Đề tài Enzyme glucose isomerase và glucose oxidase

VIỆN SINH HỌC – THỰC PHẨM TIỂU LUẬN PHỤ GIA THỰC PHẨM Đề tài ENZYME GLUCOSE ISOMERASE VÀ GLUCOSE OXIDASE MỞ ĐẦU Cùng với sự tiến bộ của xã hội, sự phát triển của khoa học kỹ thuật nhu cầu của con người cũng không ngừng nâng lên. Không chỉ đơn thuần là ăn no mà còn phải ăn ngon và thực phẩm phải có tính hấp dẫn, bắt mắt. Từ ngàn xưa, ông cha ta đã biết lấy các chất màu trong thiên nhiên như cỏ cây, các loại lá, khoáng chất... để cho vào các món ăn nhằm làm tăng thêm tính hấp dẫn, kích thích sự ngon miệng trong ăn uống. Những chất khi thêm vào trong thực phẩm nhằm mục đích bù lượng tổn thất trong quá trình sản xuất và bảo quản, cải thiện chất dinh dưỡng cho thực phẩm, tăng thời gian bảo quản sản phẩm, tăng thêm giá trị cảm quan và hấp dẫn người tiêu dùng đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của khách hàng gọi là chất phụ gia trong thực phẩm. Ngoài những vai trò trên nếu không được sử dụng hợp lí và hiệu quả thì những chất phụ gia sẽ gây nguy hiểm cho sức khỏe của người tiêu dùng. Glucose isonerase, glucose oxidase là hai enzyme thuộc nhóm enzyme chuyển hóa đồng phân và enzyme oxy hóa được dùng trong việc cải thiện độ ngọt của đường dùng trong sản xuất các sản phẩm syrup, dịch đường,.. NỘI DUNG Enzyme glucose isomarase Giới thiệu chung về enzyme glucose isomerase D – glucose / xylose isomerase thường được gọi là glucose isomerase (GI) là một trong ba enzyme có giá trị xúc tác cao nhất, amylase và protease là hai enzyme còn lại. Theo wiseman, GI có thể quan trọng nhất trong tất cả các ngành công nghiệp thuộc về enzyme trong tương lai. Nó xúc tác đồng phân thuận nghịch của D – glucose và D – xylose chuyển thành D – fructose và D – xylulose, tương ứng. Sự chuyển đổi qua lại của xylose sang xylulose đáp ứng yêu cầu dinh dưỡng trong vi khuẩn hoại sinh phát triển mạnh trên vật liệu là cây mục nát, cũng hổ trợ sự biến đổi của hemicellulose để sản xuất ethanol. Đồng phân của glucose với fructose .. thương mại quan trọng trong sản xuất si-rô ngô có hàm lượng fructose cao (HFCS). Saccharose có nguồn gốc từ củ cải đường (40%) và đường mía (60%) là chất làm ngọt chính trên thế giới cho đến năm 1976. Việc sản xuất HFCS bằng cách sử dụng enzyme glucose isomerase lần đầu tiên được phát triển ở Nhật Bản và sau đó là ở Mỹ. GI đã đạt được tầm thương mại quan trọng tại Mỹ vì thiếu sự cung cấp saccharose sau cuộc cách mạng Cuba năm 1958 và nó tiếp tục là một trong những enzyme công nghiệp quan trọng cho đến nay. Lịch sử phát triển của enzyme glucose isomerase Nguồn gốc sự phát triển thành công của sản phẩm si- rô fructose nằm trong sự phát hiện của enzyme glucose – isomerizing. Trong lịch sử có 4 loại enzyme khác nhau đã được gọi là glucose isomerases. Các khám phá của Marsall và Kooi năm 1957 về khả năng của glucose – isomerizing từ Pseudomonas hydrophila là điểm khởi đầu của việc khai thác enzyme này để sản xuất HFCS như một sự thay thế cho đường mía. Sự sản xuất enzyme xylose là cần thiết trong môi trường phát triển và được tăng cường trong sự phát triển với sự có mặt của arsenate. Sau đó, một xylose isomerase hoạt động, mà sự hoạt động đó độc lập với xylose, đã được tìm thấy trong Escherichia intermedia. Các enzyme là một phosphor glucose isomerase (EC 5.3.1.9), mà có thể isomerase không phải phosphoryl hóa đường duy nhất