Đề tài Đánh giá tính đa dạng của các virus gây bệnh xoan lá cà chua ở Việt Nam thong qua tách dòng, xác định và so sánh trình tự đoạn gen mã hóa cho protein vỏ

MỞ ĐẦU Cà chua (Lycopersicon esculentum Mill) là cây rau được gieo trồng rộng rãi ở nhiều nơi trên thế giới và có giá trị kinh tế cao. Quả cà chua ngoài tác dụng làm các món ăn, làm quả tươi tráng miệng, nước giải khát và những dạng thực phẩm chế biến cung cấp dinh dưỡng, vitamin, và chất khoáng, còn có tác dụng chữa bệnh thiếu vitamin C, bệnh về tim mạch, ung thư. Diện tích trồng cà chua liên tục tăng lên trong những năm gần đây. Từ năm 1990 đến 2002 diện tích cà chua trên thế giới từ 2,8 triệu ha tăng lên 3,7 triệu ha và sản lượng từ 76 triệu tấn tăng lên 100 triệu tấn. Ở Việt Nam, năm 1996 diện tích trồng cà chua khoảng 8 nghìn ha thì đến năm 2001 lên đến 18 nghìn ha, đóng góp hàng trăm tỉ đồng vào nền kinh tế quốc dân [1]. Năng suất cà chua bị giảm sút đáng kể do nhiều nguyên nhân như: giống, điều kiện canh tác, chế độ chăm sóc, bệnh do nấm, vi khuẩn, tuyến trùng. Trong đó bệnh do vi rút được xác định là tác nhân gây hại nghiêm trọng. Bệnh do vi rút không những làm giảm năng xuất mà còn làm giảm chất lượng của sản phẩm. Xoăn lá cà chua do vi rút (Tomato yellow leaf curl virus-TYLCV) gây ra là bệnh phổ biến và gây thiệt hại nặng nề nhất ở các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới [24]. Việc sử dụng các biện pháp canh tác, cách li vùng bị bệnh, loại bỏ cây bị bệnh, phun thuốc trừ sâu để phòng trừ bệnh vi rút vừa hiệu quả thấp vừa gây ảnh hưởng đến cây trồng, môi trường và cả con người. Những biện pháp này chỉ làm giảm sự lan truyền của bệnh và mang tính chất phòng chứ không thể ngăn chặn bệnh một cách triệt để. Hiện nay, cùng với sự tiến bộ của Công nghệ sinh học, tạo cây chuyển gen kháng lại vi rút được coi là một biện pháp hữu hiệu nhất để ngăn chặn và hạn chế tác hại do vi rút gây ra đồng thời đáp ứng yêu cầu phát triển một nền nông nghiệp sạch và bền vững. Vấn đề đặt ra là các giống cây chuyển gen thường có tính kháng đặc hiệu. Các giống cây chuyển gen được tạo ra bằng cách sử dụng các vật liệu di truyền từ các vi rút gây bệnh (gen CP, gen mã hoá replicase...) chỉ kháng lại được các dòng vi rút gây bệnh có gen được sử dụng để tạo cây chuyển gen hoặc là các dòng vi rút có quan hệ di truyền gần gũi. Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “ Đánh giá tính đa dạng của các virus gây bệnh xoan lá cà chua ở Việt Nam thong qua tách dòng, xác định và so sánh trình tự đoạn gen mã hóa cho protein vỏ” với mục đích thu được hiểu biết sâu sắc ở mức độ di truyền phân tử của các vi rút gây bệnh xoăn lá cà chua của Việt Nam từ đó làm cơ sở cho việc hoạch định các chiến lược thích hợp cho nghiên cứu tạo cây chuyển gen kháng bệnh xoăn lá cà chua ở Việt Nam. Ch­¬ng 1. Tæng quan tµi liÖu 1.1. §Æc ®iÓm ph©n lo¹i, nguån gèc, sù ph©n bè vµ gi¸ trÞ sö dông cña c©y Cµ chua 1.1.1. Ph©n lo¹i Cµ chua thuéc hä Cµ (Solanaceae), chi Lycopersicon. Chi nµy gåm 12 loµi, tÊt c¶ ®Òu cã nguån gèc tõ ch©u MÜ. §· cã nhiÒu t¸c gi¶ ®­a ra c¸c hÖ thèng ph©n lo¹i cho cµ chua, nh­ng cho ®Õn nay hÖ thèng ph©n lo¹i cña Breznep (1955) ®­îc sö dông réng r·i vµ ®¬n gi¶n nhÊt [21]. Chi Lycopersicon cã 2 chi phô: - Chi phô Eriopersicon: qu¶ lu«n xanh, cã säc tÝa, cã l«ng, h¹t nhá. Chi nµy cã 5 loµi hoang d¹i: Lycopersicon hisrutum Humb Lycopersicon peruviarum Mill Lycopersicon cheesmanii Lycopersicon chilense Lycopersicon glandulosum Chi phô Eulycopersicon: qu¶ chÝn ®á hoÆc vµng, hoa to. Chi nµy cã 2 loµi: Lycopersicon esculentum: cµ chua th«ng th­êng Lycopersicon pimpinellifolium: cµ chua b¸n hoang d¹i. 1.1.2. Nguån gèc vµ ph©n bè Tæ tiªn cña cµ chua trång ngµy nay lµ cµ chua anh ®µo (L. esculentum var. cerrasiforme) ®­îc t×m thÊy ë vïng nhiÖt ®íi, cËn nhiÖt ®íi ch©u MÜ. Tõ ch©u MÜ, cµ chua ®­îc c¸c th­¬ng gia Bå §µo Nha vµ T©y Ban Nha ®­a sang trång ë ch©u ¢u, ch©u ¸. Tõ ch©u ¢u, cµ chua ®­îc chuyÓn sang ch©u Phi nhê nh÷ng thùc d©n ®i khai ph¸ thuéc ®Þa. ë ViÖt Nam, mét sè nhµ nghiªn cøu cho r»ng cµ chua ®­îc ng­êi Ph¸p du nhËp vµo vµ nã ®· nhanh chãng trë thµnh mét lo¹i rau qu¶ phæ biÕn vµ ®­îc ­a chuéng. HiÖn nay, cµ chua ®­îc trång ë hÇu hÕt c¸c tØnh, trong ®ã diÖn tÝch trång tËp trung chñ yÕu ë c¸c tØnh H­ng Yªn, H¶i D­¬ng, B¾c Ninh, Hµ T©y, Nam §Þnh, v.v…[1]. 1.1.3. Gi¸ trÞ sö dông Cµ chua rÊt dÔ trång. ë ViÖt Nam, do ®iÒn kiÖn thêi tiÕt thuËn lîi, cã thÓ trång cµ chua ë hÇu hÕt c¸c tØnh vµ ®­îc trång gÇn nh­ quanh n¨m. Vô sím tõ th¸ng 7 ®Õn th¸ng 12, vô chÝnh tõ th¸ng 9 ®Õn th¸ng 2 n¨m sau, vô muén tõ th¸ng 11 ®Õn th¸ng 4 n¨m sau, vô xu©n hÌ tõ th¸ng 1 ®Õn th¸ng 6 [6]. Trong qu¶ cµ chua chÝn cã nhiÒu chÊt dinh d­ìng nh­: ®­êng, vitamin A, vitamin C vµ c¸c chÊt kho¸ng quan träng nh­: canxi, s¾t, phospho, kali, magiª, v.v…. Thµnh phÇn ho¸ häc trong qu¶ cµ chua chÝn gåm cã: n­íc (94-95%), chÊt kh« (5-6%), trong ®ã: 55% ®­êng, 21% chÊt kh«ng hoµ tan trong r­îu (nh­ protein, xenlul«z¬, pectin, polisaccarit), 12% axit h÷u c¬ (nh­ xitric, malic, galacturonic, pirolidoncacboxilic), 