Đề tài Các kỹ thuật sắc ký

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LỚP: DH06SH Yo0oZ Bài tiểu luận môn Chẩn đoán bệnh gia súc, gia cầm bằng sinh học phân tử Đề tài: CÁC KỸ THUẬT SẮC KÝ GVHD: PGS.TS NGUYỄN NGỌC HẢI Sinh viên thực hiện: ĐINH CÁT ĐIỀM MSSV: 06126027 Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 10/2009 2 I) ĐẶT VẤN ĐỀ Các tế bào sống chứa hàng trăm loại hợp chất hóa học khác nhau. Các hợp chất này bao gồm những đại phân tử như protein, acid nucleic, lipid,… cũng như các hợp chất có trọng lượng phân tử nhỏ. Những hợp chất trên có thể hiện diện ở số lượng nhỏ, dưới dạng vết (enzyme) hay ở số lượng nhiều (các protein cấu tạo). Người ta muốn biết các thành phần hóa học của tế bào, nhằm hiểu rõ các quy trình biến đổi căn bản của nó, qua đó giúp cuộc sống ngày càng thêm tốt đẹp. Muốn vậy, người ta phải tìm cách tách các tách riêng chúng để xác định cấu trúc hóa học. Từ đó, kỹ thuật tách riêng các hợp chất ra đời với tên gọi sắc ký (chromatography). Ngày nay, sắc ký đã được sử dụng để tách tất cả các hợp chất dù có màu hay không, dù trọng lượng phân tử nhỏ hay lớn. Nhưng vì các phân tử sinh học rất thiên hình vạn trạng với trọng lượng phân tử lớn nhỏ khác nhau, tính phân cực nhiều hay ít khác nhau nên không thể nào có một kỹ thuật sắc ký chung cho các loại hợp chất khác nhau. Vì lý do đó, tôi thực hiện đề tài: “Các kỹ thuật sắc ký” với sự hướng dẫn của thầy Nguyễn Ngọc Hải. II) TỔNG QUAN II.1) Lịch sử sắc ký ¾ Năm 1903, nhà bác học Nga Michael Tswett đã cho dung dịch các sắc tố thực vật trong ete dầu hoả lên cột nhồi bột mịn canxi cacbonat, ông thấy các sắc tố bị hấp phụ lên trên đầu cột. Khi cho ete dầu hoả lên cột, các sắc tố di chuyển trong cột từ trên xuống dưới, mỗi sắc tố có một tốc độ riêng, tách thành những vùng hay vòng màu xếp chồng lên nhau, hình thành một hệ mà Tvest gọi đó là sắc đồ. Ông đặt tên cho phương pháp tách này là sắc ký (Chromatography). Trong tiếng Hy Lạp,“chroma” có nghĩa là chất màu, graphein có nghĩa là viết. Tên gọi này ngày nay vẫn được sử dụng mặc dù phương pháp này còn được dùng tách các chất không màu. ¾ Đến thập kỷ 1930-1940, phương pháp này được phát triển nhanh chóng với nhiều kỹ thuật khác nhau như sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng, sắc ký trao đổi ion, sắc ký ái lực,.. ¾ Năm 1954, Mould D.L phát triển sắc ký gel để tách các hợp chất mang điện tích theo trọng lượng phân tử của chúng. Đến năm 1964, Moor gọi là “gel permeation chromatography” hay gọi là sắc ký lọc gel. ¾ Năm 1906, sắc ký khí được biết đến nhưng đến 1952, kỹ thuật này mới phát triển mạnh mẽ, nhất là trong thập niên 1960. ¾ Năm 1967, Horvath C. là tác giả tạo máy sắc ký lỏng cao áp. II.2) Định nghĩa sắc ký Sắc ký là một nhóm các phương pháp hoá lý dừng để tách các thành phần của một hỗn hợp. Sự tách sắc ký được dựa trên sự phân chia khác nhau của các chất khác nhau vào hai pha luôn tiếp xúc và không hoà lẫn vào nhau: một pha tĩnh và một pha động (Trong thí nghiệm của Tvest: pha tĩnh là canxi cacbonat, pha động là ete dầu hoả). Pha tĩnh trì hoãn sự di chuyển của các thành phần trong mẫu. Khi các thành phần này di chuyển qua hệ thống sắc ký với tốc độ khác nhau, chúng sẽ được tách khỏi nhau theo thời gian. Mỗi một thành phần đi qua