trong sự hiện diện của arsenate. Takasaki và Tanable đã phân lập từ Bacillus megaterium AI một glucose isomerase (EC 5.3.1.18) mà NAD liên kết và cụ thể với glucose. Một glucose isomerase tương tự hoạt động, xúc tác đồng phân của cả hai đường glucose và mannose với fructose, được phân lập từ Paracolobacterium aerogenoides. Glucose isomerase được sản xuất bởi vi khuẩn acid heterolactic yêu cầu xylose như một chất cảm ứng và tương đối ổn định ở nhiệt độ cao hơn. Trong số này các hoạt động glucose – isomerizing, xylose isomerase (EC 5.3.1.5) là phù hợp nhiều nhất cho các hoạt động thương mại. đó là nhiệt độ ổn định và không yêu cầu cofactor đắt tiền như NAD hoặc ATP cho hoạt động. Enzyme glucose isomerase lần dầu tiên được thực hiện trong quy mô công nghiệp năm 1967 bởi Clinton. Nhu cầu HFCS cho thực phẩm ngày càng tăng và đến năm 1980 thực tế tất cả các công ty chế biến tinh bột lớnin the western world were resorting to GI technology. trong thế giới phương Tây đã phải dùng đến công nghệ GI. Today,Ngày nay, the enzyme commands the biggest market in the food indusenzyme là thị trường lớn nhất trong ngành công nghiệp thực phẩm. Đặc tính của glucose isomerase Các enzyme và các tính chất hóa lý của GI từ một số sinh vật đã được nghiên cứu rộng rãi. Kiến thức rõ ràng các đặc tính của enzyme, như sự ổn định của nó, cơ chất đặc trưng và yêu cầu ion kim loại là quan trọng để ngăn chặng sự bất hoạt của nó và để đánh giá sự phù hợp cho việc ứng dụng trong sản xuất HFCS. Cơ chất đặc trưng Khả năng của các enzyme đồng phân hóa trên các cơ chất đa dạng như pentose, hexoses, sugar alcohols, và đường phosphates đã được nghiên cứu. Mặc dù cơ chất đặc trưng của enzyme từ nhiều nguồn thay đổi khác nhau, các enzyme có thể sử dụng D – ribose, L – arabinose, L – rhamnose, D – allose, và 2 – deoxyglucose, cũng như cơ chất phổ biến nhất là D – glucose và D – xylose. Đồng phân tối đa được thu với chất nền có các nhóm hydroxyl tại cacbon số 3 và 4 trong vị trí như việc chuyển đổi tỷ lệ của D - glucose đến D – fructose xúc tác bởi GI từ những sinh vật khác nhau ở dạng hòa tan hoặc bất động trong khoảng 26 – 59%. Giá trị Km của enzyme cho D – glucose và D – xylose trong phạm vi từ 0.086 đến 0.920M, và 0.005 đến 0.093M. Yêu cẩu ion kim loại và các chất đặc trưng GI yêu cầu một cation hóa trị 2 như Mg2+, Co2+, hoặc Mn2+, hoặc một sự kết hợp của các ion này cho hoạt động tối đa. Mặc dù cả hai Mg2+ và Co2+ là rất cần thiết cho hoạt động nhưng khác nhau về vai trò. Trong khi Mg2+ tốt hơn Co2+ như một chất hoạt hóa, Co2+ chịu trách nhiệm cho sự ổn định của enzyme bởi giữ được sự sắp xếp về cấu tạo, đặc biệt là các cấu trúc bậc bốn của enzyme. Ion kim loại liên kết trực tiếp đã được nghiên cứu bởi Danno trên GI từ Bacillus coagulans. Kasumi et al. đã báo cáo sự hiện diện của bốn ion Co2+ của GI từ Streptomyces griseo fuscus fuscus. Các hoạt động xúc tác của GI đã được ức chế bởi các kim loại như Ag2+, Hg2+, Cu2+, Zn2+ và Ni2+ và để tăng mức độ bởi Ca2+. Chất ức chế khác được biết đến của GI là xylitol, arabitol, Sorbitol, mannitol, lyxose, and Tris (31, 153bitol, mannitol, lyxose, và Tris. Các tiểu đơn vị cấu trúc Sự kết tủa không đổi và trọng lượng phân tử của GI thay đổi từ 7.55 đến 11.45 và từ 52.000 đến 191.000. Các cấu trúc tiểu đơn vị và thành phần axit amin GI bộc lộ rằng đó là một tetramer hoặc dimer