7% chÊt v« c¬ vµ 5% c¸c chÊt kh¸c (nh­ carotenoit, axit ascorbic, chÊt dÔ bay h¬i, amino axit, v.v…) [1]. Cµ chua kh«ng nh÷ng ®­îc dïng nh­ rau cung cÊp vitamin, chÊt kho¸ng mµ cßn cã nhiÒu t¸c dông vÒ mÆt y häc. Trong cµ chua cã chÊt licopen (thµnh phÇn t¹o mµu ®á cña cµ chua) cã kh¶ n¨ng gióp gi¶m nguy c¬ m¾c bÖnh tim m¹ch. Theo Vâ V¨n Chi (1997), qu¶ cµ chua cã vÞ ngät, tÝnh m¸t, cã t¸c dông t¹o n¨ng l­îng, lµm c©n b»ng tÕ bµo, khai vÞ, gi¶i nhiÖt, chèng ho¹i huyÕt…. Hµng ngµy, mçi ng­êi sö dông 100-200 g cµ chua sÏ tháa m·n nhu cÇu vitamin vµ chÊt kho¸ng cÇn thiÕt [3]. 1.2. BÖnh xo¨n l¸ cµ chua do vi rót 1.2.1. §Æc ®iÓm cña bÖnh xo¨n l¸ cµ chua do vi rót BÖnh xo¨n l¸ cµ chua do vi rót (Tomato yellow leaf curl) rÊt phæ biÕn ë khu vùc §«ng Nam ch©u ¸, c¸c n­íc Trung CËn §«ng vµ §«ng Phi. §©y lµ mét trong nh÷ng bÖnh do vi rót g©y thiÖt h¹i nÆng nÒ nhÊt cho cµ chua. Theo thèng kª cña Polston vµ Anderson (1997), tõ n¨m 1988 ®Õn n¨m 1995, bÖnh ®· lµm gi¶m 5% ®Õn 95% s¶n l­îng cµ chua ë n­íc Céng hßa Dominica, Venezuela vµ mét sè n­íc ë Trung MÜ, lµm thiÖt h¹i cho nÒn kinh tÕ tæng céng 140 triÖu ®« la MÜ [28]. BÖnh lan truyÒn qua vËt truyÒn trung gian lµ loµi bä phÊn (Bemisia tabaci). Bä phÊn chÝch hót nhùa c©y chñ yÕu ë ngän vµ l¸ non, mang TYLCV [4]. C©y bÞ bÖnh cã triÖu chøng xo¨n ngän l¸, lµm cho l¸ co qu¾t, c©y thÊp nhá, hoa ph¸t triÓn kÐm, dÔ bÞ rông. C©y cßn nhá nÕu bÞ nhiÔm bÖnh sÏ cßi cäc, kh«ng thÓ ph¸t triÓn [8]. ë ViÖt Nam, bÖnh xo¨n l¸ cµ chua do vi rót ph¸t triÓn m¹nh trong vô cµ chua sím vµ vô xu©n hÌ. Khi nhiÖt ®é kh«ng khÝ tõ 25-300C, ®é Èm h¬n 70%, bä phÊn në ré, mËt ®é bä phÊn trªn mét c©y t¨ng dÉn ®Õn t¨ng kh¶ n¨ng truyÒn bÖnh [8].  1.2.2. Vi rót g©y bÖnh xo¨n l¸ cµ chua 1.2.2.1. §Æc ®iÓm ph©n lo¹i Vi rót g©y bÖnh xo¨n l¸ cµ chua Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) thuéc hä Geminiviridae, chi Begomovirus. Dùa vµo sù t­¬ng ®ång vÒ tr×nh tù nucleotit, t¸c nh©n truyÒn bÖnh vµ phæ vËt chñ, hä Geminiviridae ®­îc chia thµnh bèn chi: Mastrevirus, Begomovirus, Curtovirus vµ Topocuvirus [37]. Trong ®ã Begomovirus lµ chi cã sè l­îng loµi lín nhÊt trong hä, t¸c nh©n truyÒn bÖnh lµ bä phÊn (Bemisia tabaci), vËt chñ lµ c©y 2 l¸ mÇm nh­: ®Ëu, d­a hÊu, b«ng, hå tiªu, thuèc l¸, khoai t©y vµ cµ chua… [25]. Kh¸c víi c¸c chi kh¸c trong hä ®Òu cã hÖ gen gåm mét vßng ADN sîi ®¬n, hÖ gen cña c¸c loµi trong chi Begomovirus t×m thÊy ë ch©u MÜ cã thÓ gåm hai vßng ADN sîi ®¬n. Trong khi ®ã, hÖ gen cña nh÷ng loµi t×m thÊy ë ch©u ¸, ch©u ©u vµ ch©u Phi cã thÓ cã mét vßng hoÆc hai vßng ADN sîi ®¬n [36]. 