hệ thống trong một khoảng thời gian riêng biệt, gọi là thời gian lưu. Trong kỹ thuật sắc ký, hỗn hợp được chuyên chở trong chất lỏng hoặc khí và các thành phần của nó được tách ra do sự phân bố khác 3 nhau của các chất hòa tan khi chúng chảy qua pha tĩnh rắn hoặc lỏng. Nhiều kỹ thuật khác nhau đã được dùng để phân tích hợp chất phức tạp dựa trên ái tính khác nhau của các chất trong môi trường động khí hoặc lỏng và đối với môi trường hấp phụ tĩnh mà chúng di chuyển qua như giấy, gelatin hay gel magnesium silicate,... Sắc ký là phương pháp để phân tách và tinh sạch các phân tử sinh học. Sắc ký là phương pháp nhanh, dễ dàng và không ảnh hưởng đến protein, đây là phương pháp được đề nghị trong nghiên cứu định lượng protein hay các phân tử. II.3) Các giai đoạn của quá trình sắc ký: Quá trình sắc ký gồm 3 giai đoạn chính: a) Đưa hỗn hợp lên pha tĩnh (ví dụ: đưa dung dịch các sắc tố lên đầu cột canxi cacbonat). Các chất được giữ trên pha tĩnh. b) Cho pha động chạy qua pha tĩnh (dung môi để dầu hoả qua cột), pha động sẽ kéo theo các chất di chuyển trên pha tĩnh với tốc độ khác nhau, tách khỏi nhau và có vị trí khác nhau trên pha tĩnh tạo thành sắc ký đồ (chromatogram). Giai đoạn này gọi là khai triển sắc ký. 9 Nếu tiếp tục cho pha động chạy qua thì các chất có thể lần lượt bị kéo ra ngoài pha tĩnh (ví dụ: ra khỏi cột). Đó là quá trình rửa giải và dung môi dùng được và dung môi rửa giải (eluent), dịch hứng được ờ cuối cột gọi là dịch rửa giải (eluate). 9 Nếu các chất được tách trên pha tĩnh (sắc ký khai thêm ta có thể lấy từng phần pha tĩnh có mang chất (phân đoạn bột trên cột) đem chiết lấy chất. 9 Nếu các chất được tách ra ngoài pha tĩnh (sắc ký rửa giải) ta có thể hứng thu lấy các phân đoạn dịch rửa giải có các chất cần phân tích. c) Phát hiện các chất: Các chất màu có thể phát hiện dễ dàng, các chất không màu có thể phát hiện bằng đèn tử ngoại hay bằng các thuốc thử. Trong sắc ký rửa giải có thể phát hiện các chất khi chúng đi ra khỏi cột bằng cách cho dung dịch rửa giải đi qua một bộ phận phát hiện gọi là detector đặt sau cột. II.4) Phân loại các phương pháp sắc ký II.4.1) Theo bản chất vật lý các pha 9 Pha động có thể là một chất lỏng hay chất khí 9 Pha tĩnh có thể là một chất rắn (hạt xốp hay bột mắn) hay một chất lỏng (được giữ trên một chất mang rắn). Ö Do đó, dựa vào bản chất các pha ta phân biệt các phương pháp (trong tên của phương pháp, pha động được nêu trước pha tĩnh): 1. Sắc ký lỏng - lỏng (liquid - liquid chromatography LLC) 2. Sắc ký lỏng - rắn (liquid - song chromatography LSC) 3. Sắc ký khí - lỏng (gas - liquid chromatography GLC) 4. Sắc ký khí - rắn (gas - solid chromatography GSC) 9 Hai phương pháp đầu gọi chung là sắc ký lỏng (LC). 4 9 Hai phương pháp cuối gọi chung là sắc ký khí (GC). II.4.2) Theo hiện tượng sắc ký 1. Sắc ký hấp phụ (absorption chromatography): pha tĩnh là một chất rắn có khả năng hấp phụ, đó là các phương pháp sắc ký lỏng - rắn và khí - rắn. 2. Sắc ký phân bố (partition chromatography): pha tĩnh là chất lỏng không hoà lẫn được với pha động, chất lỏng này được bao trên bề mặt của một chất rắn gọi là giá hay chất mang và phải là chất trơ, không tham gia vào sắc ký. Sắc ký phân bố bao gồm sắc ký lỏng - lỏng và sắc ký khí - lỏng. 3. Sắc ký trao đổi ion (ion - exchange chromatography): pha tĩnh là chất nhựa trao đổi ion chớp chất cao phân tử có mang những ion có khả năng trao đổi với các ion cùng dấu của dung dịch hỗn hợp sắc ký). 