tương tự hoặc tiểu đơn vị giống hệt nhau liên kết với các noncovalent và là không có disulfide. Mỗi isoenzymes là một tetramer tiểu đơn vị nonidentical. Hiệu quả của chất làm biến tính như urê, guanidine hydrochloride, sodium dodecyl sulfate, và nhiệt độ trên hoạt động của GI từ Arthrobacter và Streptomyces spp. đã được điều tra. Các phân ly và diễn tiến của GI tetrameric từ Streptomyces sp. Biến dạng NCIM 2730 nói rằng các tetramer và dimer là loài hoạt động trong khi monomer không hoạt động. Nhiệt độ và pH tối ưu Nhiệt độ tối ưu của GI trong phạm vi từ 60 – 800C và gia tăng trong sự có mặt của Co2+. Giá trị pH tối ưu của GI nói chung là giữa pH 7.0 và 9.0. Enzyme từ Lactobacillus brevis có pH tối ưu thấp hơn (6 – 7), đó là mong muốn cho các ứng dụng thương mại của GI.The Các enzyme from Streptomyces spp., Bacillus spp., Actinoplanes mis-enzyme từ Streptomyces spp, Bacillus spp, Actinoplanes mis-souriensis , and Thermus thermosulfurogenes is stable at higsouriensis, và Thermus thermosulfurogenes ổn định ở mức temperatures, but that from Lactobacillus and Escherichia spp.nhiệt độ cao, GI từ Lactobacillus và Escherichia spp. is less stable.ít ổn định hơn . Nghiên cứu phạm vi hoat động Danh tính của các axit amin tham gia tại hoặc gần các phạm vi hoạt động của GI đã được giải mã với nhóm hóa chất cụ thể và tinh thể học X - Ray. Bằng chứng cho histidine là cần thiết và các dư lượng carboxylate trong GI đã được trình bày. Môi trường cấu trúc của dư lượng axit amin chức năng đã được xác định bằng cách thay đổi hóa học và sau đó lập bản đồ khác biệt giữa các peptide của GI. Từ lâu đã nhận ra rằng GI xúc tác đồng phân của cả glucose và xylose. Tuy nhiên, cho dù các phản ứng xảy ra ở cùng một phạm vi hoạt động hoặc tại hai địa điểm khác nhau không được biết. Các sự hiện diện của một phạm vi hoạt động duy nhất cho đồng phân của cả hai glucose và xylose đã được chứng minh bằng cách sử dụng một phương pháp động được xây dựng bởi Keleti et al. Cơ chế hoạt động của glucose isomarase Mặc dù tầm GI có tầm quan trọng trong thương mại nhưng có rất ít thông tin available about the structural and mechanistic properties ofsẵn có về các tính chất cấu trúc và cơ chế của GInó. The catalytic mechanism of GI has been a subject of greCác cơ chế xúc tác của GI đã là một chủ đề lớn được interest to researcherscác nhà nghiên cứu quan tâm. Trước đó, GI đã được giả định là chức năng tương tự như đường phosphate isomerases và làm theo cơ chế enediol (hình dưới) Các nghiên cứu gần đây do hoạt động của GI đến hydride như một cơ chế chuyển đổi. Kiến thức về cấu hình hoạt động là điều kiện tiên quyết cho việc nghiên cứu mối quan hệ về cấu trúc và chức năng của enzyme. Các phương pháp tiếp cận khác nhau đã được nghiên cứu về phạm vi hoạt động của GI và để phân định cơ chế hoạt động của nó. Chúng bao gồm thay đổi hóa học, tinh thể lọc tia X và chuyển đổi đồng vị. Các tính năng chính của cơ chế đã đề xuất cho GI là mở rộng cơ chất, đồng phân hóa thông qua một hydride chuyển đổi từ C-2 sang C-1, và kết thúc một vòng sản phẩm. Sự chuyển đổi đồng phân hóa học của glucose isomerase Sự thay đổi hóa học của phần dư acid amin với cụ thể là thuốc thử hóa học như một phương pháp đơn giản của việc khảo sát phạm vi hoạt động của enzyme. Sự tham gia có thể có của histidine trong phạm vi hoạt động của GI đã được mặc nhiên công