1.2.2.2. §Æc ®iÓm cÊu t¹o Geminivirus ®­îc Goodman m« t¶ lÇn ®Çu tiªn vµo n¨m 1977. TYLCV cã d¹ng h×nh chµy, kÝch th­íc kho¶ng 18 nm x 30 nm. Líp protein vá cã träng l­îng kho¶ng 28-34 x 103 ®vc gåm 22 capsom gièng nhau, mçi capsom gåm 5 ph©n tö protein vá [25]. TYLCV lÇn ®Çu tiªn ®­îc ph©n lËp hoµn chØnh vµo n¨m 1991 ë Sardinia [19] vµ Israel [26]. HÖ gen gåm mét vßng ADN sîi ®¬n, cã kÝch th­íc kho¶ng 2,8 Kb, gåm s¸u gen n»m trong hai vïng dÞch m· ng­îc chiÒu, ng¨n c¸ch bëi mét vïng liªn gen cã kho¶ng 300 nucleotit. Hä Geminiviridae cã vïng khëi ®Çu sao chÐp n»m trong vïng liªn gen ®Òu cã tr×nh tù lµ TAATATTAC (vïng cã dÊu chÊm ®en) [25], [37].
Bèn gen: C1, C2, C3, C4, cã chiÒu dÞch m· ng­îc chiÒu víi hai gen V1 vµ V2. Trong ®ã gen V1 m· hãa lo¹i protein cÇn thiÕt cho sù t¹o vá ngoµi genom, sù lan truyÒn vµ nhËn ra vect¬ truyÒn nhiÔm ; gen C1 m· hãa lo¹i protein cÇn thiÕt cho qu¸ tr×nh sao chÐp cña c¶ hai vïng dÞch m· ; gen C2 m· hãa protein cã vai trß ho¹t hãa qu¸ tr×nh phiªn m· gen V1 vµ V2 ; gen C3 m· hãa lo¹i protein cã t¸c dông ho¹t hãa qu¸ tr×nh sao m· vµ cïng víi gen C1 t¨ng c­êng kh¶ n¨ng ph©n chia hÖ gen cña vi rót ; gen C4, V2 m· hãa protein liªn quan ®Õn sù g©y bÖnh ®èi víi thùc vËt vµ sù vËn chuyÓn cña vi rót [37]. 1.2.2.3. Sù ®a d¹ng vÒ hÖ gen cña c¸c vi rót g©y bÖnh xo¨n l¸ cµ chua Bëi nh÷ng thiÖt h¹i nghiªm träng do TYLCV g©y ra, nghiªn cøu vÒ TYLCV ®­îc nhiÒu n­íc quan t©m nh­: Th¸i Lan, Australia, Trung quèc, Brazil, MÜ, Ên §é, §µi Loan, NhËt B¶n…. HiÖn nay, ngoµi lo¹i vi rót g©y bÖnh xo¨n l¸ cµ chua cã mét vßng ADN sîi ®¬n ng­êi ta cßn ph¸t hiÖn ra lo¹i vi rót cã hai vßng ADN sîi ®¬n kÝ hiÖu lµ vßng ADN-A vµ vßng ADN-B [15], [27]. Trong ®ã, vßng ADN-A gåm c¸c gen m· ho¸ protein cÇn thiÕt cho sù sao chÐp vµ l¾p r¸p cña vi rót, cßn vßng ADN-B gåm c¸c gen m· ho¸ protein cÇn thiÕt cho sù lan truyÒn cña vi rót [36].
Cã lo¹i vi rót còng cã hai vßng ADN sîi ®¬n, mét lµ vßng ADN-A cßn vßng thø hai kh«ng ph¶i lµ vßng ADN-B mµ vßng ADN-B ®­îc thay thÕ b»ng mét vßng ADN vÖ tinh, gäi lµ vßng ADN-beta [20]. Tr×nh tù nucleotit cña vßng ADN-beta ®­îc ph©n lËp ë nh÷ng vïng kh¸c nhau cã sù kh¸c nhau râ rÖt. Ng­êi ta cßn thÊy r»ng, víi nh÷ng c©y cµ chua bÞ nhiÔm TYLCV cã vßng ADN-beta th× biÓu hiÖn bÖnh nÆng h¬n c©y nhiÔm TYLCV kh«ng mang vßng ADN-beta [40]. Chowda Reddy vµ céng sù (2005) ®· tiÕn hµnh thÝ nghiÖm víi 103 mÉu cµ chua tõ nh÷ng vïng trång cµ chua chÝnh ë Ên ®é, cã 81 mÉu cho kÕt qu¶ d­¬ng