Đề tài Đánh giá tính đa hình ADN và khả năng chọn dòng tế bào đột biến ở một số giống lúa đặc sản

MỞ ĐẦU Lúa là cây lương thực quan trọng thứ ba trên thế giới, 90% diện tích trồng lúa và tiêu thụ chủ yếu ở châu Á... Hiện nay lúa được trồng trong những điều kiện sinh thái và khí hậu rất khác nhau ở cả ba vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và ôn đới trên tất cả các châu lục [8, 12]. Việt Nam là một nước nông nghiệp với truyền thống trồng cây lúa nước và được xếp vào hàng những nước xuất khẩu gạo hàng đầu thế giới. Sản lượng gạo xuất khẩu năm 1999 lên tới 4,3 triệu tấn song hiệu quả xuất khẩu và khả năng cạnh tranh trên thị trường quốc tế còn thấp, một trong những nguyên nhân là do chất lượng gạo chưa đáp ứng được nhu cầu về phẩm chất của thị hiếu người tiêu dùng. Trong khi đó nhiều địa phương của nước ta có những giống lúa rất quý như Tám Thơm, Tám Ấp Bẹ, Dự Thơm,Tẻ Di Hương... hạt trong, cơm dẻo và rất thơm ngon. Đây là những giống có tiềm năng nâng cao giá trị xuất khẩu nhưng năng suất còn thấp vì cây cao, thân mềm chống đổ kém, lá dài, mỏng và rủ, hạt thưa, thời gian sinh trưởng kéo dài, phản ứng chặt chẽ với ánh sáng ngày ngắn [4, 11, 12]. Bằng phương pháp chọn dòng tế bào mang biến dị soma Viện Công nghệ sinh học đã chọn tạo được ba giống lúa DR1, DR2 và DR3 cho năng suất cao, ổn định và có khả năng chịu hạn, chịu lạnh tốt hơn so với giống gốc X11 và CR203 [14]. Sử dụng công nghệ tế bào thực vật, công nghệ gen kết hợp với kỹ thuật gây đột biến bằng tia gamma cho phép cải biến một số đặc điểm nông học còn hạn chế của các giống lúa nêu trên theo hướng hạ thấp chiều cao cây, chống đổ và rút ngắn thời gian sinh trưởng. Mặt khác để nắm vững đặc điểm của các giống lúa đặc sản trước hết cần sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử để đánh giá sự đa dạng về di truyền của nhóm lúa Tám thu thập được ở các địa phương khác nhau. Xuất phát từ cơ sở trên, chúng tôi thực hiện đề tài "Đánh giá tính đa hình ADN và khả năng chọn dòng tế bào đột biến ở một số giống lúa đặc sản". Nhằm tìm ra mối quan hệ di truyền và đánh giá khả năng tạo mô sẹo, tái sinh cây lúa từ mô sẹo xử lý tia gamma để xác định ngưỡng chiếu xạ thích hợp đối với mô sẹo của một số giống lúa đặc sản góp phần vào việc chọn tạo giống lúa mới. Ch­¬ng 1. Tæng quan tµi liÖu 1.1. øng dông kü thuËt RAPD - PCR trong nghiªn cøu ®a h×nh ADN 1.1.1. Ph¶n øng chuçi trïng hîp (PCR) Ph­¬ng ph¸p PCR (Polymerase Chain Reaction) do Mullis vµ CS ph¸t minh n¨m 1985. Thùc chÊt ®©y lµ mét ph­¬ng