nhận bằng cách nghiên cứu tác động của diethylpyrocarbonate lên sự ngừng hoạt động của GI. Sau đó, bằng chứng cho sự có mặt của một lượng dư histidine cần thiết cho phạm vi hoạt động của GI từ nhau Lactobacillus spp andvà Streptomyces spp.Streptomyces spp khác nhau đã được cung cấp. Sự ức chế bởi diethylpyrocarbonate đã được khắc phục bằng hydroxylamine. Tóm lại, sự bảo vệ hoạt động của enzyme là khả năng của cơ chất và cơ chất tương tự xylitol trong suốt quá trình thay đổi hóa học. Histidine được biết đến chức năng như một cơ sở tóm tắt proton và hỗ trợ chuyển đổi hydro. Sự có mặt của một lượng dư aspartate hoặc glutamate trong GI là tài liệu bằng cách bất hoạt bởi thuốc thử K Woodward’s hoặc guanidine hydrochloride. Sự tham gia của lượng dư carboxylate kéo theo các ràng buộc của các cofactor ion kim loại. Hóa chất sửa đổi, bảo vệ hay không bảo vệ GI và tiếp theo peptide lập bản đồ cho phép xác định với một chuỗi sự đồng thuận bao gồm Phe – His – Xaa – Asp – Xaa – Xaa – Pro – Xaa – Gly. Kết qủa nghiên cứu về thay đổi hóa học của GI bổ sung cho các kết luận rút ra trân cở sở nghiên cứu các tinh thể lọc X – Ray. Tinh thể lọc X – Ray Tinh thể lọc tia X mang lại sự đánh giá chi tiết về cấu trúc 3 chiều của protein và cho phép hình dung thực tế phức hợp giữa enzyme và cơ chất của nó hoặc chất ức chế. GI từ các loài vi khuẩn khác nhau như Actino- myces , Arthrobacter , Actinoplanes , and Bacillus species hasmyces, Arthrobacter, Actinoplanes, và các loài vi khuẩn Bacillus được nghiên cứu bởi tinh thể lọc X – Ray ở các cấp độ khác nhau của độ phân giải, sự có mặt và không có mặt của các chất ức chế và ion kim loại để hiểu và giải thích cơ chế họat động. Từ khi GI là một chất nền đơn chất duy nhất của enzyme, nó có thể quan sát sự phức tạp Mihaelis trực tiếp tại một chất nền nồng độ tập trung cao hơn Km của nó. Các cấu trúc của GI từ một số Streptomyces spp.Streptomyces spp. are accurately known.được biết chính xác, nó rất tương tự, đặc biệt là ở phạm vi hoạt động. Cấu trúc của GI từ Streptomyces rubiginosus as determined at 4-Å (1 ÅStreptomyces rubiginosus được xác định tại độ phân giải 4 - Å (1 Å = 0.1 nm)0,1 nm) đã chỉ ra rằng enzyme bao gồm tám sợi xoắn đơn vị được tìm thấy trong triose – phosphate isomarase. Sự phân tích cấu trúc tinh thể của GI từ olivochromogenes Streptomyces ở 3Å cho thấy GI dài 30Å, 40Å trong đường kính. Characterization của cấu trúc tinh thể từ Streptomyces violaceoniger ở resolution revealed a variation in the quaternary structuređộ phân giải 2,2-Å cho thấy một sự thay đổi trong cấu trúc bậc bốn from that of S.của GI từ S. olivochromogenes GI in solution (77).olivochromogenes trong dung dịch. Các structure of crystalline GI from Streptomyces rubiginosus hascấu trúc của tinh thể GI từ Streptomyces rubiginosus been determined in the presence of substrate and an activeđược xác định trong sự hiện diện của chất nền và phạm vi hoạt động hướng chất ức chế ở độ phẩn giải 1.9 - Å. Những nghiên cứu này dẫn đến việc xác định khu vực hoạt động của enzyme và hai kim loại ràng buộc các phạm vi. Một trong các ion kim loại liên kết với C – 3-O và C-5-O của cơ chất, trong khi có một liên hệ chặt chẽ giữa histidine và C – 1 của cơ chất. Kết quả cho thấy mechanism involves an open-chain conformation of substratecơ chế liên quan đến một cấu chuỗi mở theo cơ chất and probably