tÝnh víi vi rót TYLCV. Trong ®ã 65 mÉu, hÖ gen vi rót gåm hai vßng ADN sîi ®¬n, mét vßng lµ ADN-A, vßng thø hai hoÆc lµ vßng ADN-B hoÆc lµ vßng ADN-beta [13]. Li vµ céng sù (2004) ®· tiÕn hµnh thÝ nghiÖm víi 14 mÉu cµ chua thu tõ ba huyÖn trong tØnh V©n Nam, Trung Quèc. C¶ 14 mÉu ®Òu cho kÕt qu¶ d­¬ng tÝnh víi TYLCV vµ nh÷ng chñng TYLCV nµy thuéc vµo bèn nhãm kh¸c nhau. Nhãm I vµ III hÖ gen ®Òu cã vßng ADN-beta. Khi ph©n lËp hoµn chØnh tr×nh tù nucleotit vßng ADN-beta víi ba mÉu ë nhãm III, th× ng­êi ta thu ®­îc nh÷ng tr×nh tù ADN-beta kh¸c víi nh÷ng vßng ADN-beta c«ng bè tr­íc ®ã [23]. ë NhËt B¶n Shimizu vµ Ikeami (1999) ®· tiÕn hµnh ph©n lËp hÖ gen cña chñng vi rót TYLCV cã mét vßng ADN sîi ®¬n. Qua kÕt qu¶ so s¸nh cho thÊy tr×nh tù nucleotit cña chñng vi rót ph©n lËp gièng nhÊt lµ víi TYLCTwV (TYLCV ë §µi Loan) (76%), so víi c¸c chñng vi rót kh¸c th× chóng cã sù kh¸c nhau t­¬ng ®èi [32]. Tr×nh tù c¸c gen cÊu tróc cña vi rót nh­ gen C1, C2, C3, C4, V1, V2 m· ho¸ c¸c protein chøc n¨ng t­¬ng øng cña vi rót còng cã sù kh¸c nhau ë nh÷ng lo¹i vi rót x©m nhiÔm ë c©y trång kh¸c vïng. Cã lo¹i vi rót cã vïng tr×nh tù c¸c nucleotit hoµn toµn kh«ng gièng víi nh÷ng vïng t­¬ng øng cña nh÷ng lo¹i vi rót ®· ph¸t hiÖn tr­íc ®ã [39]. Xie vµ Zhou (2003) ë Trung Quèc ®· ph©n lËp hoµn chØnh vßng ADN-A cña TYLCV th× kÕt qña cho thÊy ADN-A gièng nhÊt víi TYLCThV (TYLCV ë Th¸i Lan) gièng 84%. Vßng ADN-A cña chñng vi rót ph©n lËp cã vïng tõ nucleotit 74-2071 lµ gièng 95% víi TYLCThV, vïng nucleotit 2071-2457 gièng 91% víi PeLCBDV (Pepper leaf curl virus from Bangladesh), vµ vïng cßn l¹i th× rÊt kh¸c víi nh÷ng chñng vi rót ®­îc c«ng bè tr×nh tù tr­íc ®ã [39]. Qua nh÷ng nghiªn cøu trªn chóng ta cã thÓ thÊy r»ng c¸c vi rót g©y bÖnh xo¨n l¸ cµ chua cã ®é ®a d¹ng rÊt lín vÒ bé gen. Ngoµi ra c¸c nghiªn cøu nµy cßn cho thÊy cã x¶y ra sù t¸i tæ hîp cña c¸c chñng TYLCV ®Ó h×nh thµnh c¸c chñng míi. 1.2.2.4. C¬ chÕ l©y truyÒn cña vi rót TYLCV x©m nhËp vµo c©y trång qua bä phÊn tr¾ng (Bemisia tabaci). Khi nhiÔm vµo tÕ bµo thùc vËt, phÇn ADN vßng ®¬n cña vi rót sÏ x©m nhËp vµo nh©n cña tÕ bµo chñ vµ sö dông nh÷ng nguyªn liÖu cña vËt chñ ®Ó sao chÐp vµ tæng hîp ra protein vá, hoµn thiÖn cÊu tróc vi rót. Theo Revington vµ céng sù (1989), sù sao chÐp hÖ gen cña vi rót b¾t ®Çu tõ mét vÞ trÝ ®Æc biÖt trong vïng më ®Çu gåm kho¶ng 30 nucleotit vµ diÔn ra theo 2 h­íng quanh ph©n tö, t¹o thµnh hai vßng khÐp kÝn [28]. Mét nuclease c¾t mét trong hai vßng vµ ®Çu 3’-OH cña sîi bÞ c¾t sÏ lµm måi ®Ó g¾n thªm c¸c nucleotit. Sîi nguyªn vÑn bæ sung ®­îc lµm khu«n. Nh­ vËy, ®Çu 5’-OH bÞ thay thÕ vµ sau ®ã ®­îc sao chÐp. Theo c¸ch nµy ph©n tö sîi kÐp ®­îc tæng hîp cã thÓ dµi gÊp nhiÒu lÇn NST cña vi rót, sau ®ã bÞ c¾t thµnh nh÷ng NST cña h¹t vi rót. C¸c NST nµy sÏ ®­îc dÞch m· ®Ó t¹o c¸c protein cÇn thiÕt cho vi rót [35]. 