Đề tài Định loại sán lá gan lớn bằng kỹ thuật rapd - Pcr

0 ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC WX Đề tài: ĐỊNH LOẠI SÁN LÁ GAN LỚN BẰNG KỸ THUẬT RAPD-PCR Sinh viên thực hiện: Giáo viên hướng dẫn: Lê Thanh Vương TS Nguyễn Ngọc Hải T.p Hồ Chí Minh, tháng 10 n 1 I. Đặt vấn đề Sán lá gan lớn là một trong những ký sinh trùng nguy hiểm nhất đối với người và gia súc (cừu, bò, dê và động vật nhai lại khác, lợn thỏ, hải ly, chó, mèo và kangaroo.Hai loài thường ký sinh ở người và gia súc là F. hepatica và F. gigantica thuộc giống Fasciola. Hai loài này giống nhau ở nhiều đặc điểm hình thái, sinh thái, sinh học nên việc định loại chúng trên cơ sở phân biệt hình thái rất dễ nhầm lẫn. Bệnh nhân khi phát hiện nhiễm sán lá gan lớn vẫn không thể kết luận tác nhân gây bệnh là F. hepatica hay F. gigantica. Điều này có thể gây hậu quả nghiêm trọng, nhất là đối với F. gigantica chưa thích nghi hoàn toàn với đời sống ký sinh ở người và một số động vật khác, nên tỉ lệ sán phát triển đến trưởng thành rất thấp. Hơn nữa, thời gian sán phát triển đến trưởng thành cũng khá dài và là thời kỳ gây bệnh tích nặng cho chủ. Vì vậy phương pháp chẩn đoán bệnh sán lá gan lớn qua tìm trứng sán là không thích hợp. Phương pháp chẩn đoán bệnh sán lá gan lớn trên cơ sở miễn dịch là rất thích hợp. Vấn đề quan trọng hàng đầu là phải xác định chính xác loài gây bệnh để có các chẩn đoán miễn dịch đặc hiệu và tạo cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo để phòng trị sán lá gan lớn cho cả người và gia súc. Phương pháp RAPD-PCR dựa trên cơ sở phản ứng PCR với mồi ngẫu nhiên (kích thước khoảng 10 nucleotide) giúp định loại sán lá gan dựa vào sự đa hình các đoạn DNA được nhân bản. II. Tổng quan tài liệu 1. Giới thiệu sán lá gan lớn Sán lá gan lớn hình chiếc lá, có kích thước 30 x 10-12mm ở trâu bò. Sán ký sinh trong đường mật trâu bò, nhưng trong nhiều trường hợp, chúng có thể ký sinh lạc chỗ như trong cơ bắp, dưới da... Trong cơ thể ký chủ như người và ngựa, sán lá có thể được tìm thấy trong phổi, dưới da hay nơi khác. 2 Hình: Sán lá gan lớn 3 2. Sự phát triển và vòng đời của sán lá gan lớn Sán trưởng thành đẻ trứng theo phân ra ngoài. Trứng sán lá gan lớn có kích thước 140 x 80 mm. Trứng xuống nước, trứng sán lá gan lớn nở ra ấu trùng lông và ký sinh trong ốc, phát triển thành ấu trùng đuôi, rời khỏi ốc và bám vào các thực vật thủy sinh để tạo nang trùng bơi tự do trong nước. Người hoặc trâu bò ăn phải thực vật thủy sinh hoặc uống nước lã có ấu trùng sẽ bị nhiễm sán lá gan lớn. Hình: Sơ đồ phát triển và vòng đời của sán lá gan Ấu trùng sán lá gan lớn chết ở nhiệt độ 60-700C nhưng nếu chúng ta ăn rau sống, hoặc ăn lẩu tái, trần tái chưa đủ nhiệt độ 40-50 độ C thì ấu trùng sán lá gan vẫn sống được. 3. Đặc điểm bệnh sán lá gan lớn Khi người bị nhiễm ấu trùng sán lá gan vào bộ phận tiêu hóa, ấu trùng đó sẽ theo máu di hành đến gan và cư trú ở đó. Nhưng đối với một số trường hợp, ấu trùng theo đường máu cư trú ở các cơ quan khác như phổi, dưới da thì chúng vẫn phát triển được thành sán lá gan. Sán lá gan lớn hấp thu chất dinh dưỡng của người qua máu. Đối với người, việc chẩn đoán bệnh sán lá 4 gan lớn bằng phương pháp tìm trứng trong phân là khó vì chúng thường cư trú ở các thùy gan. Tuy nhiên, 2-10% bệnh nhân có thể tìm thấy dấu vết sán lá gan qua phân. Còn đối với trâu bò sán lá gan cư trú trong ống mật. Do vậy, phương pháp tìm trứng trong phân rất dễ dàng. Động vật nhai lại (trâu, bò, cừu...) bị