Đề tài Điện di trên polyacrylamide gel

Click to edit Master title style Click to edit Master text styles Second level Third level Fourth level Fifth level 3/19/2014 ‹#› SEMINA Chủ đề : Điện di trên polyacrylamide gel GVHD: TH.S Nguyễn Thị Vân Anh SVTH: Nguyễn Thị Thuần NỘI DUNG 1 2 Cơ chế 3 Điện di là gì ? Điện di Polyacrylamide gel Ứng dụng 4 Điện di trên gel (electrophoresis  hay gel electrophoresis ) áp dụng trong sinh học phân tử là một kĩ thuật để phân tích các phân tử DNA, RNA hay protein dựa trên các đặc điểm vật lý của chúng như kích thước, hình dạng hay điểm đẳng điện tích (isoelectric point) Kĩ thuật này sử dụng một dung dịch đệm (buffer) để dẫn diện và tạo điện trường đều, một bản gel (thường là agarose hay polyacrylamide) đóng vai trò là thể nền để phân tách các phân tử, và các chất nhuộm khác nhau (ethidium bromide, bạc, xanh Coomassie) để phát hiện vị trí các phân tử trên gel sau khi điện di. 1 Điện di là gì ? II.1. Polyacrylamide gel là gì ?   Quá trình polymer hóa được xúc tác bởi ammoniumpersulfate (APS),N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED). - Acrylamide là một đơn phân tử có cấu trúc:  CH2=CH–CO–NH2 - Bis-acrylamide có cấu trúc: CH2=CH–CO–NH–CH2–NH–CO–CH=CH2.         Gel polyacrylamide là gel được tạo thành do sự polymer hóa các đơn phân tửacrylamide và N,N’-methylene-bis-acrylamide. Tách các đoạn DNA có kích thước 0,5 – 20 Kb Điện di theo phương nằm ngang Phân giải thay đổi khi nồng độ Agarose hay loại Agarose thay đổi Bước chuẩn bị đơn giản Phân tách đoạn DNA có kích thước < 1000 cặp base Điện di theo phương thẳng đứng Độ phân giải cao và ít thay đổi có thể phân biệt được những đoạn chỉ cách nhau 1 nucleotide Bước chuẩn bị phức tạp hơn phương pháp sử dụng Agarose Gel Agarose Gel Polyacrylamide NGUYÊN TẮC: Dựa vào đặc tính tích điện, tốc độ di chuyển khác nhau của các phân tử ion hay các tiểu phần protein trong trường điện Tách riêng biệt theo khả năng di động trong trường điện từ về 2 cực âm và dương Sự dịch chuyển Của các phân tử trên gel Điện tích của phân tử cần phân tách Kích thước của lỗ gel Điện trường Nếu nồng độ gel thấp sẽ tạo ra lỗ gel lớn, cho phépphân tách các phân tử sinh học có kích thước lớn và ngược lại nếu nồng độ gel caosẽ tạo ra lỗ gel nhỏ, cho phép phân tách các phân tử sinh học có kích thước nhỏ Các phân tử tích điện âm sẽ di chuyển về cực dương 2 Điện di Polyacrylamide gel 1. Nguyên tắc điện di trên polyacrylamide Dùng dể phân tách các đoạn phân tử DNA, RNA và DNA/RNA Gel phải được đặt giữa 2 tấm kính ngăn cách bởi miếng đệm ( gel spacers) để ngăn cho polyacrylamide không tiếp xúc với không khí Gel có thể dài từ 10 – 100 cm tùy thuộc vào yêu cầu phân tích và chúng thường chạy trong phương thẳng đứng Có thể đúc bản gel ở các nồng độ khác nhau của polyacrylamide từ 3,5% - 20% tùy thuộc vào kích thước phân tử protein hoặc DNA quan tâm Nồng độ thấp tạo ra các lỗ có kích thước lớn hơn phân tách các phân tử lớn hơn liên kết chéo của các monomer và các tác nhân liên kết có thể được điều chỉnh để kiểm soát mức độ xốp của khuôn gel. Điều này cho phép tối ưu hóa một khuôn gel để phân tách 1 phạm vi kích thước đặc biệt của các phân tử protein. Chiều dài chuỗi Nồng độ acrylamide Mức độ liên kết chéo Độ xốp của gel Liên kết chéo của các monomer và các tác nhân liên kết có thể được điều chỉnh để kiểm soát mức độ xốp của khuôn gel. 1. Nguyên tắc điện di trên polyacrylamide Cơ chế 3 Phân tích và thu hồi các đoạn DNA có chiều dài từ 5-2.000 bp. Nồng độ polyacrylamide gel được sử dụng trong khoảng từ 3,5-20% tùy thuộc vào kích thước của đoạn DNA quan tâm Hai loại polyacrylamide gel thường được sử dụng là: - Polyacrylamide gel không biến tính dùng để phân tách và tinh sạch các đoạn DNA