a formation of a cis -enediol intermediate.và có thể là một hình thành của một trung gian cis-enediol. Gần đâystudies on X-ray crystallographic structures of the metal acti- nghiên cứu về cấu trúc tinh thể X-quang của kim loại activated GI từ S. olivochromogenes show that the isomerizationolivochromogenes các đồng phân được xúc tác bởi hai cofactors kim loại và cầu nối của nó thông qua lượng dư glutamate để thúc đẩy một sự thay đổi hydride. Trong hai ion magie thiết yếu cho hoạt động của enzyme, Mg2+ được quan sát chiếm hai vị trí thay thế cách nhau 1.8Å. TheCác observed movement of the metal ions in the presence of sub-quan sát chuyển động của các ion kim loại trong sự hiện diện của cơ chất là do một bước sau ràng buộcRecent chất nền nhưng trước khi đồng phân. Các chất nền, tuyến tính của nó với extended forms, were observed to interact with the enzyme andcác hình thức mở rộng, được quan sát tương tác với các enzyme và the metal cofactor.đồng yếu tố kim loại.Carell et al. Carell et al đã chỉ ra rằng GI từ S. rubiginosus can bind substrates and inhibitors in a variety ofS. rubiginosus có thể liên kết với các chất nền và chất ức chế trong một loạt các binding modes depending on the size of the sugar.ràng buộc các chế độ tùy thuộc vào kích thước của đường. Acid D – Threonohedroxamic tương tự như giả định chuyển đổi trạng thái trong bước đồng phân của xylose bởi GI và là một chất ức chế mạnh của enzyme. Các nghiên cứu về tinh thể lọc X – Ray về độ phân giải cao trong cấu trúc đồ họa sự phức tạp giữa các GI từ S. olivo-Olivo- chromogenes andchromogenes và acid D – Theronohydroxamic cung cấp bằng chứng cho hoạt động kim loại trong xúc tác trên deprotonation, tiếp theo là sự hình thành của một phối cấu tử cầu nối. Những kết qủa này xác nhận các quan sát trước đó rằng protonation của nhóm hydroxyl xảy ra sau khi ko73 vòng. Cấu trúc tinh thể của GI từ Arthrobacter dòng B3728 có chứa các chất ức chế xylitol và D – Sorbitol đã được nghiên cứu ở độ phân giải 2.5 và 2.3-Å tương ứng. Các ion kim loại là phức hợp tại phạm vi ái lực cao bên cạnh bốn chuổi carboxylate. Các chất ức chế đang bị ràng buộc về phạm vi hoạt động trong cấu tạo mở chuổi rộng và hoàn thành một vỏ phối hợp tám mặt cho cơ chất cation thông qua nguyên tử oxy O – 2 và O – 4. Collier et al. và các nhà nghiên cứu khác đã cho thấy thêm rằng ràng buộc vào phạm vi hoạt động của cation thứ hai cũng là cần thiết cho xúc tác. Phạm vi này liên kết Co2+ mạnh hơn so với phạm vi hoạt động một và nó là octahedrally phối hợp với ba nhóm carboxylate, một imidazole và một phân tử dung môi. Trong sự thay đổi hydide, C-O-1 và sự liên kết C-O-2 của bề mặt phân cực cách tiếp cận chặt chẽ của hai cation. Sau khi đồng phân hóa, đóng vòng được xúc tác là ngược lại của bước mở vòng. Anomerism và stereospecificity là các men tiêu hóa được thể hiện hoàn toàn phù hợp với sự thay đổi hydride. Kết tinh và đặc tính của GI từ Bacillus coagulans (132) and Actinoplanes missouriensis (92) iscillus coagulans và Actinoplanes missouriensis cũng đã được báo cáo. Sự tao đổi đồng vị Các tinh thể có sẵn là chỉ tiêu cho các quy tắc GI ra proton chuyển đổi cơ chế và đề nghị một cơ chể chuyển đổi hydride. Tuy nhiên, dữ liệu cấu trúc một mình không đủ để kết luận cơ chế họat động của một enzyme.Uncertainty about a proton Sự không chắc chắn về một proton