1.3. c©y chuyÓn gen kh¸ng vi rót vµ mét sè thµnh tùu ®· ®¹t ®­îc trong c¶i tiÕn gièng c©y trång b»ng c«ng nghÖ gen 1.3.1. C¬ chÕ kh¸ng bÖnh vi rót cña c©y chuyÓn gen C©y trång cã tÝnh kh¸ng kh¸c nhau víi c¸c lo¹i vi rót kh¸c nhau, nã cã thÓ lµ vËt chñ hoÆc kh«ng lµ vËt chñ cña nh÷ng lo¹i vi rót x¸c ®Þnh. Vi rót cã thÓ x©m nhiÔm vµo c©y chñ, lan truyÒn g©y bÖnh lµm c©y chñ gi¶m hay mÊt kh¶ n¨ng sinh tr­ëng, ph¸t triÓn, sinh s¶n. Trong qu¸ tr×nh tiÕn hãa, vi rót dÇn h×nh thµnh nh÷ng c¬ chÕ b¶o vÖ khái tÝnh kh¸ng tù nhiªn cña vËt chñ ®Ó dÔ dµng x©m nhËp vµ g©y bÖnh [5]. Víi c©y chuyÓn gen, chóng ta ®· t¹o ra tÝnh kh¸ng tÝch cùc vµ hiÖu qu¶ cho c©y trång chèng l¹i vi rót. Cã nhiÒu c¸ch gi¶i thÝch vÒ tÝnh kh¸ng cña c©y chuyÓn gen, theo Baulcombe (1996) tÝnh kh¸ng cña c©y chuyÓn gen gäi lµ tÝnh kh¸ng cã ®­îc nhê chÝnh yÕu tè g©y bÖnh-PDR (pathogen-derived resistance) [12]. Gen ®­îc chuyÓn vµo c©y lµ nh÷ng gen cã chøc n¨ng kh¸c nhau cña vi rót nh­: gen m· hãa protein vá, gen m· hãa protein vËn chuyÓn…, hay gen ®­îc thiÕt kÕ cã ®Çu lµ nh÷ng ®o¹n lÆp l¹i ng­îc chiÒu. PDR cã thÓ cã c¬ chÕ th«ng qua protein (post translation), s¶n phÈm cña nh÷ng gen ®­îc chuyÓn vµo sÏ c¶n trë qu¸ tr×nh t¹o líp protein vá, lµm qu¸ tr×nh l¾p r¸p kh«ng x¶y ra ®­îc vµ c¶n trë sù lan truyÒn cña vi rót trong c©y. PDR cã thÓ cã c¬ chÕ th«ng qua ARN (post transcription). MÆc dï c¬ chÕ cña nã ch­a ®­îc x¸c ®Þnh râ, xong cã thÓ lµ liªn quan ®Õn ARN sîi ®«i vµ nh÷ng sîi ARN ®¬n ng¾n, RdRps, ARN helicases vµ RNase [16]. Khi vi rót TYLCV x©m nhËp, trong tÕ bµo xuÊt hiÖn tÝn hiÖu b¶o vÖ, sîi ARN ®«i ®­îc t¹o thµnh tõ nh÷ng ARN cña vi rót vµ ARN cña nh÷ng gen chøc n¨ng cña vi rót TYLCV ®· ®­îc chuyÓn vµo c©y tr­íc ®ã d­íi t¸c dông cña RdRp. Sîi ARN nµy sÏ bÞ c¾t thµnh nh÷ng ®o¹n ARN ®«i ng¾n, víi hai ®Çu cã 2-3 nucleotit nh« ra, d­íi t¸c dông cña Dicer (mét nuclease). Nh÷ng ®o¹n ARN ng¾n nµy cã t¸c dông lµm måi ®Ó tæng hîp nªn nh÷ng sîi ARN ®«i, dùa vµo nh÷ng ARN l¹ lµm khu«n (chÝnh lµ nh÷ng ARN cña vi rót), vµ nã cßn t¹o phøc RNase, khi kÕt hîp víi protein elF2C (nh©n tè khëi ®Çu), ARN helicase, Dicer (mét lo¹i nuclease). Phøc nµy cã thÓ c¾t nh÷ng ARN ®«i tiÕp tôc l¹i t¹o thµnh nh÷ng ARN ®«i ng¾n víi hai ®Çu cã 2-3 nucleotit nh« ra, ARN nµy l¹i lµm mæi, ®Ó lo¹i bá dÇn nh÷ng ARN l¹. Nh­ vËy theo m« h×nh kh¸ng nµy th× hiÖu qu¶ cña nã phô thuéc vµo ®é t­¬ng ®ång cña nh÷ng ®o¹n ARN lµm måi víi ARN l¹. 1.3.2. Mét sè thµnh tùu ®· ®¹t ®­îc trong c¶i tiÕn gièng c©y trång b»ng c«ng nghÖ gen ViÖc chuyÓn gen vµo c©y trång cho ®Õn nay kh«ng lµ vÊn ®Ò cßn ph¶i tranh c·i n÷a mµ ®· trë thµnh kÜ thuËt th«ng dông trong t¹o gièng c©y trång. §· cã h¬n 50 lo¹i gen ®· ®­îc chuyÓn n¹p vµo c©y trång vµ Ýt nhÊt cã kho¶ng 400 lo¹i c©y mang gen biÕn n¹p ®­îc trång thö ë ®iÒu kiÖn ®ång ruéng nh­ cµ chua, b«ng, c¶i dÇu, ng«, khoai t©y…[2], víi c¸c ®Æc tÝnh nh­: kh¸ng vi rót, kh¸ng c«n trïng, chÝn chËm, chèng chÞu chÊt diÖt cá, t¨ng hµm l­îng chÊt dinh d­ìng…[10]. §Õn hÕt n¨m 2002 ®· cã trªn 52,6 triÖu ha c©y trång chuyÓn gen ®­îc canh t¸c trªn thÕ giíi [18]. C¸c quèc gia hiÖn nay trång c¸c c©y chuyÓn gen nh­: Achentina, óc, Bungary, Canada, Trung Quèc, Ph¸p, §øc, Mexico, Rumani, T©y Ban Nha, Nam Phi, Urugoay, Brazil vµ Mü [10]. Bªn c¹nh nh÷ng vÊn ®Ò ch­a râ vÒ c©y chuyÓn gen nh­: mèi nguy c¬ trong viÖc v« t×nh ®­a nh÷ng chÊt g©y dÞ øng hoÆc lµm gi¶m dinh d­ìng s¶n phÈm, kh¶ n¨ng ph¸t t¸n nh÷ng gen biÕn n¹p trong c©y trång sang hä hµng hoang d¹i…, th× chóng ta kh«ng thÓ phñ nhËn nh÷ng gi¸ trÞ kinh tÕ cña nã ®em l¹i. Do c¸c ®Æc tÝnh ­u viÖt cña nã, c©y chuyÓn gen ngµy cµng ®­îc nghiªn cøu vµ øng dông réng r·i. 1.4. Mét sè kü thuËt sinh häc ph©n tö øng dông trong nghiªn cøu bÖnh vi rót 1.4.1. KÜ thuËt PCR KÜ thuËt PCR (Polymerase Chain Reaction-chuçi ph¶n øng trïng hîp nhê Polymerase) do Karl Mullis vµ céng sù ph¸t minh n¨m 1985. §©y lµ kÜ thuËt nh©n nhanh mét ®o¹n ADN, dùa vµo mét ADN khu«n (lµ mét ®o¹n ADN mang ®o¹n ADN ng¾n cÇn nh©n) vµ cÆp måi chuyªn biÖt. Måi lµ nh÷ng ®o¹n ADN ng¾n, cã kh¶ n¨ng b¾t cÆp bæ sung víi mét ®Çu cña m¹ch khu«n vµ nhê enzym ADN polimerase (ngµy nay sö dông phæ biÕn lo¹i enzym bÒn víi nhiÖt nh­ Taq polimerase) xóc t¸c nèi dµi måi ®Ó thµnh m¹ch míi, trong sù cã mÆt cña c¸c nucleotit tù do (dNTP), Mg2+…. Ph¶n øng PCR lµ mét chuçi nhiÒu chu k× nèi tiÕp. Mçi chu k× gåm ba b­íc: + B­íc 1 -BiÕn tÝnh ADN- ADN ®­îc biÕn tÝnh ë nhiÖt ®é cao h¬n nhiÖt ®é Tm cña ph©n tö, th­êng kho¶ng 94-950C trong vßng tõ 30 gi©y ®Õn 1 phót, ®Ó t¹o ADN sîi ®¬n. + B­íc 2 -B¾t cÆp- Måi b¾t cÆp víi ADN, ë nhiÖt ®é tõ 40-700C, tïy thuéc vµo tØ lÖ vµ sè l­îng tõng lo¹i nucleotit cña ®o¹n måi vµ kÐo dµi kho¶ng 30 gi©y-1 phót. + B­íc 3 -Tæng hîp chuçi ADN- NhiÖt ®é ®­îc t¨ng lªn 720C, gióp cho enzym Taq polimerase ho¹t ®éng tèt nhÊt, ®Ó tæng hîp m¹ch ADN míi bæ sung theo chiÒu 5’-3’ b¾t ®Çu tõ vÞ trÝ g¾n måi, thêi gian tæng hîp tïy thuéc vµo ®é dµi cña tr×nh tù ADN cÇn khuÕch ®¹i, tõ 30 gi©y ®Õn vµi phót. Sè l­îng ADN sau mçi mét chu k× t¨ng lªn gÊp ®«i. VËy sau n chu k× th× sè l­îng chuçi ADN sÏ lµ 2n [7]. 