ph¸p t¹o dßng in vitro, kh«ng cÇn sù hiÖn diÖn cña tÕ bµo. §iÒu kiÖn cña ph¶n øng PCR: ADN khu«n, 2 ®o¹n måi (mçi måi dµi tõ 18 - 24 nucleotit), Taq polymeraza (lµ enzym chÞu nhiÖt), bèn lo¹i deoxyribonucleotit triphosphat (dATP, dGTP, dTTP, dCTP), dung dÞch ®Öm vµ ion Mg++ [21]. Tr­íc ®©y ph¶n øng PCR th­êng dïng ADN polymeraza I cña E.coli vµ T4 ADN polymeraza. C¸c enzym nµy bÞ bÊt ho¹t ë nhiÖt ®é cao nªn qua mçi chu kú ph¶n øng ph¶i phæ sung thªm enzym. ViÖc ph¸t hiÖn ra c¸c lo¹i ADN polymeraza bÒn nhiÖt (Vert ADN polymeraza, Pfu ADN polymeraza, Taq ADN polymeraza...) ®· cho phÐp qu¸ tr×nh nh©n b¶n ®­îc thùc hiÖn tù ®éng ho¸. Ngoµi ®é bÒn nhiÖt c¸c enzym nµy cßn kh¸c nhau vÒ kh¶ n¨ng kÐo dµi chuçi ADN cÇn nh©n b¶n. Th«ng dông nhÊt lµ Taq ADN polymeraza ®­îc t¸ch tõ vi khuÈn chÞu nhiÖt Thermus aquaticus, sèng ë nguån n­íc nãng 940C- 1000C. Enzym nµy ho¹t ®éng tèt nhÊt ë 700C - 800C. Träng l­îng ph©n tö cña Taq ADN polymeraza lµ 94 KD, gen tæng hîp dµi 2499 cÆp baz¬ nit¬, m· ho¸ cho 832 axit amin [34]. N¨m 1988, Saiki ®· chØ ra r»ng ho¹t tÝnh cña Taq polymeraza gi¶m 50% sau 130 phót ë 92,50C; sau 40 phót ë 950C vµ sau 5-6 phót ë 970C. MÆt kh¸c, nång ®é ion Mg++ vµ dNTP trong hçn hîp ph¶n øng còng ¶nh h­ëng rÊt nhiÒu ®Õn ho¹t tÝnh cña Taq polymeraza [23, 34]. §o¹n måi lµ nh÷ng ®o¹n oligonucleotit ®­îc thiÕt kÕ bæ sung víi m¹ch ADN khu«n. §Ó g¾n måi mét c¸ch ®Æc hiÖu, ®o¹n måi th­êng ®­îc tæng hîp dµi tõ 18 - 24 nucleotit. Ph¶n øng PCR dïng mét cÆp måi gåm mét måi xu«i (forward) vµ mét m«i ng­îc (reverse), måi lu«n g¾n víi ADN khu«n theo chiÒu tõ 3’ - 5’ vµ ADN polymeraza kÐo dµi chuçi tæng hîp vÒ ®Çu 5’. Nh×n chung, tr×nh tù måi, nhiÖt ®é g¾n måi vµ nång ®é måi trong ph¶n øng PCR lµ nh÷ng nh©n tè quyÕt ®Þnh sù thµnh c«ng cña ph¶n øng. Ph¶n øng PCR lµ mét chuæi gåm nhiÒu chu kú nèi tiÕp nhau. Mçi chu kú gåm ba giai ®o¹n sau: - Giai ®o¹n 1: biÕn tÝnh ADN (denaturing), ë nhiÖt ®é kho¶ng tõ 940C - 950C, trong thêi gian ng¾n tõ 30 gi©y - 1 phót, ®Ó t¸ch sîi ADN kÐp thµnh 2 sîi ADN ®¬n. - Giai ®o¹n 2: giai ®o¹n g¾n måi (annealing), ë nhiÖt ®é 400C - 600C, hai ®o¹n måi sÏ g¾n vµo ADN khu«n ë vÞ trÝ m· t­¬ng ®ång theo nguyªn t¾c bæ sung ë hai ®Çu ®o¹n ADN cÇn nh©n. NhiÖt ®é cña b­íc g¾n måi tuú thuéc vµo lo¹i tõng måi cô thÓ, ®­îc tÝnh to¸n dùa trªn nhiÖt ®é nãng ch¶y (Tm) cña ®o¹n måi. V× vËy giai ®o¹n nµy quyÕt ®Þnh tÝnh ®Æc hiÖu cña ph¶n øng PCR. C«ng thøc tÝnh nhiÖt ®é nãng ch¶y (Tm) cña ®o¹n måi: Tm =81.5 + 16.6 (log10{J+}) + 0.41 (%G + C) - (600/I) - 0.63 (%FA) [23]. Trong ®ã: {J+} : nång ®é cña c¸c cation ho¸ trÞ I. FA : chÊt dïng ®Ó g©y biÕn tÝnh ADN. I : chiÒu dµi cña måi. - Giai ®o¹n 3: giai ®o¹n kÐo dµi (extension) ë nhiÖt ®é 720C, ADN Taq polymeraza ho¹t ®éng tæng hîp, kÐo dµi c¸c m¹ch theo nguyªn t¾c bæ sung tõ hai ®Çu sîi khu«n ban ®Çu. Geifand vµ White (1990) ®· th«ng b¸o vÒ tèc ®é tæng hîp cña Taq lµ: 150 nucleotit/gi©y ë 750C - 800C; >60 nucleotit/gi©y ë 700C; 24 nucleotit/gi©y ë 550C; 1,5 nucleotit/gi©y ë 370C; 0,25 nucleotit/gi©y ë 220C [23]. Sau mét chu kú gåm ba giai ®o¹n nh­ trªn, tõ mét ph©n tö ADN khu«n ®­îc nh©n lªn thµnh hai, c¸c ®o¹n ADN võa nh©n b¶n trong mçi chu kú l¹i lµm khu«n cho chu kú nh©n b¶n tiÕp theo v× ®Çu tËn cïng cña s¶n phÈm bæ sung víi måi. Do ®ã sau mçi chu kú tæng hîp ®ù¬c l­îng ADN gÊp ®«i vµ nh­ vËy sau n chu kú nh©n b¶n sÏ t¹o ra 2n b¶n ADN khu«n ban ®Çu [13]. C«ng thøc: Y = x.2n Trong ®ã: Y: lµ tæng sè b¶n sao ADN x: lµ sè khu«n ADN ban ®Çu n: sè chu kú PCR lµ mét c«ng cô h÷u hiÖu cho viÖc ph©n tÝch bé genom cña ®éng vËt vµ thùc vËt v× nã cã kh¶ n¨ng t¹o ra mét l­îng lín tr×nh tù ®Æc hiÖu. øng dông cña PCR vµo nhiÒu môc ®Ých kh¸c nhau, bao gåm x¸c ®Þnh tr×nh tù cña ADN ®­îc nh©n b¶n, nh©n b¶n quÇn thÓ mARN ®Ó lµm mÉu lai, x¸c ®Þnh tr×nh tù ®Æc hiÖu tõ cADN hay th­ viÖn gen, x¸c ®Þnh sinh vËt chuyÓn gen, ph©n tÝch tiÕn ho¸, ph©n tÝch sù ®a d¹ng di truyÒn ë møc ®é ADN trong vµ gi÷a c¸c quÇn thÓ. HiÖn nay PCR ®­îc xem lµ mét ph­¬ng ph¸p nhanh vµ t­¬ng ®èi ®¬n gi¶n ®Ó ®¸nh gi¸ c©y ®­îc chuyÓn gen [1, 26]. 1.1.2. Kü thuËt RAPD vµ øng dông §Ó thùc hiÖn ph¶n øng PCR cÇn ph¶i x¸c ®Þnh tr×nh tù nucleotit ë hai ®Çu cña ®o¹n gen cÇn nh©n b¶n, ®Ó thiÕt kÕ ®o¹n måi. Tr­íc khi xuÊt hiÖn m¸y ®äc tr×nh tù ADN tù ®éng th× vÊn ®Ò nµy g©y nhiÒu khã kh¨n cho c«ng t¸c nghiªn cøu. Do ®ã, c¸c nhµ nghiªn cøu nhanh chãng ñng hé kü thuËt PCR sö dông ®o¹n måi cã tr×nh tù ngÉu nhiªn. §­îc sö dông réng r·i nhÊt trong c¸c kü thuËt ®ã lµ kü thuËt RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA = TÝnh ®a h×nh c¸c ®o¹n ADN ®­îc nh©n b¶n ngÉu nhiªn). Kü thuËt nµy ®­îc hai nhãm nghiªn cøu (Williams vµ CS, 1990) [37], (Welsh vµ CS, 1990) [36] ®ång thêi x©y dùng mét c¸ch ®éc lËp. Nã lµ mét kü cho phÐp ph¸t hiÖn tÝnh ®a h×nh c¸c ®o¹n ADN ®­îc nh©n b¶n ngÉu nhiªn b»ng viÖc dïng mét måi ®¬n chøa mét trËt tù nucleotit ngÉu nhiªn. Th­êng måi nµy chøa tõ 9 ®Õn 12 nucleotit tèi thiÓu lµ 4 nucleotit. Cã hµng ngµn lo¹i måi chøa kho¶ng 10 nucleotit nh­ng sè l­îng måi ®­îc dïng trong nghiªn cøu lµ mét con sè