Đề tài Đánh giá tình trạng nhiễm cucumber mosaic virus, tobacco mosaic virus, tomato spotted wilt virus trên cây thuốc lá (nicotiana tabacum l.) và cây đậu phộng (arachis hypogaea l.) tại tỉnh tây ninh bằng kỹ thuật elisa và chẩn đoán tobacco mosaic virus

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ….  …. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG NHIỄM CUCUMBER MOSAIC VIRUS, TOBACCO MOSAIC VIRUS, TOMATO SPOTTED WILT VIRUS TRÊN CÂY THUỐC LÁ (Nicotiana tabacum L.) VÀ CÂY ĐẬU PHỘNG (Arachis hypogaea L.) TẠI TỈNH TÂY NINH BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ CHẨN ĐOÁN TOBACCO MOSAIC VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT - PCR Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa : 2002-2006 Sinh viên thực hiện: VĂN NGỌC DUNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ….  …. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG NHIỄM CUCUMBER MOSAIC VIRUS, TOBACCO MOSAIC VIRUS, TOMATO SPOTTED WILT VIRUS TRÊN CÂY THUỐC LÁ (Nicotiana tabacum L.) VÀ CÂY ĐẬU PHỘNG (Arachis hypogaea L.) TẠI TỈNH TÂY NINH BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ CHẨN ĐOÁN TOBACCO MOSAIC VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT - PCR Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện PGS. TS. BÙI CÁCH TUYẾN VĂN NGỌC DUNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2006 iii LỜI CẢM TẠ Con xin kính dâng lên cha mẹ lòng biết ơn sâu sắc, người đã sinh thành, dưỡng dục để con có được ngày hôm nay. Các em đã, đang và sẽ cùng chị chia sẻ những vui buồn trong cuộc sống. Em xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu Trường Đại học Nông lâm TP. Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học đã tạo nhiều thuận lợi học tập cho em trong suốt bốn năm đại học. Em xin cám ơn Ban giám đốc Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa Sinh - Trường Đại học Nông lâm TP. Hồ Chí Minh cùng các anh chị tại Trung tâm đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ em trong thời gian thực tập tốt nghiệp. Vô cùng biết ơn PGS. TS. Bùi Cách Tuyến đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho em để em có thể hoàn tất khóa luận tốt nghiệp. Trân trọng cám ơn TS. Bùi Minh Trí cùng Quý Thầy - Cô trong và ngoài trường đã hết lòng truyền đạt những kiến thức bổ ích cho em trong suốt thời gian học tập. Xin chân thành cảm ơn chị Hưng, chị Hà, anh Vũ, anh Trường, chị Hạnh, chị Dương đã sẵn lòng giúp đỡ để em có thể hoàn thành tốt khóa luận này. Cảm ơn các bạn cùng lớp Công Nghệ Sinh Học K28, niên khóa 2002 – 2006, đã luôn đồng hành, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện khóa luận. TP. Hồ Chí Minh, tháng 09 năm 2006 Văn Ngọc Dung iv TÓM TẮT VĂN NGỌC DUNG. Đại học Nông lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 09/ 2006. “ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG NHIỄM CUCUMBER MOSAIC VIRUS, TOBACCO MOSAIC VIRUS, TOMATO SPOTTED WILT VIRUS TRÊN CÂY THUỐC LÁ (NICOTIANA TABACUM L.) VÀ CÂY ĐẬU PHỘNG (ARACHIS HYPOGAEA L.) TẠI TỈNH TÂY NINH BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ CHẨN ĐOÁN TOBACCO MOSAIC VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT – PCR”. Hội đồng hướng dẫn PGS. TS. BÙI CÁCH TUYẾN. Đề tài được thực hiện tại các huyện Tân Biên, huyện Bến Cầu, huyện Dương Minh Châu của tỉnh Tây Ninh và Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa Sinh trường Đại học Nông lâm TP. Hồ Chí Minh, từ tháng 03/ 2006 đến tháng 08/ 2006. Nội dung tiến hành: Tìm hiểu mức độ nhiễm TMV, CMV và TSWV trên cây thuốc lá và đậu phộng tại tỉnh Tây Ninh. Thu thập mẫu có triệu chứng nhiễm bệnh tại địa bàn điều tra. Tiến hành chẩn đoán bằng kỹ thuật ELISA nhằm xác định mẫu dương tính với TMV, CMV và TSWV. Chọn mẫu dương tính với TMV thực hiện RT – PCR, với mục đích xây dựng quy trình RT – PCR chẩn đoán TMV, nhằm khẳng định lại kết quả ELISA. Kết quả thu được: Chưa phát hiện được TSWV trên thuốc lá và đậu phộng tại các huyện thu thập mẫu ở tỉnh Tây Ninh. Thuốc lá tại Tây Ninh nhiễm TMV với tỷ lệ khá cao (69,1%). Trong đó, huyện Tân Biên nhiễm TMV là chủ yếu (69,2%) và ở Bến Cầu là CMV (60,6%). Kỹ thuật RT – PCR bước đầu đã khuếch đại được đoạn gen đặc trưng của TMV với kích thước 1000 bp. Điều này đã cho thấy rằng dòng TMV gây bệnh trên thuốc lá tại Việt Nam đã biến đổi so với các dòng virus khác. v MỤC LỤC PHẦN TRANG Trang tựa Lời cảm tạ ............................................................................................................. iii Tóm tắt .................................................................................................................. iv Mục lục .................................................................................................................. v Danh sách các chữ viết tắt ...................................................................................... x Danh sách các hình ............................................................................................... xi Danh sách các bảng .............................................................................................. xii Danh sách các biểu đồ ......................................................................................... xiii 1. MỞ ĐẦU ................................................................................................................. 