4. Sắc ký theo loại cỡ (size - exclusion chromatography): còn gọi là sắc ký trên gel. Các phân tử cỡ lớn sẽ được loạt các phân tử nhỏ hơn sẽ được tách theo kích thước do các phân tử nhỏ di chuyển chậm hơn. II.4.3) Theo kỹ thuật và phương tiện sắc ký II.4.3.1) Theo phương pháp giữ pha tĩnh: 1. Sắc ký trên cột (column chromatography: CC) pha tĩnh được chứa trong một cột bằng kim loại hay thuỷ tinh. 2. Sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography: TLC): pha tĩnh được tráng đều và giữ trên mặt phẳng của bản thuỷ tinh, nhựa hay nhôm. Lớp mỏng pha tĩnh thường là: silicagel, nhôm oxit, xenlulozơ, chất nhựa trao đổi lớn và có chiều dày khoảng 0,25 - 0,5mm. 3. Sắc ký giấy (paper chromatography - PC) pha tĩnh (lỏng) được thấm trên một loại giấy lọc đặc biệt gọi là giấy sắc ký II.4.3.2) Theo cách cho pha động chạy ta có: 1. Sắc ký khai triển (development chromatography) cho pha động kép các chất chạy và tách trên pha tĩnh (Sắc đồ nằm trên pha tĩnh). 2. Sắc ký rửa giải (elution chromatoglaphy) cho pha động chạy và kép các chất lần lượt ra ngoài pha tính (ra khỏi cột, ra khỏi giấy). II.5) Tốc độ di chuyển của một chất, peak và hình dáng peak II.5.1) Tốc độ di chuyển của một chất Tốc độ di chuyên của một chất có thể được đặc trưng bởi hệ số phân bố của nó giữa hai pha hoặc bởi các đại lượng về sự lưu giữ của chất đó trên pha tĩnh (thời gian lưu, thể tích lưu) a. Thời gian lưu và thể tích lưu Thời gian lưu là thời gian cần để một chất di chuyển qua cột sắc ký, khi ra khỏi cột nhờ thiết bị detector ghi nhận tín hiệu và xuất hiện rực trên sắc đồ (tính từ lúc bơm mẫu đến khi xuất hiện peak). 5 Tm là thời gian lưu của một chất không bị lưu giữ, nghĩa là tốc độ di chuyển của nó bằng tốc độ di chuyển trung bình của dung môi, thời gian này được gọi là thời gian chết. tR càng lớn, chất càng bị lưu giữ mạnh và tốc độ di chuyển của nó càng nhỏ. Hình: Sắc ký đồ của một chất Thời gian lưu hiệu chỉnh tR được tính theo công thức: Nếu trên trục hoành của sắc đồ, dùng đơn vị đo là thể tích dung môi thì ta có các đại lượng tương tự: thể tích lưu VR và thể tích lưu hiệu chỉnh VR' thể tích VM được gọi là thể tích chết của cột hay còn gọi là thể tích rỗng Vo. b. Hệ số phân bố Trong đó: Cs và Cm là nồng độ chất tan trong pha tĩnh và pha động khi cân bằng được thiết lập. Khi nồng độ nhỏ K phụ thuộc vào bản chất các pha, chất tan và nhiệt độ K càng lớn thì chất đó phân bố càng nhiều trong pha tĩnh và di chuyển càng chậm. c. Hệ số dung lượng K' (hệ số phân bố khối lượng) Trong đó: Qs và QM là lượng chất tan phân bố trong pha anh và pha động, K' phụ thuộc vào bản chất các pha, bản chất chất tan, nhiệt độ và đặc điểm của cột. Để tách một hỗn hợp chất, người ta thường chọn cột, pha động và các điều kiện phân tích khác sao cho K' nằm trong khoảng từ 1 đến 8. II.5.2) Peak và hình dáng peak a. Hình dáng peak: Hình dáng lý tưởng của tức là lực đối xứng, nhưng thực tế lúc sắc ký chỉ gần đối xứng. Chiều rộng của tục được đo ở 1/10 chiều cao của peak. b. Sự kéo dài peak: là kết quả của sự di chuyển nhanh chậm khác nhau của các phân