h¹n chÕ. Trong ph¶n øng RAPD, c¸c måi ®¬n g¾n vµo hai ®iÓm kh¸c nhau ë hai m¹ch ®¬n ®èi diÖn cña ®o¹n ADN khu«n. NÕu c¸c ®iÓm b¾n måi n»m trong kho¶ng c¸ch cã thÓ nh©n b¶n ®­îc (th­êng tõ 200 ®Õn 2000 nucleotit) th× ®o¹n ADN ®ã ®­îc nh©n lªn. Sù cã mÆt cña s¶n phÈm nµy chøng tá ®· cã sù t­¬ng ®ång hoµn toµn hay mét phÇn gi÷a ADN genom víi c¸c måi oligonucleotit. Tõ nh÷ng nghiªn cøu nµy, ngµy nay kü thuËt RAPD ®· ®­îc thèng nhÊt theo ph­¬ng ph¸p cña Williams vµ CS (1990) [37] lµ sö dông c¸c ®o¹n måi ngÉu nhiªn cã chiÒu dµi 10 nucleotit víi thµnh phÇn G + C cao (60%) ®Ó b¸m chÆt vµo ADN khu«n. §iÓm kh¸c gi÷a RAPD so víi PCR lµ nã chØ sö dông mét måi ngÉu nhiªn dµi 10 nucleotit, qu¸ tr×nh nh©n b¶n ADN lµ ngÉu nhiªn. §o¹n måi nµy cã thÓ b¸m vµo bÊt kú vÞ trÝ nµo trong bé genom khi t×m ®­îc vÞ trÝ bæ sung. Víi chiÒu dµi ng¾n nªn kh¶ n¨ng ®o¹n måi t×m ®­îc c¸c ®o¹n t­¬ng ®ång trªn c¸c m¹ch ®¬n cña ADN trong genom kh«ng qu¸ khã kh¨n. V× thÕ RAPD lµ mét ph­¬ng ph¸p cã hiÖu qu¶ ®Ó x¸c ®Þnh tÝnh ®a h×nh vÒ trËt tù nucleotit gi÷a c¸c c¸ thÓ. Tïy vµo tõng nhãm lo¹i thùc vËt hay vi sinh vËt cô thÓ mµ c¸c ®o¹n måi ngÉu nhiªn ®­îc thiÕt kÕ ®Æc dông. Theo lý thuyÕt, sè l­îng c¸c ®o¹n ADN ®­îc nh©n b¶n phô thuéc vµo ®é dµi vµ vÞ trÝ g¾n cña c¸c ®o¹n måi, kÝch th­íc vµ møc ®é phøc t¹p cña cÊu tróc genom. KÕt qu¶ lµ sau khi ®iÖn di s¶n phÈm RAPD sÏ xuÊt hiÖn nhiÒu ph©n ®o¹n kh¸c nhau. Sù kh¸c nhau ®ã gäi lµ tÝnh ®a h×nh. Sù ®a h×nh cña s¶n phÈm RAPD lµ do møc ®é t­¬ng ®ång cña tr×nh tù ADN trong genom víi tr×nh tù måi vµ kÝch th­íc cña bé genom. §é t­¬ng ®ång cµng cao th× ph©n ®o¹n cµng nhiÒu. Kü thuËt RAPD còng gièng PCR gåm ba giai ®o¹n nh­ng ®iÓm kh¸c lµ trong giai ®o¹n g¾n måi RAPD cã nhiÖt ®é b¾t måi thÊp h¬n (tõ 350C - 450C). §©y còng lµ mét nguyªn nh©n dÉn ®Õn cã nhiÒu ph©n ®o¹n ADN ®­îc nh©n b¶n ngÉu nhiªn [2]. RAPD lµ mét ph­¬ng ph¸p cã hiÖu qu¶ trong viÖc x¸c ®Þnh kiÓu gen, ph©n tÝch quÇn thÓ vµ nguån gèc loµi, nghiªn cøu di truyÒn loµi, lËp b¶n ®å di truyÒn. Kü thuËt RAPD ®­îc sö dông ®Ó nhËn biÕt vµ ph©n lo¹i c¸c gièng c©y trång kh¸c nhau, sù ®a d¹ng di truyÒn trong c¸c kiÓu gen lóa n­íc vµ lóa n­¬ng, sù ®a d¹ng di truyÒn gi÷a lóa Indica vµ Japonica, x¸c ®Þnh sù ®a h×nh cña c¸c gièng. Yang vµ Quiros ®· sö dông 28 ®o¹n måi cã tr×nh tù 10 nucleotit ®Ó nghiªn cøu sù kh¸c biÖt cña 23 gièng cÇn t©y vµ ®­îc chia lµm ba nhãm. KÕt qu¶ thu ®­îc còng trïng hîp khi sö dông 6 chØ thÞ protein ®Ó ph©n lo¹i c¸c gièng cÇn t©y trªn (Yang vµ Quiros, 1993) [38]. T­¬ng tù nh­ vËy nhiÒu