Đề tài Một số kỹ thuật chẩn đoán vi khuẩn leptospira

Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải Trang 1 Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Bộ môn Công nghệ sinh học Lớp DH06SH Bài tiểu luận: MỘT SỐ KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN LEPTOSPIRA Giáo viên hướng dẫn: Nguyễn Ngọc Hải Sinh viên thực hiện: Lý Sơn Tùng MSSV: 06126178 Thành phố Hồ Chí M Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải Trang 2 LỜI MỞ ĐẦU Vi sinh vật là tác nhân được rất nhiều nhà khoa học quan tâm, nghiên cứu không chỉ trước đây, hiện tại mà còn trong cả tương lai. Điều này có lẽ là do ba lí do: thứ nhất là sự đa dạng của vi sinh vật, thứ hai là những lợi ích to lớn mà chúng mang lại cho con người trong nhiều lĩnh vực, và cuối cùng chúng cũng là những tác nhân gây nhiều bệnh nguy hiểm cho con người và vật nuôi. Từ xưa con người đã biết sử dụng vi sinh vật trong việc lên men để tạo ra nhiều món ăn có giá trị dinh dưỡng cao, và sau này còn phát triển chúng trong nhiều lĩnh vực khác như phân vi sinh, probiotic, trong xử lí chất thải,…. Những ứng dụng to lớn của vi sinh vật là không thể phủ nhận, tuy nhiên, khả năng gây bệnh của vi sinh vật cũng là một vấn đề đáng quan tâm. Các tác nhân gây bệnh có thể là vi khuẩn, virus hay kí sinh trùng,…. Virus có lẽ là tác nhân nguy hiểm nhất và các tác nhân đều để lại những hậu quả nhất định trong công tác chăn nuôi và sức khỏe con người. Nhiều kỹ thuật đã ra đời, phát triển và không ngừng hoàn thiện để có thể đáp ứng yêu cầu chẩn đoán phát hiện các nhóm vi sinh vật gây bệnh này. Trong lĩnh vực chăn nuôi, các nhà khoa học đã chú ý đến một loại xoắn khuẩn là Leptospira. Xoắn khuẩn này có khả năng gây bệnh trên động vật và có thể lây sang người. Bệnh do xoắn khuẩn gây ra còn gọi là bệnh vàng da, nó gây ảnh hưởng đến các cơ quan và có thể gây sẩy thai ở thú nuôi. Cách phòng bệnh duy nhất là tiêu hủy ổ dịch để tránh lây nhiễm. Vì vậy, cần có các kỹ thuật để phát hiện nhanh xoắn khuẩn này để tránh lây lan gây thiệt hại lớn. Trước đây, cách phát hiện Leptospira là sử dụng phương pháp nuôi cấy, sau đó kỹ thuật Microscopic agglutination test (MAT) ra đời và được sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán bệnh. Tiếp theo đó, khi khoa học phát triển, các kỹ thuật mới ra đời và được hy vọng là có thể khắc phục được nhược điểm của MAT và thay thế nó. Hai kỹ thuật được nhắc đến nhiều nhất là ELISA và khuếch đại gene PCR. Bài tiểu luận này sẽ giới thiệu qua về bệnh do xoắn khuẩn Leptospira và các kỹ thuật nuôi cấy, MAT, ELISA và PCR trong việc chẩn đoán Leptospira. Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải Trang 3 TỔNG QUAN I. Leptospira 1. Phân loại học Theo Noguchi, 1917: Giới: Monera Ngành: Spirochaetes Họ: Leptospiraceae Giống: Leptospira Các loài gồm có: L. alexanderi, L. biflexa, L. broomii, L. borgpetersenii, L. fainei, L. inadai, L. interrogans, L. kirschneri, L. licerasiae, L. meyeri, L. weilii, L. noguchii, L. santarosai, L. wolbachii, L. kmetyi, L. wolffii, L. genomospecies 1, L. genomospecies 3, L. genomospecies 4, L. genomospecies 5. Trong số đó, người ta phân ra thành các loài gây bệnh, không gây bệnh và loài trung gian. Các loài gây bệnh Leptospira interrogans Leptospira kirschneri Leptospira noguchii Leptospira alexanderi Leptospira weilii Leptospira genomospecies 1 Leptospira borgpetersenii Leptospira santarosai Leptospira kmetyi Các loài trung gian Leptospira inadai Leptospira fainei Leptospira broomii Leptospira licerasiae Leptospira wolffii Các loài không gây bệnh Leptospira biflexa Leptospira meyeri Leptospira wolbachii Leptospira genomospecies 3 Leptospira genomospecies 4 Leptospira genomospecies 5 Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải Trang 4 2. Đặc điểm sinh vật học Hình thể: rất mảnh, đường kính 0,1- 0,2µm, dài 5- 25µm, di động mạnh. Thường nhuộm theo phương pháp nhuộm thấm bạc Fontana-Tribondeau mới phát hiện được vi khuẩn, khi đó vi khuẩn nhìn thấy mảnh như sợi tóc, hai đầu cong như móc câu. Dưới kính hiển vi điện tử phóng đại khoảng x 10.000 lần mới thấy các vòng xoắn nhỏ, sát nhau. Tính chất nuôi cấy: đây là xoắn khuẩn duy nhất nuôi cấy được trong điều kiện hiếu khí. Thường nuôi trong môi trường lỏng có thêm huyết thanh động vật (thỏ) tươi (sản xuất theo Terskich hoặc Korthoff); pH 7.2- 7.5; nhiệt độ 28-300C và giàu oxy. Leptospira mọc chậm, sau 6- 10 ngày mới phát triển tốt (đặc điểm nuôi cấy là làm vẩn nhẹ môi trường như khói thuốc lá). Sức đề kháng: nói chung các Leptospira có sức đề kháng yếu, song cao hơn các xoắn khuẩn khác; chết nhanh trong môi trường acid. Leptospira có thể sống tự do ở trong đất, trong nước ngọt và trong môi trường mặn (sống được hàng tháng) nhưng có ánh sáng mặt trời thì nhanh chết. Cấu tạo kháng nguyên: dựa vào cấu trúc kháng nguyên mà phân loại thì Leptospira được chia ra làm 20 nhóm, mỗi nhóm có nhiều type huyết thanh. Ở Việt Nam thường gặp 12 type huyết thanh sau: L. australis L. canicola L. autumnalis L. grippothyphosa L. bataviae L. hebdomalis L. ictero- haemorrhagiae L. ponoma L. mitis L. saxkoebing L. poi L. sejroe 3. Khả năng gây bệnh Leptospira gây bệnh xoắn khuẩn, gọi là Leptospirosis. Xoắn khuẩn có trong các loại động vật (chuột, lợn, chó, sói, nhím). Súc vật thường không có triệu chứng bệnh. Người có thể bị lây trực tiếp qua da bị xây xát, qua niêm mạc mắt mũi miệng, bộ phận sinh dục khi tiếp xúc. Người cũng có thể bị lây gián tiếp qua môi trường (đất cát, nước, rau...) bị nhiễm xoắn khuẩn do nước tiểu súc vật thải ra. Đặc điểm chung của bệnh: có thương tổn ở gan hay thận và có biến chứng ở mắt, có thể gây sẩy thai ở động vật và người. Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải Trang 5 Bệnh phổ biến khắp thế giới, nhưng có nhiều hơn ở những vùng khí hậu nóng ẩm, đất kiềm và có nhiều mặt nước. Các bệnh lí: 1) Bệnh lí ở bò thường do L. pomona và L. grippotyphosa. Đã thấy nhiều con vật có kháng thể đặc hiệu và không phát bệnh lâm sàng. 2) Bệnh lí ở chó do L. icterohaemorrhagiae. Chuột là môi giới truyền bệnh; hoặc lây từ chó sang chó. 3) Bệnh lí ở lợn do L. pomona, và cũng do L. mitis và L. icterohaemorrhagiae. Bệnh ở lợn thường tiềm ẩn, hoặc phát dưới thể giảm nhẹ. 4) Bệnh lí ở ngựa do L. grippotyphosa, L. pomona, L. canicola. 5) Bệnh lí ở người do nhiều type như L. icterohaemorrhagiae, L. grippotyphosa, L. canicola, L. pomona gây ra (bệnh do L. pomona là tip Leptospira phổ biến ở lợn gây ra). Ổ chứa bệnh thường xuyên là các loài gậm nhấm (như chuột), chúng luôn đào thải Leptospira. Ổ chứa bệnh không thường xuyên là gia súc, trâu bò, ngựa,…. Về lâm sàng, thấy những biến loạn nặng ở màng não, ở gan, thận, và sốt cao. Leptospira vào cơ thể gây bệnh và diễn biến qua 2 giai đoạn: - Giai đoạn I: sốt cao đột ngột sau thời gian ủ bệnh 1-2 tuần, khi đó trong máu có nhiều vi khuẩn, sốt thường kéo dài từ 3 đến 8 ngày. - Giai đoạn II: sốt trở lại do các cơ quan, nhất là gan và thận bị tổn thương (biểu hiện trên lâm sàng là vàng da, xuất hiện albumin niệu); có thể có hội chứng màng não do thần kinh trung ương bị tổn thương; các mao mạch dãn (có thể xuất huyết) và đau cơ. Xoắn khuẩn nằm lại thận và được đào thải theo nước tiểu ra ngoài. Cơ chế sinh bệnh: Sau khi xâm nhiễm, Leptospira trong máu nhân lên mạnh mẽ và gây bại huyết sau đó chúng đến định vị ở những cơ quan ưa thích, nhất là gan, thận. Leptospira trong giai đoạn bại huyết có thể đến cơ quan sinh dục gây xáo trộn sinh sản. 4. Đặc điểm bệnh Leptospirosis trên động vật và người Chuột là môi giới truyền bệnh chính cho các loài động vật khác và người, đặc biệt là chuột lang. Ngoài ra có thể nhiễm do nguồn nước hoặc thức ăn. a. Bệnh Leptospirose trên chó (thường xảy ra trên chó đực) (21) Dạng cấp tính: Bại huyết phát triển nhanh sau vài giờ nhiễm, sốt cao 40-410C và suy nhược nặng. Có thể chia làm 2 thể: Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải Trang 6 - Thể thương hàn: biểu hiện xuất huyết trầm trọng viêm kết mạc mắt với nhũng điểm xuất huyết ở da và niêm mạc, ói ra máu và phân sậm màu có máu, thú bị mất nước rất nhanh và chết trong 24 ngày cùng với giảm thấp thân nhiệt, thường thấp hơn bình thường. - Thể hoàng đản : Chó bệnh có biểu hiện viêm kết mạc mắt, hoàng đản, vàng da khó thở tăng dần cùng với kém ăn, ói mửa, nếu không chữa trị trong giai đoạn cuối chó có sự tăng cao nhiệt độ khó thở, hơi thở hôi. Tiêu chảy đôi khi xuất huyết và những biểu hiện viêm não trước khi hắt hơi, thú chết trong khoảng 5-8 ngày mắc bệnh. Hình 1. Chó bị tiêu chảy ra máu Thể bán cấp tính và mãn tính: - Thể này tương ứng với sự phát triển