1.4.2. Kü thuËt t¸ch dßng T¸ch dßng thùc chÊt lµ nh»m thu mét gen hay mét tr×nh tù ADN víi sè l­îng lín. §Çu tiªn, lµ g¾n mét gen mong muèn vµo vect¬ t¸ch dßng ®Ó t¹o nªn vect¬ t¸i tæ hîp sau ®ã chuyÓn vect¬ t¸i tæ hîp vµo tÕ bµo chñ. Trong c¸c tÕ bµo chñ, c¸c vect¬ t¸ch dßng ®­îc nh©n lªn mét sè l­îng lín b¶n sao cña gen ban ®Çu. Ta sÏ thu ®­îc ADN qua c¸c b­íc t¸ch chiÕt. T¸ch dßng gåm 5 b­íc: + Chän vµ xö lÝ vect¬: Vect¬ t¸ch dßng lµ c¸c ph©n tö ADN cã kÝch th­íc nhá cho phÐp g¾n c¸c gen, cã kh¶ n¨ng t¸i b¶n kh«ng phô thuéc vµo sù ph©n chia cña tÕ bµo. Vect¬ ®­îc xö lÝ b»ng c¸c enzym giíi h¹n, vµ hai ®Çu chç mèi c¾t ®­îc xö lÝ ®Ó kh«ng thÓ nèi l¹i víi nhau. + Xö lÝ ADN cÇn ®­îc t¹o dßng: Chän nh÷ng ®o¹n ADN cã kÝch th­íc gÇn gièng nhau vµ t­¬ng øng víi vect¬ ®· chän, sau ®ã ADN ®­îc xö lÝ ®Ó cã hai ®Çu t­¬ng øng víi vect¬ (b»ng c¸ch xö lÝ víi cïng lo¹i enzym víi vect¬). + T¹o vect¬ t¸i tæ hîp: Trén vect¬ t¸ch dßng vµ c¸c ®o¹n ADN cÇn g¾n víi mét tØ lÖ x¸c ®Þnh, cã sù tham gia cña ADN ligase ®Ó t¹o vect¬ t¸i tæ hîp. ADN sÏ g¾n vµo vect¬ ë hai ®Çu t­¬ng øng. + ChuyÓn vect¬ t¸i tæ hîp vµo tÕ bµo chñ: ChuyÓn b»ng ph­¬ng ph¸p biÕn n¹p, víi môc ®Ých qua tÕ bµo chñ c¸c vect¬ t¸i tæ hîp sÏ ®­îc nh©n lªn víi sè l­îng lín c¸c b¶n sao. C¸c tÕ bµo chñ ®­îc chän phï hîp víi vect¬ t¸i tæ hîp, th­êng lµ tÕ bµo E.coli. + Chän vµ sµng läc ra c¸c thÓ t¸i tæ hîp: Nu«i cÊy vi khuÈn cã vect¬ t¸i tæ hîp trong m«i tr­êng thÝch hîp. Sö dông c¸c gen chØ thÞ ®Ó tiÕn hµnh chän läc c¸c khuÈn mang gen t¸i tæ hîp [4]. 1.4.3. Kü thuËt PCR trùc tiÕp tõ khuÈn l¹c (colony-PCR) HiÖn nay, cã rÊt nhiÒu ph­¬ng ph¸p ®Ó x¸c ®Þnh tÕ bµo vi khuÈn cã plasmit mang gen mong muèn, nh­ ph­¬ng ph¸p colony-PCR, c¾t plasmit b»ng c¸c enzym h¹n chÕ, hoÆc PCR tõ plasmit. Trong ®ã ph­¬ng ph¸p colony-PCR cho phÐp ph¸t hiÖn nhanh khuÈn l¹c mang plasmit t¸i tæ hîp mong muèn. Ph­¬ng ph¸p nµy cã ­u ®iÓm lµ nhanh, Ýt tèn kÐm vµ ®¬n gi¶n. HiÖn nay, kü thuËt nµy ®­îc øng dông rÊt réng r·i trong nghiªn cøu sinh häc ph©n tö. Nguyªn t¾c kü thuËt colony-PCR dùa trªn nguyªn t¾c kü thuËt PCR, chØ kh¸c ë chç mÉu ADN ®­îc thay b»ng ADN plasmit gi¶i phãng tõ khuÈn l¹c. ë nhiÖt ®é cao (94-950C), mµn