t¸c gi¶ ®· sö dông RAPD ®Ó lËp c©y chñng lo¹i ph¸t sinh cña c¸c loµi c©y nh­: ng«, lóa g¹o, lóa m×,... [24, 29, 32]. Orozco vµ CS, (1994) [31] ®· øng dông kü thuËt RAPD ®Ó kh¶o s¸t mèi quan hÖ di truyÒn vµ tiÕn ho¸ cña c¸c gièng cµ phª ®­îc tai t¹o tõ c¸c loµi bè, mÑ ë c¸c vïng sinh th¸i kh¸c nhau lµm c¬ së cho viÖc ghÐp cÆp lai víi môc ®Ých t¹o con lai cã ®Æc ®iÓm quý ®Ó lai t¹o gièng cµ phª míi. Bïi M¹nh C­êng vµ CS, (2000) [6] còng cho biÕt khi sö dông kü thuËt RAPD ®· ph©n biÖt ®­îc hai gièng ®Ëu Vetch vµ lentil, gièng nhau vÒ h×nh th¸i (träng l­îng1000 h¹t, mµu s¾c, kÝch th­íc...). §iÒu nµy cã mét ý nghÜa lín trong viÖc x¸c ®Þnh ®é thuÇn di truyÒn còng nh­ møc ®é lÉn t¹p c¬ giíi cña c¸c lo¹i gièng c©y trång. Trong qu¸ tr×nh thiÕt lËp mèi quan hÖ gi÷a c¸c loµi hay nhãm loµi (Apostol vµ CS, 1993) ®· x©y dùng kü thuËt ph©n nhãm th«ng qua c¸c biÓu ®å RAPD. Thùc chÊt cña kü thuËt nµy gåm ba b­íc: B­íc 1: So s¸nh tõng cÆp ®èi t­îng trong nghiªn cøu b»ng c¸ch tÝnh to¸n kho¶ng c¸ch quan hÖ gi÷a chóng. B­íc 2: LËp ma trËn gåm tÊt c¶ nh÷ng gi¸ trÞ tÝnh ®­îc tr­íc ®ã. B­íc 3: Gi¶i ma trËn vµ biÓu diÔn thµnh mét biÓu ®å ®Æc tr­ng. C¸c gi¸ trÞ biÓu diÔn kho¶ng c¸ch gi÷a c¸c c¸ thÓ ®­îc thiÕt lËp theo hÖ sè t­¬ng ®ång cña Nei vµ Li (1985). S = Trong ®ã NAB lµ sè b¨ng cã mÆt ë c¶ hai loµi A vµ B; NA lµ sè b¨ng chØ cã ë loµi A; NB lµ sè b¨ng chØ cã ë loµi B. Ngµy nay, c¸c nhµ nghiªn cøu ®· thiÕt lËp ®­îc phÇn mÒm m¸y tÝnh ®Ó tù ®éng vÏ nªn biÓu ®å mèi quan hÖ hay ®é t­¬ng ®ång di truyÒn cña c¸c ®èi t­îng nghiªn cøu sau khi nhËp d÷ liÖu vÒ c¸c b¨ng nh©n b¶n cña c¸c c¸ thÓ. NTSYSpc version 2.0 (Applied Biostatistics Inc., USA., 1998) lµ tªn cña mét tr­¬ng tr×nh thuéc kiÓu trªn ®Ó t¹o c¸c biÓu ®å h×nh c©y. BiÓu ®å thu ®­îc sÏ thÓ hiÖn møc ®é gÇn nhau cña c¸c c¸ thÓ cho phÐp ®¸nh gi¸ ®­îc mèi quan hÖ di truyÒn gi÷a c¸c c¸ thÓ ®­îc nghiªn cøu. Ch­¬ng tr×nh nµy cho phÐp gi¶m bít thêi gian nghiªn cøu vµ cã ®é chÝnh x¸c cao nªn nã lµ mét phÇn mÒm cã hiÖu qu¶ trong viÖc ph©n tÝch kü thuËt RAPD. 1.2. §Æc ®iÓm cña c¸c gièng lóa §Æc s¶n ë miÒn B¾c ViÖt Nam ë n­íc ta c©y lóa gi÷ vÞ trÝ träng yÕu trong hÖ thèng c©y l­¬ng thùc. Ngµy nay khi n¨ng suÊt lóa g¹o ®· ®¸p øng ®ñ nhu cÇu trong n­íc vµ cã d­ ®Ó xuÊt khÈu th× ng­êi ta quan t©m nhiÒu ®Õn chÊt l­îng g¹o. C¸c gièng lóa ®ang ®­îc s¶n xuÊt trªn diÖn tÝch lín mÆc dï cho n¨ng suÊt cao nh­ng chÊt l­îng ch­a ®¸p øng ®­îc nhu cÇu cña thÞ tr­êng ®ßi hái. V× vËy vÞ trÝ c¸c gièng lóa ®Æc s¶n ngµy cµng quan träng trong viÖc n©ng cao chÊt