nhiễm sán lá gan là mãn tính. Khi bị nhiễm, chúng ít khi có triệu chứng sốt mà biểu hiện chủ yếu là sút cân, gầy yếu. Thông thường, động vật mắc bệnh này ở giai đoạn di hành của ấu trùng sán lá gan lớn thường kéo theo các vi khuẩn hiếm khí dẫn đến nguy cơ tử vong cao. Do các loài động vật trên thường ăn cỏ ngoài đồng, uống nước ao hồ nên tỷ lệ mắc sán lá gan rất cao. Theo con số điều tra của Viện Thú y Quốc gia qua nhiều năm bằng phương pháp tìm trứng trong phân, trên các vùng núi cao, tỷ lệ động vật ăn cỏ bị nhiễm sán lá gan chiếm từ 40- 90%. Số liệu này cho thấy tỷ lệ nhiễm bệnh sán lá gan lớn ở động vật ăn cỏ rất cao. Bệnh sán gan lớn gây tổn thất kinh tế nghiêm trọng do làm tổn thương gan và giảm năng suất thịt, sữa. 4. Phòng tránh bệnh sán lá gan lớn Đối với người, để phòng tránh bệnh sán lá gan lớn, cần rửa sạch các loại rau thủy sinh (rau trồng trong nước), ăn chín, uống sôi. Đối với trâu, bò, dê... hàng năm cần phải cho tẩy giun sán. Cần xử lý phân của của những loài động vật này trước khi sử dụng làm phân bón lót bằng cách mang ủ trước khi bón trực tiếp cho đồng ruộng và rau màu nhằm hạn chế ấu trùng Fasciola gigantica phát triển và bám vào rau màu. 5. Giới thiệu kỹ thuật PCR PCR (Polymerase chain reaction) là phản ứng nhân bản trình tự DNA quan tâm trong test tube (Nguyễn Thái Thủy, 2004). 5 Phản ứng PCR được thực hiện trong máy luân nhiệt, lập lại khoảng 30 – 50 chu kỳ. Phản ứng PCR gồm ba chu kỳ như hình 5 với các thành phần phản ứng như sau: • Taq polymerase • dNTP • Primer • DNA mẫu • Buffer Kết quả phản ứng được đọc qua bảng điện di được nhuộm với Ethidium bromide. ADN ñích 1 Bieán tính (94o C) 2 Baét caëp (55-65o C) 3 Keùo daøi (72o C) 1 2 3 4 n Hình 5: Các giai đoạn của phản ứng PCR 6. Giới thiệu kỹ thuật điện di trên gel agarose Sự di chuyển của các phân tử mang điện trong điện trường gọi là điện di. Điện di hay điện di trên gel (electrophoresis hay gel electrophoresis) áp dụng trong sinh học phân tử là một kĩ thuật để phân tích các phân tử DNA, RNA hay protein dựa trên các đặc điểm vật lý của chúng như kích thước, hình dạng hay điểm đẳng điện tích (isoelectric point). Kĩ thuật này sử dụng một dung dịch đệm (buffer) để dẫn diện và tạo điện trường đều, một bản gel (thường là agarose hay polyacrylamide) đóng vai trò là thể nền để phân tách các phân tử, và các chất nhuộm khác nhau (ethidium bromide, bạc, xanh Coomassie) để phát hiện vị trí các phân tử trên gel sau khi điện di. 6 DNA hay RNA thường tích điện âm. Trong điện di trên gel, mẫu được cho vào các giếng ở gần cực âm và DNA hay RNA sẽ di chuyển về phía cực dương. sự di chuyển tỉ lệ nghịch với kích thước phân tử, phân tử càng nhỏ di chuyển càng nhanh. Điện di trên gel là phương pháp hữu dụng trong các phân tích sinh hoá học. Hình: gel Agarose: cấu tạo mạng lưới cấu trúc ba chiều, cầu nối hydrogen giữa các thành phần. Là polysaccharide tự nhiên được phân lập từ tảo biển, có kích thước lỗ gel lớn thích hợp cho phân tách các phân tử có kích thước lớn và điện di dựa trên độ tích điện. Dùng để phân tách các protein > 500 kDa và các DNA có kích thước lớn hơn 2000 bp. 7 Hình: Một số thiết bị điện di 7. Kỹ thuật RAPD-PCR Các kỹ thuật phân tử như PCR và các biến thể của nó được sử dụng cho việc chẩn đoán bệnh ký sinh và nhận dạng các ký sinh trùng, phát triển kháng nguyên đặc hiệu cho các xét nghiệm huyết thanh học và nghiên cứu các phản ứng miễn dịch ở người bệnh. RAPD là viết tắt của Random Amplification of Polymorphic