hội chứng sinh urea huyết hậu quả của viêm thận mà một trong những biểu hiện là chứng tiểu nhiều, chứng khát nước rất nhiều cùng với ói mửa và tiêu chảy. Sau một thời gian hôn mê do urea huyết chó sẽ chết. - Thể thở khó có mùi urea ở miệng và xáo trộn hô hấp –viêm màng móng mắt, viêm cơ…. b. Bệnh lợn nghệ (24) Thể á lâm sàng: biểu hiện triệu chứng lâm sàng ít thấy nhưng khi xét nghiệm huyết thanh học thì phổ biến, có khi bị cả đàn nhất là lợn vỗ béo và lợn hậu bị. Thể cấp tính: lúc đầu lợn bỏ ăn, nằm một chỗ, sốt 40 – 40,5oC, ỉa chảy nhưng không có triệu chứng của vàng da hay đái ra máu. Sau đó xuất hiện triệu chứng điển hình nặng của vàng da, đái ra máu, xuất huyết và triệu chứng thần kinh quỵ nửa thân sau, viêm màng não, phù đầu rất nặng, tỷ lệ chết cao. Thể rối loạn sinh sản cho thấy lợn bị sẩy thai, hay chết lưu thai, tỷ lệ con sơ sinh chết cao cùng với sốt, mất sữa và vàng da ở lợn nái. Sẩy thai sau khi nhiễm vi khuẩn 4 – 7 ngày. c. Bệnh trên bò (20) Thể cấp tính: Bò thường có vẻ yếu và sốt 40 – 410C, uể oải, biếng ăn, sản lượng sữa giảm đột ngột và thường có xuất huyết dưới niêm mạc. Lông thú xù xì không bóng mượt, mắt lờ đờ, mệt. Niêm mạc, da vàng sẩm và tiểu ra huyết sắc tố. Trong vài trường hợp có viêm khớp hoặc viêm da hoại tử có khi viêm não, có thể sảy thai ở bò cái. Thể nhẹ: Sốt khoảng 39 – 400C, giảm sản lượng sữa, biếng ăn, vàng ở da, niêm mạc, nhịp tim tăng, nước tiểu màu. Ở mi mắt, môi, dưới hàm… có hiện tượng phù thủng. Con cái dễ bị xảy thai sau khi nhiễm khoảng 1 tháng. Nếu không được chăm sóc tốt thú có thể chết do hiện tượng thiếu máu. Thể mãn tính: thường xảy ra, ít thấy triệu chứng, triệu chứng hay gặp là ỉa chảy, nước tiểu vàng hay sẫm, gây sẩy thai ở thú cái hoặc đẻ con ra yếu ớt, đẻ non hoặc có thể gây không thụ thai. Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải Trang 7 Nơi chứa nhiều vi khuẩn là thận và đường sinh dục (của đực và cái). Thú bệnh thể mãn có thể thành con mang trùng suốt đời, và bài trùng qa nước tiểu, dịch âm đạo. d. Bệnh trên người Thông tư của liên bộ y tế, bộ lao động – thương binh và xã hội, tổng liên đoàn lao động Việt Nam số 29/TT-LB (25/12/1991) đã xếp bệnh do Leptospira nghề nghiệp gây ra được bảo hiểm (18). Những công việc có thể gây bệnh: - Công việc trong các hầm mỏ, hầm hào, hang hố, cống rãnh. - Công việc trong lò sát sinh, đặc biệt là những người giết, mổ súc vật... - Công việc trong các nhà máy sản xuất thịt, cá hộp, chế biến sữa và phomát. - Công việc phải tiếp xúc với súc vật như: chăn nuôi, thú y. - Công việc trong các nhà máy sản xuất bia, rượu. - Công việc trong các hàng thịt, hàng cá. - Công việc ở vùng đầm lầy, suối, ruộng, ao hồ. - Công việc trong ngành lâm nghiệp: đào mương, kênh, làm thuỷ lợi. Các nguồn lây bệnh cho người (19) Về lâm sàng, bệnh có thể chia thành 2 thể (23): Thể vàng da xuất huyết: Đây là thể