l­îng g¹o ViÖt Nam. C¸c gièng lóa ®Æc s¶n cã chÊt g¹o tèt vµ cã mïi th¬m ngon thuéc nhãm lóa mïa chÝnh vô. §a sè c¸c gièng lóa nµy ®­îc trång ë mét sè tØnh thuéc khu vùc miÒn B¾c n­íc ta (Th¸i B×nh, Nam §Þnh, Hµ T©y, H¶i D­¬ng, H¶i Phßng...), nh­ T¸m Xoan H¶i HËu, T¸m Êp BÑ Xu©n §µi, T¸m Cæ Ngçng Nam §Þnh, Dù Th¬m, TÎ Di H­¬ng... Lµ nh÷ng gièng lóa cã tiÒm n¨ng xuÊt khÈu vµ ®¸p øng nhu cÇu thiÕt thùc trong n­íc [12]. Nh­ng c¸c gièng lóa nµy cã diÖn tÝch gieo trång Ýt, n¨ng suÊt cßn thÊp vµ kh«ng æn ®Þnh, do cã nhiÒu ®Æc ®iÓm yÕu nh­ c©y cao (tõ 145 -170 cm), th©n mÒm yÕu, chèng ®æ kÐm, l¸ dµi rñ, h¹t th­a, cæ b«ng dµi, kÐm chÞu ph©n, ph¶n øng chÆt chÏ víi ¸nh s¸ng ngµy ng¾n vµ cã thêi gian sinh tr­ëng kh¸ dµi (tõ 155-170 ngµy) cÇn kh¾c phôc nh÷ng nh­îc ®iÓm nãi trªn cho phï hîp víi ®iÒu kiÖn canh t¸c cña tõng vïng [11, 12]. V× vËy viÖc nghiªn cøu t¹o c¸c ®ét biÕn thùc nghiÖm kÕt hîp víi chän dßng tÕ bµo nh»m chän t¹o c¸c gièng lóa chÊt l­îng vµ n¨ng suÊt cao tõ c¸c gièng lóa ®Þa ph­¬ng cã mét ý nghÜa rÊt lín kh«ng chØ ®èi víi c©y lóa mµ cßn ®èi víi c¸c gièng c©y trång kh¸c. 1.3. nu«i cÊy m« sÑo vµ c¬ së chän dßng biÕn dÞ soma N¨m 1898, lÇn ®Çu tiªn, nhµ thùc vËt häc ng­êi §øc tªn lµ Haberlandt ®· nhËn xÐt: "Mçi mét tÕ bµo bÊt kú lÊy tõ c¬ thÓ thùc vËt ®a bµo ®Òu cã kh¶ n¨ng tiÒm tµng ®Ó ph¸t triÓn thµnh mét c¬ thÓ hoµn chØnh. §ã lµ tÝnh toµn n¨ng cña tÕ bµo" [1]. BÊt kú mét bé phËn nµo cña c©y (mÇm, rÔ, th©n, l¸, nhÞ...), ®Òu cã thÓ t¹o nªn c©y hoµn chØnh th«ng qua kü thuËt nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËt. M« sÑo (callus) lµ mét khèi tÕ bµo m« mÒm, cã møc ®é cÊu tróc thÊp, ch­a ph©n ho¸, cã kh¶ n¨ng ph©n bµo liªn tôc vµ th­êng cã tÝnh biÕn ®éng di truyÒn cao. Trong nu«i cÊy in vitro m« sÑo ®­îc t¹o ra tõ nu«i cÊy c¸c c¬ quan cña thùc vËt (th©n, l¸, rÔ, h¹t, nhÞ...) ë c¸c m«i tr­êng nu«i cÊy thÝch hîp cã chøa c¸c chÊt ®iÒu khiÓn sinh tr­ëng cÇn thiÕt nh­ (auxin, cytokinin) vµ ®iÒu kiÖn nu«i cÊy (nhiÖt ®é, ¸nh s¸ng, ®é Èm...) tèi ­u. M« sÑo cã thÓ ®­îc duy tr× trªn m«i tr­êng nu«i cÊy b»ng c¸ch cÊy chuyÓn ®Þnh kú, tuy nhiªn trong thùc nghiÖm cho thÊy r»ng: m« sÑo qua cÊy chuyÓn nhiÒu lÇn th× kh¶ n¨ng t¸i sinh c©y gi¶m râ rÖt vµ t¨ng tÝnh biÕn ®éng di truyÒn cña m« [1, 9, 15]. C¸c tÕ bµo m« sÑo cã tÝnh æn ®Þnh di truyÒn thÊp. VËy muèn nh©n nhanh vµ duy tr× tÝnh ®ång nhÊt di truyÒn th«ng qua m« sÑo cña mét sè loµi thùc vËt cÇn sö dông m« sÑo s¬ cÊp ®Ó t¸i sinh c©y hoµn chØnh. Nh÷ng c©y t¸i sinh tõ m« sÑo th­êng cã nh÷ng biÕn ®æi di truyÒn