DNA. Kỹ thuật RAPD dựa trên kỹ thuật PCR, bằng cách sử dụng những pimer ngắn khoảng 10 cặp nucleotide đã biết trước trình tự khuếch đại DNA một ngẫu nhiên. Nguyên tắc: khi hai cá thể hoàn toàn giống nhau, sau khi thực hiện phản ứng RAPD-PCR ở điều kiện như nhau sẽ tạo ra số lượng các đoạn DNA bằng nhau và chiều dài các đoạn tương ứng bằng nhau. Khi có đột biến làm thêm hoặc mất đi một vị trí bắt cặp ngẫu nhiên thì sản phẩm khuếch đại sẽ khác nhau về số lượng đoạn DNA và chiều dài khác nhau của các đoạn giữa các cá thể. Do đó kỹ thuật RAPD có thể phát hiện đột biến. Kỹ thuật này giúp nhận diện những chỉ thị phân tử trội. Quy trình thực hiện RAPD-PCR - Ly trích DNA - Lựa chọn mồi - Tối ưu hoá mồi và thực hiện phản ứng PCR - Chọn các primer khuếch đại ổn định nhất - Điện di trên gel agarose - So sánh kết quả giữa các mẫu PCR thông thường: 8 Hình: Phản ứng PCR đã biết trình tự đoạn gene cần khuếch đại Tuy nhiên, trong RAPD phân tích, trình tự mục tiêu (sẽ được khuếch đại) là chưa biết. Mồi được thiết kế với một trình tự tùy ý, kích thước 10 nucleotide. Sau đó thực hiện một phản ứng PCR và chạy điện di trên gel agarose để đọc kết quả nếu có các phân đoạn DNA được khuếch đại trong sự hiện diện của mồi tùy ý. Trong hình này mô tả một phản ứng RAPD, một đoạn lớn của DNA được sử dụng làm mẫu trong một phản ứng PCR có chứa nhiều bản sao của một mồi ngẫu nhiên duy nhất. Hình: phản ứng RAPD-PCR Trong ví dụ này, có 2 sản phẩm: 9 • Một sản phẩm được tạo bởi PCR khuếch đại trình tự DNA nằm ở giữa cặp mồi 2 và 5. • B là sản phẩm được tạo ra bởi PCR khuếch đại trình tự DNA nằm ở giữa cặp mồi 3 và 6. • Không có sản phẩm PCR là sản phẩm của cặp mồi ở vị trí 1 và 4 vì hai mồi này quá xa nhau. • Không có sản phẩm PCR được tạo ra bởi các mồi tại các vị trí 4 và 2 hoặc các vị trí 5 và 3 bởi vì các cặp primer không được định hướng thích hợp. Tìm sự khác nhau giữa các bộ gene sử dụng kỹ thuật RAPD Nếu các mẫu DNA (gen) được thu nhận từ các nguồn khác nhau, có thể sẽ có sự khác biệt trong trình tự DNA của hai mẫu. Giả sử có một sự thay đổi trong trình tự mồi bắt cặp ở vị trí số 2: Trong hình này, mồi không thể bắt cặp ở vị trí số 2, vì thế không tạo ra sản phẩm, chỉ có sản phẩm B được tạo ra. Khi chạy điện di sản phẩm 2 phản ứng RAPD ở trên, trên gel agarose, kết quả như sau: 10 Sự khác biệt số band khi điện di sản phẩm RAPD cho phép phân biệt được hai cá thể khác nhau, các giống khác nhau. III. Vật liệu và phương pháp 1. Phân lập ký sinh trùng Sán lá gan lớn Fasciola hepatica đã thu được từ gan của bò và cừu, được rửa nhiều lần với phosphate-buffered saline (PBS) pH 7,4 và sau đó ủ trong hệ đệm tương tự ở 37 ° C trong 3 giờ để loại bỏ hết vật chất của ký chủ. Sau đó các ký sinh trùng được rửa sạch với PBS nhiều lần. 2. Chiết tách DNA Việc khai thác của DNA được thực hiện theo các bước được mô tả trước đó bởi KAPLAN et al., MC Manus và Bowles; Vargas et al.. Phương pháp đã được chỉnh sửa như sau: Các mẫu ký sinh trùng được đồng nhất trong một dung dịch phân giải (8% triton 100X, 0,25 M Sucroza, 50 mm EDTA, pH 7,4). Dung dịch đồng nhất được ly tâm 10000 vòng/ phút trong 10 phút, ở 4°C. DNA bộ gen được tách ra bởi SDS-proteinase K, enzym này sẽ phá vỡ các polypeptide thành các đơn vị nhỏ hơn, sau đó dễ dàng tách bởi phenol chloroform. DNA phục hồi được hòa tan trong 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 7,6 (Tris-EDTA đệm) và RNA được loại bỏ bằng cách ủ với RNAse ở 37 ° C trong 1h, sau