫm hơn là trung thận. Hình 1.3: Sự định vị và tồn tại của tế bào mầm ở các giai đoạn phát triển của phôi (Phần màu đỏ là các tế bào mầm sinh dục). Để nghiên cứu GC in vitro, người ta dựa vào sự định vị của chúng trong phôi theo tuổi mà thu nhận và nuôi cấy. Sau 12,5 dpc, các tế bào mầm sinh dục tập trung vào các cơ quan sinh dục. Buồng trứng nằm cạnh thận trong khi đó tinh hoàn thì nằm ở vị trí gần bóng đái. Biểu đồ 1.1: Mối quan hệ giữa tuổi (dpc) và số lượng tế bào mầm sinh dục ở phôi chuột Mus musculus var.Albino. Theo Tam và Snow (1981). [ 5] 3.3. Xác định tế bào mầm Hiện tại có ba phương pháp xác định tế bào mầm sinh dục dựa vào: (1) Đặc điểm hình dạng, (2) Kháng thể nhận diện kháng nguyên đặc trưng cho tế bào GC (3) Sự biểu hiện của enzym Alkaline phosphatase. 3.3.1. Đặc điểm hình dạng tế bào mầm Các tế bào GC sau khi được rời ra từ các mảnh mô có thể phân biệt được chúng với các tế bào sinh dưỡng khác khi xem dưới kính hiển vi soi nổi hay cắt lớp. Tế bào mầm sinh dục vừa mới thu nhận thì sẽ có hình tròn, bề mặt láng và phản chiếu ánh sáng. Chúng có đường kính từ 18 - 20 μm nên lớn hơn hầu hết các tế bào sinh dưỡng. Chúng lăn tròn đều trên mặt đáy của giếng nuôi. Sau một thời gian nuôi cấy ngắn, các tế bào sinh dưỡng bám vào đáy bình trong khi đó các tế bào mầm sinh dục vẫn không bám vào đáy bình. Tế bào GC hầu như không có màu do vậy có thể phân biệt với những tế bào hồng cầu không nhân, không bám và có cùng kích thước với tế bào GC bởi các tế bào hồng cầu có màu đỏ hồng nhạt. Sau một vài giờ nuôi cấy trên lớp tế bào đơn (lớp feeder, thường là fibroblast), chúng sẽ dính vào lớp tế bào bên dưới và thay đổi hình dạng – hình dạng của chúng có vẻ như hình của fibroblast. Khi đó, chúng ta không thể nào xác định được chúng qua hình dạng mà để xác định chúng phải thông qua kháng thể hay alkaline phosphatase. 3.3.2. Xác định dựa vào kháng thể Các tế bào mầm sinh dục thể hiện một số kháng nguyên bề mặt chuyên biệt (Donovan và cộng sự, 1986). Các kháng nguyên này sẽ kết hợp được với kháng thể TG-1 và SSEA-1. Sự hiện diện của các kháng nguyên này là một phương tiện đáng tin cậy cho việc xác định tế bào GC sống trong nuôi cấy. Tuy nhiên, thật cẩn thận rằng các phản ứng kháng thể không hoàn toàn đặc hiệu cho tế bào GC. Một số kháng thể đa dòng được biết phản ứng chuyên biệt với tế bào GC nhưng cũng đồng thời phản ứng với các kiểu tế bào khác. [5] 3.3.3. Xác định dựa vào Alkaline phosphatase Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng các tế bào GC thể hiện sự hoạt động mạnh của Alkaline phosphatase. Hoạt tính của Alkaline phosphatase đầu tiên được xác định vào ngày thứ 7 dpc và tiếp tục biểu hiện cho đến cuối đời sống của phôi.[5] Mặc dù trong phôi cũng có những tế bào khác cũng dương tính với alkaline phosphatase nhưng sự hiện diện của tế bào dương tính với alkaline phosphatase thu nhận từ mẫu mô sinh dục (như cầu sinh dục) là không thể nhầm lẫn được bởi vì không có kiểu tế bào nào biểu hiện đặc tính này. Tế bào mầm thu nhận từ cầu sinh dục được xác định bằng phương nhuộm Alkaline phosphatase. Trạng thái chưa biệt hoá của tế bào mầm có thể được nhận biết nhờ mức độ biểu hiện cao của enzym Alkaline Phosphatase. Enzym này hoạt động tối ưu trong môi trường pH kiềm, do vậy gọi là Alkaline phosphatase (Alkaline nghĩa là kiềm). Trong tế bào, Alkaline phosphatase giữ vai trò rất quan trọng trong việc phân giải các nhóm phosphate của các phân tử nucleotide, protein và akaloide. Ở tế bào gốc và tế bào mầm trong một khoảng thời gian nhất định trong thời gian phát triển của phôi thì enzym này hoạt động mạnh. Sự biểu hiện mạnh của enzym này hầu như ít xảy ra ở các tế bào đã biệt hoá. Do vậy, sự biểu hiện mạnh của enzym này là một dấu hiệu để xác định tế bào gốc và tế bào mầm.[5][9] Cơ chế phản ứng Đầu tiên, Naphthol AS-BI phosphaste sẽ bị cắt đi gốc Phosphate thành Naphthol AS-BI. Sau đó, Naphthol AS-BI sẽ phản ứng trở lại với Fast Blue BB Salt và tạo ra sản phẩm có màu xanh bám trên bề mặt tế bào. Màu xanh này có thể quan sát dưới kính hiển vi. Naphthol AS-BI phosphaste Naphthol AS-BI APase Naphthol AS-BI + Fast Blue BB Salt Blue Pigment (Sắc tố màu xanh). 4. NGUỒN GỐC THU NHẬN VÀ PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN TẾ BÀO GỐC