phong phó (dÞ béi, ®a béi) vµ c¸c biÕn ®æi di truyÒn kh¸c, ®iÒu nµy cã ý nghÜa trong chän gièng (Lª TrÇn B×nh vµ CS, 1998) [2], (Oono, 1983) [30]. B»ng c¸ch nµy nhiÒu t¸c gi¶ ®· th«ng b¸o thu ®­îc nh÷ng gièng c©y trång míi [3, 15, 20, 33]. ThuËt ng÷ “ biÕn dÞ soma” ®­îc Larkin vµ Scowcroft (1982) [27] dïng ®Ó chØ tÊt c¶ c¸c biÕn dÞ x¶y ra trong qu¸ tr×nh nu«i cÊy m« vµ tÕ bµo. BiÓu hiÖn cña biÕn dÞ soma ®­îc quan s¸t thÊy ë kiÓu h×nh cña nh÷ng c©y t¸i sinh tõ nu«i cÊy m« sÑo. Nguyªn lý chung cña viÖc chän dßng mang biÕn di soma lµ ë tÕ bµo nu«i cÊy in vitro tÇn suÊt biÕn ®éng di truyÒn dao ®éng tõ 10-5- 10-8 trong m«i tr­êng nu«i cÊy b×nh th­êng khi kh«ng xö lý ®ét biÕn, cßn nÕu kÕt hîp víi xö lý ®ét biÕn b»ng chÊt ho¸ häc (EMS, BU...) hoÆc c¸c lo¹i bøc x¹ (tia UV, tia gamma...) th× tÇn sè ®ét biÕn cã thÓ t¨ng lªn gÊp 10 - 100 lÇn, v× vËy cã thÓ chän ra c¸c c¸ thÓ ®ét biÕn nhanh h¬n vµ cã hiÖu qu¶ h¬n so víi c¸c biÖn ph¸p chän gièng th«ng th­êng kh¸c ¸p dông cho c©y nguyªn vÑn. ë møc ®é tÕ bµo, nhÊt lµ tÕ bµo ®¬n béi hÇu nh­ c¸c ®Æc ®iÓm ®ét biÕn ®­îc thÓ hiÖn ra ngay. Kü thuËt nu«i cÊy m« tÕ bµo cßn cho phÐp gi¶m bít ®¸ng kÓ thêi gian cÇn thiÕt ®Ó chän ®­îc nh÷ng tÝnh tr¹ng theo ý muèn [22]. Shepart vµ CS (1980) qua nu«i cÊy tÕ bµo trÇn cña khoai t©y ®· chän läc vµ ®· thu ®­îc gièng khoai t©y cã thêi gian sinh tr­ëng ng¾n, cñ ®Òu, h×nh d¹ng ®Ñp vµ chèng chÞu ®­îc mét ®iÒu kiÖn bÊt lîi cña m«i tr­êng tèt h¬n so víi gièng gèc [trÝch dÉn tõ 1]. Larkin vµ CS (1982) [27], Barwale vµ CS (1987) [19] còng cho r»ng biÕn dÞ soma th­êng xuÊt hiÖn ë c¸c c©y t¸i sinh ®­îc sau khi nu«i cÊy tÕ bµo qua giai ®o¹n m« sÑo. Cã nhiÒu kiÓu ®ét biÕn nh­: ®ét biÕn nh©n, ®ét biÕn tÕ bµo chÊt, ®a béi thÓ vµ c¸c bÊt th­êng kh¸c trong nhiÔm s¾c thÓ. Trong nghiªn cøu thùc nghiÖm Maliga (1984) [28] ®· tiÕn hµnh xö lý tia cùc tÝm ®èi víi tÕ bµo trÇn thuèc l¸ vµ xö lý tia gamma Co60 víi tÕ bµo thuèc l¸ cho thÊy tÇn sè ®ét biÕn t¨ng lªn 10 lÇn so víi ®èi chøng. Nh÷ng c©y t¸i sinh tõ m« sÑo xö lý ®ét biÕn dÔ mang nh÷ng biÕn ®éng di truyÒn vÒ nhiÔm s¾c thÓ (di béi, ®a béi) vµ c¸c biÕn ®æi di truyÒn kh¸c.VÊn ®Ò nµy ®· më ra mét triÓn väng lín trong viÖc c¶i tiÕn di truyÒn nh÷ng gièng c©y trång cã ý nghÜa kinh tÕ, t¹o gièng míi cho n¨ng suÊt cao, chèng chÞu ®­îc c¸c ®iÒu kiÖn ngo¹i c¶nh bÊt lîi, chÊt l­îng tèt vµ æn ®Þnh. NhiÒu c«ng tr×nh nghiªn cøu ®· thµnh c«ng trong viÖc chän dßng mang biÕn di soma trªn c¸c ®èi t­îng c©y trång kh¸c nhau ®Æc biÖt lµ c©y l­¬ng thùc. Theo Lª TrÇn B×nh vµ CS (1997) [1] b¶n chÊt vµ c¬ chÕ cña biÕn dÞ soma liªn quan mËt thiÕt ®Õn nh÷ng thay ®æi trong genom cña tÕ bµo nu«i cÊy. Do nhiÒu nguyªn nh©n nh­ t¸c ®éng cña hoocm«n sinh tr­ëng trong thêi gian dµi vµ c¸c yÕu tè kh¸c lµm cho nhiÔm s¾c thÓ trong tÕ bµo nu«i cÊy t¨ng lªn t¹o ra c¸c d¹ng ®a béi lÖch vµ møc béi thÓ cao. NhiÒu tr­êng hîp kh¸c, c¸c ®o¹n nhiÔm s¾c thÓ cã thÓ bÞ chuyÓn ®æi hoÆc ®¶o ng­îc. CÊu tróc cña ph©n tö ADN cã thÓ bÞ thay ®æi dÉn ®Õn thay ®æi kiÓu h×nh thùc sù. Adkins vµ CS (1995) [18] th«ng b¸o ®· chän ®­îc dßng lóa chÞu h¹n tõ m« sÑo gièng lóa Khao Dawk Mali 105 b»ng viÖc bæ sung vµo m«i tr­êng nu«i cÊy PEG 8000. C¸c tÝnh tr¹ng n«ng sinh häc quan träng vµ kh¶ n¨ng chÞu h¹n ®· duy tr× vµ æn ®Þnh ë thÕ hÖ R2. T­¬ng tù mét sè t¸c gi¶ còng thu ®­îc c¸c dßng c©y chÞu mÊt n­íc nh­ c©y anh ®µo, c©y cao l­¬ng... Sö dông c«ng nghÖ tÕ bµo thùc vËt kÕt hîp víi kü thuËt thæi kh« m« sÑo (§inh Thi Phßng vµ CS, 2001) [15] ®· chän t¹o thµnh c«ng ba gièng lóa DR1, DR2 vµ DR3 c¶ ba gièng lóa ®Òu thÊp c©y, ng¾n ngµy, chÞu nãng h¹n, chÞu l¹nh kh¸, chèng ®æ, ®Î nh¸nh vµ sinh tr­ëng khoÎ, cho n¨ng suÊt v­ît gièng gèc CR 203. Trong ®ã DR2 ®· ®­îc c«ng nhËn lµ gièng lóa Quèc gia 1998 vµ hiÖn nay DR2 kh«ng chØ ®­îc gieo trång ë 12 tØnh miÒn nói phÝa B¾c mµ cßn c¶ ë miÒn Trung (Kontum). Gièng lóa DR3 ®· qua ba vô kh¶o nghiÖm c¬ b¶n vµ hiÖn ®ang ®­îc triÓn khai më réng s¶n xuÊt ë c¸c vïng sinh th¸i khã kh¨n. T­¬ng tù nh­ vËy ViÖn lóa ®ång B»ng s«ng Cöu Long còng ®· chän t¹o thµnh c«ng dßng lóa Khao 105 cã tÝnh øng dông vµ c¸c dßng chÞu muèi triÓn väng tõ gièng lóa Mét Bôi (Bïi B¸ Bæng, 1997) [3] vµ hiÖn nay gièng Khao 105 ®· ®­îc c«ng nhËn lµ gièng Quèc gia. Phßng Di truyÒn TÕ bµo Thùc vËt, ViÖn C«ng nghÖ Sinh häc còng ®· chän t¹o thµnh c«ng gièng lóa BR12 kh¸ng bÖnh ®¹o «n, cã nguån gèc tõ gièng lóa CR203. ViÖc chän ®­îc nh÷ng dßng tÕ bµo kh¸ng nÊm bÖnh, kh¸ng chÊt diÖt cá, kh¸ng kh¸ng sinh, kh¸ng kim lo¹i nÆng, thÝch nghi tèt víi c¸c yÕu tè bÊt lîi cña m«i tr­êng (nãng, l¹nh, kh«, h¹n, chua, mÆn...), trªn nhiÒu ®èi t­îng c©y trång kh¸c nhau cã mét ý nghÜa to lín trong n«ng nghiÖp. 1.4. §ét biÕn thùc nghiÖm vµ øng dông trong chän t¹o gièng c©y trång VËt chÊt di truyÒn ®­îc duy tr× æn ®Þnh tõ thÕ hÖ nµy sang thÕ hÖ kh¸c, nh­ng kh«ng ph¶i lµ tuyÖt ®èi, cã thÓ bÞ biÕn ®æi bëi t¸c nh©n tù nhiªn hoÆc g©y t¹o nh­ t¸c nh©n g©y ®ét biÕn vËt lý vµ ho¸ häc. Ng­êi ta gäi nh÷ng biÕn ®æi dï lµ nhá nhÊt trong cÊu tróc gen hoÆc nhiÔm s¾c thÓ lµ ®ét biÕn [16]. Trong chän gièng cæ ®iÓn