1 1.1 Đặt vấn đề ........................................................................................................ 1 1.2 Mục đích – Yêu cầu ......................................................................................... 2 1.2.1 Mục đích ............................................................................................... 2 1.2.2 Yêu cầu ................................................................................................. 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................................... 3 2.1 Giới thiệu về cây thuốc lá ................................................................................ 3 2.1.1 Vị trí phân loại ...................................................................................... 3 2.1.2 Nguồn gốc và phân bố .......................................................................... 3 2.1.3 Đặc điểm di truyền ............................................................................... 3 2.1.4 Đặc điểm hình thái ................................................................................ 3 2.1.5 Đặc điểm trồng trọt ............................................................................... 4 2.1.5.1 Yếu tố khí hậu ........................................................................ 4 2.1.5.2 Yếu tố đất đai .......................................................................... 4 2.1.5.3 Yếu tố sinh vật ........................................................................ 4 2.1.6 Giá trị kinh tế và sử dụng ..................................................................... 4 2.2 Giới thiệu về cây đậu phộng ............................................................................ 7 2.2.1 Vị trí phân loại ...................................................................................... 7 2.2.2 Nguồn gốc và phân bố .......................................................................... 7 vi 2.2.3 Đặc điểm di truyền ............................................................................... 7 2.2.4 Đặc điểm hình thái ................................................................................ 8 2.2.5 Đặc điểm trồng trọt ............................................................................... 8 2.2.5.1 Yếu tố khí hậu ........................................................................ 8 2.2.5.2 Yếu tố đất đai .......................................................................... 8 2.2.5.3 Yếu tố sinh vật ........................................................................ 8 2.2.6 Giá trị kinh tế và sử dụng ..................................................................... 9 2.3 Một số bệnh trên thực vật do virus gây ra ..................................................... 11 2.3.1 Sơ lược chung về virus gây hại thực vật ............................................ 11 2.3.1.1 Đặc điểm chung .................................................................... 11 2.3.1.2 Sự lan truyền bệnh virus thực vật ......................................... 11 2.3.2 Một số bệnh do các virus khác gây hại trên cây thuốc lá ................... 12 2.3.3 Một số bệnh do các virus khác gây hại trên cây đậu phộng ............... 13 2.4 Giới thiệu về Tomato Spotted Wilt Virus ...................................................... 14 2.4.1 Nguồn gốc và sự lan truyền của TSWV ............................................. 15 2.4.2 Cấu trúc của virus TSWV ................................................................... 15 2.4.3 Phân loại TSWV ................................................................................. 15 2.4.4 Dãy ký chủ của TSWV ....................................................................... 16 2.4.5 Con đường truyền bệnh ...................................................................... 16 2.4.6 Điều kiện phát triển bệnh .................................................................... 17 2.4.7 Triệu chứng bệnh trên cây nhiễm TSWV ........................................... 17 2.4.8 Khống chế bệnh do TSWV ................................................................. 20 2.5 Giới thiệu về Tobacco Mosaic Virus ............................................................. 20 2.5.1 Nguồn gốc của TMV .......................................................................... 20 2.5.2 Cấu trúc của virus TMV ..................................................................... 21 2.5.3 Phân loại TMV ................................................................................... 21 2.5.4 Dãy ký chủ của TMV ......................................................................... 21 2.5.5 Con đường truyền bệnh ...................................................................... 