sợi đôi - Polyacrylamide gel biến tính bằng urea và formamide dùng để phân tách và tinh sạch các đoạn DNA sợi đơn loại gel hay được sử dụng nhất Hiệu quả của sự phân tách DNA trong loại gel này phụ thuộc vào nồng độ của acrylamide, kích thước và điện tích của DNA Khi nồng độ acrylamide cao thì hiệu quả phân tích nucleotide càng thấp Chuẩn bị polyacrylamide không biến tính Chuẩn bị dung dịch Phương pháp điện di polyacrylamide gel không biến tính Lau sạch 2 tấm kính dùng làm khuôn gel avà miếng đệm Rót dung dịch gel vào giữa 2 tấm kính. Rồi gắn lược vào   Rút lược, tháo băng, gắn khuôn gel vào buồn điện di bằng đệm 1*TBE Trộn mẫu DNA với lượng thích hợp của đệm, đặt mẫu vào giếng Nối buồng điện di với bộ nguồn 2. Phát hiện DNA trong polyacrylamide gel Nhuộm bằng ethidium bromide   Lấy gel và tấm kính đỡ raThấm khô bề mặt gel bằng giấy thấm Kimwipe Phủ lên bề mặt gel bằng giấy nylon (Saran wrap) Quan sát và chụp ảnh trên máy soi tử ngoại. Polyacrylamide có thể làm mất huỳnh quang của EtBr, do đó không thể phát hiện các băng DNA bằng phương pháp này nếu hàm lượng của nó thấp hơn 10 g. tránh tạo ra bọt khí hoặc nếp gấp của Saran wrap Nhuộm bằng thuốc nhuộm bạc Cho phép phát hiện một lượng protein ở dạng vết trong polyacrylamide gel và một lượng nhỏ nucleic acid (pg) nhạy gấp 1.000-10.000 lần phương pháp nhuộm bằng EtBr Hai phương pháp nhuộm bạc thường được sử dụng là 1) Dùng các dung dịch diamine silver cho thấm vào gel và pha loãng các dung dịch acid của formaldehyde 2) Thấm dung dịch silver nitrate vào gel trong môi trường acid yếu và dùng formaldehyde khử có chọn lọc các ion bạc thành bạc kim loại dưới điều kiện kiềm Phương pháp diamine kiềm kém nhạy hơn nhưng thích hợp đối với các gel dày, trong khi phương pháp acid nhanh và bắt màu tốt hơn đối với các gel mỏng Cố định nucleic acid trong acetic acid 7,5% tối thiểu 5 phút Rửa gel trong nước khử ion tối thiểu 2 phút Nhuộm gel trong dung dịch bạc với sự có mặt của formaldehyde Rửa gel sau khi nhuộm bạc Phát triển màu của gel Dùng acetic acid lạnh 7,5%. Để dừng p/ư phất triển màu thu hình ảnh càng nhanh càng tốt Các bước nhộm bằng bạc Phóng xạ tự ghi Cố định nucleic acid trong acetic acid 7,5% Ủ phim phóng xạ khoảng 24h. Quan sát kết quả. Tiến hành rửa gel trong nước khử ion Dùng giấy thấm Kimwipe để thấm khô bê ̀mặt gel   Chạy điện di polyacrylamide gel   Ly tâm 12.000 vòng trong 10ph ở 4ºC để thu hồi DNA Kết tủa DNA bằng ethanol ở 4ºC trong 30ph Ly tâm 12.000 vòng/phút ở 4ºC, lấy thể nổi Xác định vị trí DNA Cắt băng DNA ra khỏi gel, chuyển vào eppendorf tube Bổ sung đệm chiết ủ ở 37ºC kèm lắc nhẹ Phân lập các đoạn DNA từ polyacrylamide gel Ứng dụng 4 Nghiên cứu biểu hiện β-galactosidase trong E.coli BL21 β-galactosidase là enzym xúc tác phản ứng thủy phân liên kết β1,4 D galactosidase trong đường lactose thành glucose và β-galactose Quá trình thực hiện Chèn gen đã tinh sạch vào vector biểu hiện pET Tinh sạch vector tái tổ hợp Nạp vào tế bào E.coli BL21 Biểu hiện được protein này ở nhiệt độ và pH thích hợp sau khi cảm ứng với IPGT Sản xuất được enzym này và giúp cho các sản phẩm sữa dễ tiêu hóa (nhất là người trong hệ tiêu hóa của họ thiếu loại enzym này) Các bước cụ thể Chủng vsv tái tổ hợp Baccillus subtilis G1, vector pET22b (+) Khuếch đại bằng PCA Phản ứng gắn sản phẩm PCA từ vector tạo dòng vào vector biểu hiện Biến nạp vector biểu hiện vào E.coli BL21 Nuôi cấy E.coli BL21 và biểu hiện Điện di SDS trên polyacrylamide gel Điện di biến tính trên polyacrylamide gel 12,5 % theo Laemmli(1970) Được nhuộm bằng Coomassie Brillliant Blue trong 3 giờ Rửa với dung dịch 30%(v/v) metanol +10%(v/v)acid axetic cho đến khi có màu trong còn băng protein có màu xanh Cảm ơn cô và các bạn đã lắng nghe