đó kết tủa lần thứ hai bởi phenol cloroform và ethanol. Dịch huyền phù được bảo quản ở -20°C. 3. Lựa chọn mồi Để tối ưu hóa các điều kiện PCR, ba mồi (5'-TCG TCG CATT -3 '(OSA09), 5'-AGC AGC AGGC -3' (OSA 10) và 5'-GGG TAA CGCC -3 11 '(OSA 11 )) đã được lựa chọn ngẫu nhiên để khuyếch đại DNA của Fasciola hepatica có nguồn gốc ở bò và cừu. 4. Tối ưu hóa Sự cần thiết tối ưu hóa các điều kiện là để việc khuếch đại có thể thu nhận đầy đủ và tái bản nhiều band mẫu cho DNA bộ gen của mỗi ký sinh trùng (5ng). Nồng độ DNA được xác định nhờ ultraviolet absorbance spectrophotometry tại bước sóng 260nm. Lượng bức xạ tia tử ngoại hấp thu bởi dung dịch DNA tỷ lệ thuận với lượng DNA trong mẫu. Sự hấp thu tia tử ngoại cũng được sử dụng để kiểm tra độ tinh sạch của DNA mẫu. Phản ứng này được thực hiện trong một thể tích 50 μL chứa 10X dung dịch đệm (500 mM KCI, 200 mM Tris-HCl pH 8,4), 2,0 mM MgCI, 20,4 μm dNTPs (Promega, Hoa Kỳ). Mỗi ống phản ứng có 2 đơn vị của Taq polymerase. DNA được khuếch đại trong 75 chu kỳ với một bước biến tính ở 94oC trong 5 giây, mồi bắt cặp lúc 36 ° C trong 30 giây, và bước kéo dài ở 720C trong 10 giây. 5. Điện di sản phẩm PCR Điện di trên gel agarose 1,4% agarose gel được nhuộm màu với bromua ethidium trước khi quan sát và chụp ảnh. Nó được sử dụng như là chỉ thị trọng lượng phân tử một cái thang 100 pb. IV. Kết quả Kết quả của nghiên cứu này cho thấy rằng mồi khác nhau cho các đoạn DNA khác nhau (Bảng I). Những doạn khác nhau này đặc trưng cho loài F. hepatica có nguồn gốc từ bò và cừu. Các kích thước của các đoạn DNA của F.hepatica từ bò và cừu được khuếch đại bằng mồi OSA-09 tương ứng khoảng 700 bp và bp 150 (Hình 1). 12 Sử dụng OSA-10 mồi, chỉ có doạn DNA (150 bp) từ F. hepatica trên cừu đã được phát hiện, trong khi không có đoạn khuếch đại của F. hepatica trên bò (Hình 2). 13 Cuối cùng, sau khi khuếch đại của mồi OSA-11, 2 đoạn ADN khoảng 200 và 400 bp đã thu được chỉ từ F. hepatica trên bò và không có band DNA của F. hepatica trên cừu được phát hiện (hình 3). V. Thảo luận Việc xác định các loài gần gũi dựa trên đặc điểm hình thái có thể khó khăn. Điều này đặc biệt là trường hợp cho các loài động vật thân mềm như sán lá ký sinh. Tuy nhiên, tiến bộ gần đây trong sinh học phân tử, đặc biệt là khuếch đại vùng ADN đặc trưng thông qua phản ứng PCR có thể cho phép để phân biệt các có loài quan hệ gần gũi bằng cách so sánh DNA của chúng. DNA prode cũng như PCR primer dựa trên khu vực biến động của chuỗi DNA ribosome đã được phát triển để phát hiện và định loại các loài Fasciola. Kỹ thuật RAPD-PCR cho phép khuếch đại của khu vực ngắn của bộ gen của một sinh vật mà không có thông tin về trình tự trước, nên rất thuận tiện trên các đối tượng mà bộ gen chưa được biết rõ. Kỹ thuật này có một tiềm năng lớn trong phân biệt giống, phân biệt cá thể và lập bản đồ di truyền. Trong nghiên cứu này, 3 mồi ngẫu nhiên đã cho các đoạn DNA có kích thước khác nhau theo nguồn gốc các loài trên ký chủ khác nhau. Phân biệt những đoạn đặc trưng cho F. hepatica có nguồn gốc từ bò và cừu. Với primer OSA-09, một đoạn dài 150 bp DNA được thu được từ 14 F. hepatica trên cừu, trong khi một đoạn DNA độ dài 700 bp đã được xác định từ F. hepatica trên bò. Các kết quả này tương đồng với báo cáo trước đó. Từ đó kết luận rằng RAPD-PCR kỹ thuật có thể chứg minh về mối quan hệ di truyền giữa Fasciola hepatica có nguồn gốc và cừu và cũng để xác định cụ thể các loài giun sán ký sinh. VI. Tài liệu tham khảo