21 2.5.6 Điều kiện phát triển bệnh .................................................................... 22 2.5.7 Triệu chứng bệnh trên cây nhiễm TMV ............................................. 22 2.5.8 Khống chế bệnh do TMV ................................................................... 24 vii 2.6 Giới thiệu về Cucumber Mosaic Virus .......................................................... 24 2.6.1 Nguồn gốc của CMV .......................................................................... 24 2.6.2 Cấu trúc của virus CMV ..................................................................... 24 2.6.3 Phân loại CMV ................................................................................... 24 2.6.4 Dãy ký chủ của CMV ......................................................................... 25 2.6.5 Con đường truyền bệnh ...................................................................... 25 2.6.6 Điều kiện phát triển bệnh .................................................................... 26 2.6.7 Triệu chứng bệnh trên cây nhiễm CMV ............................................. 27 2.6.8 Khống chế bệnh do CMV ................................................................... 27 2.7 Phương pháp chẩn đoán bệnh do virus gây ra ............................................... 29 2.7.1 Phương pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử ............................ 29 2.7.2 Phương pháp chẩn đoán bằng cây chỉ thị ........................................... 29 2.7.3 Phương pháp chẩn đoán dựa vào triệu chứng..................................... 29 2.8 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) .......................................... 30 2.8.1 Nguyên lý ELISA ............................................................................... 30 2.8.2 Phân loại ELISA ................................................................................. 30 2.8.2.1 ELISA trực tiếp .................................................................... 30 2.8.2.2 ELISA gián tiếp .................................................................... 30 2.8.2.3 Sandwich ELISA .................................................................. 31 2.8.3 Các yếu tố ảnh hưởng trong phản ứng ELISA ................................... 31 2.8.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả phản ứng ELISA ......................... 31 2.9 PCR (Polymerase Chain Reaction) ................................................................ 31 2.9.1 Nguyên tắc .......................................................................................... 31 2.9.2 Ưu nhược điểm của phản ứng PCR .................................................... 33 2.10 RT – PCR (Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction) ............. 34 2.10.1 Nguyên tắc ........................................................................................ 34 2.10.2 Phương pháp thực hiện trong phản ứng tổng hợp cDNA ................. 34 2.11 Một số kỹ thuật PCR khác ........................................................................... 35 2.11.1 Kỹ thuật PCR đảo ............................................................................. 35 2.11.2 Kỹ thuật NESTED – PCR ................................................................ 35 2.11.3 Kỹ thuật RACE (Rapia Amplification of cDNA Ends) ................... 35 viii 2.12 Những nghiên cứu trong và ngoài nước bệnh do TMV, CMV, TSWV gây ra ........................................................................................................... 36 2.13.1 Những nghiên cứu trên thế giới ........................................................ 36 2.13.2 Những nghiên cứu tại Việt Nam ....................................................... 36 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................... 37 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................................. 37 3.2 Phương pháp lấy mẫu..................................................................................... 37 3.3 Dụng cụ .......................................................................................................... 37 3.4 Phương pháp chẩn đoán TMV, CMV và TSWV bằng dDAS – ELISA ....... 38 3.4.1 Hóa chất .............................................................................................. 38 3.4.2 Phương pháp thực hiện ....................................................................... 38 3.4.2.1 Ly trích mẫu ......................................................................... 38 3.4.2.2 Thực hiện phản ứng ELISA .................................................. 38 3.5 Phương pháp chẩn đoán TMV bằng RT – PCR ............................................ 40 3.5.1 Hóa chất .............................................................................................. 40 3.5.2 Phương pháp thực hiện ....................................................................... 