tử của cùng một chất khi đi qua cột sắc khí. Các lực ra chậm bao giờ cũng tù hơn. c. Hiệu lực của cột: Hiệu lực của cột thường được đo bằng hai thông số: số đĩa lý thuyết N và chiều cao đĩa lý thuyết H. Ta có thể coi như cột sắc khí được chia thành N lớp hay N tầng mỏng, ở mỗi một lớp sự phân bố chất tan vào hai pha đạt trạng thái cân bằng. Những tầng mỏng giả định này được gọi là địa lý thuyết. Nếu cột sắc khí có chiều dài là L thì: H = N/L. Cột có N lớn là cột có hiệu lực cao. 6 d. Độ phân giải: Độ phân giải Rs là tỉ số khoảng cách giữa hai peak và độ rộng trung bình của peak. 9 Rs = 0,75 hai pic tách không tốt, còn xen phủ nhau nhiều; 9 Rs = 1,0 hai pic tách khá tốt, còn xen phủ nhau 4%; 9 Rs = l,5 hai pic tách hoàn toàn (chi xen phủ 0,3%). 9 II.6) Các kỹ thuật sắc ký II.6.1) Sắc ký giấy Sắc ký giấy là một phương pháp phân tách dễ dàng các thành phần của một hỗn hợp (acid amin). Trong sắc ký giấy, pha tĩnh là một tờ giấy bằng cellulose ( thí dụ như tờ giấy thấm, giấy lọc trong phòng thí nghiệm). Các lọai giấy này có tính ái nước nên trên thực tế, pha tĩnh là một lớp nước (H2O) thật mỏng đã được che phủ lên trên bề mặt của tờ giấy, chính vì thế sắc ký giấy là lọai sắc ký phân chia. Pha động là chất lỏng( có thể là chất lỏng hay một hỗn hợp dung môi). Phương pháp này thường được sử dụng để tách các chất ưa nước như amino acid, đường,.. Trong giấy, cellulose có dạng sợi, các sợi này khi nằm cạnh nhau sẽ tạo thành mạng lưới với các lỗ rỗng to. Khi ly giải, dung môi di chuyển dọc theo bề mặt sợi và các lỗ rỗng sẽ được phủ đầy dung môi. Như thế, các chất tan bị phân tán nhiều trong lỗ rỗng khiến các vết sắc ký to hơn. Bột giấy hấp thu nước, nước bị giữ lại trong cấu trúc glucopyranose bằng cầu nối hydrogen, vì thế quá trình sắc ký xảy ra theo cơ chế phân chia. Hình: Sắc ký giấy, các chất màu di chuyển theo dung môi lên giấy với các điểm khác nhau. (a) Một giọt hỗn hợp (drop of mixture) đặt ở một góc mảnh giấy lọc, một cạnh giấy nằm trong dung môi. (b) Dung môi di chuyển lên tấm giấy bằng lực hút mao mạch, các chất sẽ phân bố theo các tỷ lệ khác nhau Mỗi hợp chất di chuyển với tốc độ phản ánh kích thước của phân tử của nó và hòa tan của nó trong dung môi. (c) Những chất khác nhau sẽ được trải ra ở những điểm khác biệt trên bảng , tạo thành một sắc ký đồ. 7 Ö Hiện nay, sắc ký giấy đang dần được thay thế bằng sắc ký lớp mỏng. Do phần lớn các chất hữu cơ không có màu, nên sắc ký giấy sẽ không cho thấy được vị trí của mẫu chất trong quá trình dung môi di chuyển đi lên giấy. Nhược điểm sắc ký giấy: Trong giấy, cellulose ở dạng những sợi dài nằm song song kề nhau một cách tự nhiên, và một hệ thống mạng như thế chắc chắn có các lỗ hỗng. Khi dung môi giải ly di chuyển (mang theo các chất tan, solute) dọc theo bề mặt của sợi, các lỗ rỗng này sẽ được dịp phủ đầy dung môi, và các chất tan có dịp khuếch tán vào các lỗ rỗng này, khiến các chất tan càng lúc càng to dần so với vết chấm tạo mức xuất phát ban đầu. Còn nếu sợi cellulose được nén chặt quá dòng chảy sẽ rất khó di chuyển. II.6.2) Sắc ký lớp mỏng Sắc ký lớp mỏng là hay còn gọi là sắc ký phẳng (planar chromatography), dựa chủ yếu vào hiện tượng hấp thu trong đó pha động là dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi, di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một