transfer mechanism in GI was prompted by the absence ofchuyển đổi cơ cấu trong GI đã được nhắc nhở bởi sự vắng mặt của solvent exchange during investigations on the incorporation oftrao đổi dung môi trong quá trình nghiên cứu trên sự kết hợp của tritiated water into the product (136).tritiated nước vào sản phẩm. Tuy nhiên, khả năng of fast proton transfer in a shielded activity could notproton chuyển nhanh trong một hoạt động bảo vệ không thể được loại trừout. ra ngoài. Allen et aAllen et al. (2) have carried out isotope exchange exper-đã tiến hành đồng vị trao đổi experiments at higher temperature, extreme pHs, and in the pres-iments ở nhiệt độ cao hơn, PHS cực đại, và trong sự có mặt của ence of guanidine hydrochloride to investigate the possibilityhydrochloride guanidine để nghiên cứu khả năng of shielded proton transfer.chuyển proton được bảo vệ. Their nuclear magnetic resonanceCộng hưởng từ hạt nhân của họ studies, coupled with the studies on fluorine-substituted sub-nghiên cứu, kết hợp với các nghiên cứu về flo-thay thế phụ strate analogs, do not support a proton transfer mechanism forcác chất tương tự strate, không hỗ trợ một cơ chế chuyển proton GI.GI. Nghiên cứu gần đây về đột biến đồng phân D – Xylose từ Actinoplanes missouriensis hỗ trợ vai trò quan trọng của các phân tử nước TRP-690, ASP-255 và Glu-liền kề 186 in proton transfer from 2-OH to O-1 of the open and186 trong chuyển proton từ 2-OH sang O-1 mở và extended aldose substrate (169).mở rộng aldose chất nền. Ứng dụng và tầm quan trọng của glucose isomerase GI phục vụ như là một mô hình thú vị để nghiên cứu cấu trúc function relationships by advanced biochemical and geneticchức năng mối quan hệ tiến hóa sinh và kỹ thuật di truyềnengineering techniques.. Besides its academic importance, itBên cạnh tầm quan trọng học tập, nó has received increased attention by industries for its use inđã nhận được sự quan tâm của các ngành công nghiệp sử dụng của nó trong producing HFCS and for its potential application in the pro-sản xuất HFCS và cho các ứng dụng tiềm năng của nó trong duction of ethanol from hemicelluloses.sản xuất ethanol từ hemicelluloses. Ưu điểm của si-rô ngô có hàm lượng fructose cao như chất làm ngọt Tăng nhu cầu đối với đường tinh chế, kết hợp với cost of production and awareness of the adverse effects ofchi phí sản xuất cao và nhận thức về tác hại của sucrose and invert sugar consumption on human health, havesaccharose và đảo ngược đường tiêu thụ trên sức khỏe con người, có necessitated the search for acceptable sucrose substitutes.đòi hỏi phải tìm kiếm các sản phẩm thay thế saccharose chấp nhận được. AMột large number of noncalorific and noncarbohydrate artificialsố lượng lớn chất ngọt nhân tạo như saccharine, cyclamate, acesulfame-K, apartame, and thaumatin have been discovered and dismisspartame, và thaumatin đã được phát hiện, miễn nhiệm on the basis of health concerns or other drawbacks.trên cơ sở các mối quan tâm y tế hoặc hạn chế khác. SIncự kết hợp của các chất tạo vị ngọt làm cho nó ít ngọt hơn sau khi lưu trữ lâu dài, bởi vì chất tạo ngọt là từ sự thủy phân chậm ở pH thấp. Thaumatin, một chất ngọt protein lý tưởng, ngọt hơn saccharose 2000 lần nhưng có sự khác biệt là có mùi vị khó chịu. HFCS, HFCS, một hỗn hợp cân bằng của glucose và fructose(1:1) is 1.3 times sweeter than sucrose and 1.7 times