41 3.5.2.1 Ly trích RNA ........................................................................ 41 3.5.2.2 Khuếch đại bằng RT – PCR ................................................. 42 3.5.2.3 Đổ gel điện di ....................................................................... 43 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................. 45 4.1 Chẩn đoán bằng kỹ thuật ELISA ................................................................... 45 4.1.1 Tỷ lệ nhiễm TSWV trên đậu phộng tại huyện Dương Minh Châu và Bến Cầu ........................................................................................ 45 4.1.2 Tỷ lệ nhiễm CMV, TMV và TSWV trên thuốc lá thu thập tại huyện Tân Biên và Bến Cầu ............................................................. 46 4.1.3 Tỷ lệ nhiễm CMV trên thuốc lá tại huyện Tân Biên và Bến Cầu ...... 47 4.1.4 Tỷ lệ nhiễm TMV trên thuốc lá tại huyện Tân Biên và Bến Cầu ....... 48 4.1.5 Tỷ lệ chỉ nhiễm CMV hay chỉ nhiễm TMV hay nhiễm hỗn hợp CMV và TMV trên số mẫu thu thập được ........................................ 50 4.1.6 Tỷ lệ bệnh theo triệu chứng quan sát được trên cây thuốc lá ............. 51 4.2 Kết quả RT – PCR ......................................................................................... 55 ix 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................. 59 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 60 7. PHỤ LỤC .......................................................................................................... 63 x DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT bp : Base pairs cDNA : complementary DNA CMV : Cucumber Mosaic Virus Da : Dalton DAS – ELISA : Double Antibody Sandwich – Enzyme Linked Immunosorbent Assay DEPC : Diethyl pyrodicarbonate DNA : Deoxyribonucleic acic DNase : Deoxyribonuclease dNTP : Deoxynucleotide triphosphate EDTA : Ethylendiaminetetraacid acetic ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay Ig : Immunoglobulin mRNA : Messenger ribonucleic acid OD : Optical density p – NPP : p – nitrolphenol phosphate PBS – T : Phosphate buffer saline with Tween – 20 PCR : Polymerase Chain Reaction PVP : Polyvinylpyrolydol RT – PCR : Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction ssRNA : Single strand RNA Ta : Annealing temperature TAE : Tris Acetate Ethylendiaminetetraacid acetic Taq : Thermus aquaticus Tm : Melting temperature TMV : Tobacco Mosaic Virus TSWV : Tomato Spotted Wilt Virus UV : Ultra violet xi DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1 Nicotiana tabacum L. ......................................................................... 3 Hình 2.2 Một số hình ảnh về cây thuốc lá Nicotiana tabacum L. ..................... 6 Hình 2.3 Arachis hypogaea L. ......................................................................... 7 Hình 2.4 Một số hình ảnh về cây đậu phộng Arachis hypogaea L. ................ 10 Hình 2.5 Cấu trúc virus TSWV ....................................................................... 15 Hình 2.6 Bọ trĩ trưởng thành dài 1 mm ........................................................... 17 Hình 2.7 Triệu chứng nhiễm TSWV trên một số thực vật .............................. 19 Hình 2.8 Cấu trúc virus TMV ......................................................................... 21 Hình 2.9 Triệu chứng nhiễm TMV trên thực vật ............................................ 23 Hình 2.10 Cấu trúc virus CMV ......................................................................... 25 Hình 2.11 Triệu chứng nhiễm CMV trên một số thực vật ................................ 28 Hình 4.12 Hình chụp cây thuốc lá khỏe và bệnh tại huyện Bến Cầu ................ 53 Hình 4.13 Hình chụp cây thuốc lá khỏe và bệnh tại huyện Tân Biên ............... 54 Hình 4.14 Kết quả điện di sản phẩm PCR trên thuốc lá nhiễm TMV tại huyện Tân Biên ........................................................................................... 56 Hình 4.15 Kết quả điện di sản phẩm PCR trên thuốc lá nhiễm TMV tại huyện Bến Cầu ............................................................................................ 57 xii DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 4.1 Kết quả ELISA đối với TSWV trên đậu phộng ...................................... 45 Bảng 4.2 Kết quả ELISA đối với TMV, CMV và TSWV trên số mẫu thuốc lá .... 46 Bảng 4.3 Kết quả ELISA đối với CMV trên thuốc lá ............................................ 47 Bảng 4.4 Kết quả ELISA đối với TMV trên thuốc lá ............................................ 48 Bảng 4.5 Kết quả ELISA đối với mẫu thuốc lá nhiễm hỗn hợp CMV và TMV và các mẫu chỉ nhiễm CMV hay TMV ................................................... 50 Bảng 4.6 Tỷ lệ thuốc lá nhiễm bệnh theo triệu chứng quan sát được trên lá ......... 51 xiii DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ BIỂU ĐỒ TRANG Biểu đồ 4.1 Tỷ lệ số mẫu thuốc lá dương tính, âm tính với CMV, TMV, TSWV .. 46 Biểu đồ 4.2 Tỷ lệ thuốc lá nhiễm CMV giữa Tân Biên và Bến Cầu ....................... 47