chất trơ (thí dụ như: silicagel hay oxid alumin). Pha tĩnh được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên nền phẳng như tấm kiếng, tấm nhôm hay tấm plastic. Do chất hấp thu được tráng thành một lớp mỏng nên phương pháp này được gọi là sắc ký lớp mỏng. ¾ Bình sắc ký: Một chậu, hũ, lọ bằng thủy tinh, hình dạng đa dạng, có nắp đậy. ¾ Pha tĩnh: Một lớp mỏng khoảng 0,25 nm của một loại hợp chất hấp thu (silicagel, alumin,..) được tráng thành lớp mỏng, đều, phủ lên tấm kiếng, tấm nhôm, hay tấm plastic. Chất hấp thu trên nhờ giá đỡ sulphat canxi khan, tinh bột hay một lọai polymer hữu cơ. ¾ Mẫu cần phân tích: thường là hỗn hợp gồm nhiều chất với độ phân cực khác nhau. Sử dụng khoảng 1ul dung dịch mẫu với nồng độ pha lõang 2-5%, nhờ một vi quản để chấm thành một điểm gọn trên pha tĩnh, ở vị trí phái trên cao hơn một chút so với mặ thoáng của chất lỏng chứa trong bình. Hình: Bình sắc ký lớp mỏng ¾ Pha động: dung môi hay hỗn hợp 2 dung môi, di chuyển chầm chậm dọc theo tấm lớp mỏng, và lôi kéo mẫu chất đi theo nó. Dung môi di chuyển càng cao nhờ tính mao quản. Mỗi thành phần chất sẽ di chuyển với vận tốc khác nhau, đi phía sau mực của dung môi. Vận tốc di chuyển này phụ thuộc vào các lực tương tác tĩnh điện mà pha tĩnh muốn níu giữ các mẫu chất ở lại pha tĩnh và tùy thuộc vào độ hòa tan của mẫu chất trong dung môi. ¾ Ưu điểm: -Chỉ cần một lượng rất ít mẫu để phân tích -Có thể phân tích đồng thời mẫu và chất chuẩn đối chứng trong cùng điều kiện phân tích. -Tất cả các hợp chất trong mẫu phân tích có thể được định vị trên tấm sắc ký lớp mỏng. ¾ Các bước thực hiện sắc ký lớp mỏng: -Chuẩn bị ống vi quản: ống thủy tinh có đường kính trong ống nhỏ, khỏang 1-2mm, một đầu được vót nhọn, dài 10-20cm. Sử dụng ống vi quản để chấm nhiều lọai mẫu dung dịch khác nhau, chỉ cần sau mỗi lần sử dụng, rửa sạch vi quản bằng dung môi hữu cơ như aceton. 8 -Chuẩn bị tấm bản mỏng: tấm bản mỏng thương mại 20x20cm, dùng kéo cắt bản với kiách thước cần thiết, tấm bản phải vừa bình giải ly. Dùng bút chì vạch nhẹ nét xuất phát và mức tiền tuyến dung môi. -Chuẩn bị dung dịch mẫu: Mẫu là chất lỏng, có thể chấm trực tiếp mẫu lên bản mỏng, còn mẫu là dung dịch quá sễt, có thể pha loãng mẫu. Với mẫu là chất rắn phải hòa tan trong dung môi hữu cơ phù hợp, nồng độ 2-5%. Nhờ một vi quản để dung dịch mẫu lên bề mặt tấm sắc ký lớp mỏng một cách thận trọng, tránh không cho làm lũng bề mặt của lớp mỏng. Mỗi vết chấm trên bản không chứa nhiều hơn 12ug (10ug là tối ưu) mẫu chất. -Sấy nhẹ để dung môi bay đi khỏi vết chấm, rồi nhúng bản vào dung dịch giải ly -Giải ly để dung môi giải ly di chuyển lên: Sau khi bình đã bão hòa dung môi, người ta đặt tấm mỏng vào bình khai triển để cho các vết chấm mẫu ở bờ cạnh phía dưới đáy bình. Cạnh đáy của tấm lớp mỏng nậgp trong dung môi giải ly khỏang 0.5-1cm. Các vết mẫu không được ngập trong dung môi giải ly, vì như thế dung môi sẽ khuếch tán vào trong dung môi. -Hiện hình các vết sau khi giải ly: Các hợp chất có màu sẽ được nhìn thấy bằng mắt thường, nhưng phần lớn các hợp chất hữu cơ không có màu, nên nếu muốn nhìn thấy các vết, cần sử dụng phuơng pháp vật lý (Phát hiện bằng tia tử ngoại UV: đèn chiếu tia UV 254nm ánh sáng này nhận ra các hợp chất có thể hấp thu tia UV, các hợp chất có màu tối sẫm trên nền sáng; đèn chiếu tia UV 366nm ánh sàng này phát hiện nhữgn hợp chất có phát hùynh quang, các vết sẫm của chất mẫu có màu sáng trên nền bản mỏng sẫm màu) hay dùng phương pháp hóa học (Bằng cách dung thuốc thử hiện hình như hơi iod, 2,7-fluorescein phát hiện đa số hợp chất hữu cơ, ninhydrin phát hiện aminoacid hay amin, 2,4-dinitrophenylhydrazin phát hiện aldehyde hay caton, clorur antimony phát hiện steroid hay vitamin hay carotenoid,…) - Ðại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di chuyển Rf được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của dung môi: Trong đó: a là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử, tính bằng cm, b là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm. Rf: Chỉ có giá trị từ 0 đến l. 9 Hình: Các bước của quá trình sắc ký lớp mỏng II.6.3) Sắc ký cột: Sắc ký cột được tiến hành ở điều kiện áp suất khí quyển. Pha tĩnh là những hạt có kích thước tương đối lớn (50-150um), được nạp trong cột thủy tinh. Mẫu chất cần phân tích được đặt trên đầu cột, phía trên pha tĩnh (có một lớp thủy tinh che chở để lớp mặt không bị xáo trộn), bình chứa dung môi giải ly được đặt phái trên cao. Dung môi giải ly ra khỏi cột ở phần bên dưới cột được hứng vào những lọ nhỏ đặ ngay ống dẫn ra của cột. Phương pháp này thường làm cho quá trình tách bị chậm, hiệu quả thấp so với sắc ký lỏng cao áp (HPLC). Tuy vậy, sắc ký cột cũng có ưu điểm là pha tĩnh và các dụng cụ rẻ tiền, dễ kiếm, có thể triển khai với một lượng mẫu tương đối lớn. ¾ Các bước thực hiện sắc ký cột: -Lựa chọn chất hấp thu :pha tĩnh là silicagel loại thường, hợp chất không phân cực được giải ly khỏi cột trước, hợp chất phân cực được giải ly sau. Vơí 2 phân tử không phân cực, phân tử naò có trọng luợng phân tử lớn sẽ có tính phân cực mạnh hơn phân tử kia, nó bị pha tĩnh giữ lại trong cột nên di chuyển ra khỏi cột chậm hơn so với các phân tử nhỏ, và cũng có khi nóở lại lâu hơn trong cột so với phân tử tuy có tính phân cực. - Lựa chọn dung môi:Mẫu cần sắc ký đuợc hoà tan hoàn toàn trong dung môi phù hợp với nồng độ 10mg/ml, gọi là dung dịch mẫu (A). Chuẩn bị 4-6 tấm bản mỏng 2,5x10cm. Chấm lên những tấm bản này mỗi tấm khoảng 2-5ul dd(A). Mỗi bản mỏng được triển khai với một loại dung môi giải ly khác nhau, kế đó phát hiện bằng đèn UV hay thuốc thử. Với đơn dung môi sẽ dễ dàng thấy được dung môi nào phù hợp. Từ kết quả đó, cố gắng tìm một hỗn hợp dung môi, trong đó một dung môi phân cực và một dung môi kém phân cực thí dụ như ete dầu hỏa: etyl acetate. -Nạp chất hấp thu dạng khô vào cột: dùng kẹp giữ cho cột thẳng đứng trên giá, cho dung môi loại kém phân cực nhất vào khoảng 2/3 chiều cao cột. Cho chất hấp thu dạng khô vào thẳng trong cột, đều đặn, mỗi lần một lượng nhỏ, vừa cho vừa khỏ nhẹ vào thành cột. Khi lớp chất hấp thu đạt được chiều cao khoảng 2cm trong cột, thì mở nhẹ khoá ở bên dưới để cột để cho dung môi chảy ra, hứng vào một becher trống để bên dưới cột, dung môi này dẽ được rót lại lên đầu cột. Sau khi nạp xong, cho dung môi chảy qua chất hấp thu vài lần đến khi chất hấp thu trong cột đồng nhất. -Nạp mẫu: Mẫu ở dạng lỏng cho trực tiếp lên đầu cột sắc ký. Nếu mẫu ở dạng rắn thì hoà tan mẫu chất vào