nặng với các biểu hiện: sốt dao động, da sung huyết, mắt đỏ ngầu, đau cơ nặng (chủ yếu ở cơ bắp khi co bóp). Có ban xuất huyết thưa ở lưng và ngực (vào ngày thứ 6 hay thứ 7), thiếu máu huyết tán. Vàng da và niêm mạc. Một số người bị sưng đau gan. Đa số người tiểu ít hay vô niệu. Có thể có các biến chứng: viêm màng não thanh dịch, suy thận cấp, xuất huyết đường tiêu hóa hoặc hô hấp, viêm cơ tim, rối loạn ý thức , bị sảy thai... Tỷ lệ tử vong thể này cao từ 5 – 10%. Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải Trang 8 Thể không vàng da: Là thể nhẹ hơn với các biểu hiện: sốt dao động, da sung huyết, mắt đỏ ngầu, đau cơ nặng (chủ yếu ở cơ bắp chân, khi co bóp). Một số người có hạch sưng, đau, không nóng đỏ. Hội chứng vàng da và hội chứng gan không rõ. Thể này không có tử vong. 5. Phòng và chữa bệnh do Leptospira (19) Phòng bệnh: Phòng bệnh không đặc hiệu bằng cách cắt đứt dây chuyền dịch tễ như diệt chuột, phòng bệnh cho gia súc nhưng chủ yếu là phòng hộ lao động cho những đối tượng thường phải tiếp xúc với nguồn lây, các đối tượng nguy cơ như các công nhân làm việc tại các trại gia súc, công nhân vệ sinh cầu cống, làm việc trong hầm mỏ, ... Nói chung, để có được hiệu quả thì cần triển khai nhiều khâu với sự phối hợp đa ngành chức năng mới được; Phòng bệnh đặc hiệu bằng vaccin chết, song chỉ cho các đối tượng phải tiếp xúc với nguồn lây. Vấn đề phòng bệnh dựa trên nguyên tắc an toàn vệ sinh lao động bằng các biện pháp đơn giản như mang giày cổ cao khi lội ruộng, bùn sình. Mang thêm găng tay khi phải dùng đến tay để thao tác. Diệt chuột, vệ sinh sạch sẽ chất thải của các loại thú nuôi. Không được sử dụng nước hoặc tắm gội tại các vùng nghi ô nhiễm Leptospira. Chữa bệnh: Sử dụng kháng sinh đặc trị để điều trị Leptospira. Kháng sinh cần được điều trị sớm, đúng kháng sinh nhạy cảm với vi khuẩn và đúng liều lượng. II. Các kỹ thuật phát hiện Leptospira 1. Nuôi cấy Leptospira a. Quy trình thực hiện Lấy mẫu: Tuỳ theo từng thời kỳ hoặc giai đoạn bệnh mà có cách lấy bệnh phẩm và chẩn đoán thích hợp: • Giai đoạn I: lấy máu đem nuôi cấy hoặc tiêm truyền vào chuột lang, sau đó xác định và định danh vi khuẩn. • Giai đoạn II: Có thể lấy nước tiểu bệnh nhân, ly tâm, tiêm vào phúc mạc chuột lang non rồi lấy máu tim chuột nuôi cấy tìm vi khuẩn. Nuôi cấy (2, 11): • Môi trường: môi trường Ellinghausen, McCullough, Johnson, and Harris – EMJH có bổ sung 3% huyết thanh thỏ và 0.1% agarose trong một ống 5ml. Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải Trang 9 • Tiêm vào 2 ống môi trường nuôi cấy Leptospira: 1 ống nhận 2 giọt whole blood (máu không bị biến đổi ngoại trừ bổ sung chất chống đông tụ anticoagulant), còn ống 2 là 5 giọt. • Một mẫu xét nghiệm huyết thanh cho phép việc khảo sát huyết thanh học chống lại các kháng thể Leptospira. • Chú ý không làm lạnh mẫu xét nghiệm. Mẫu xét nghiệm phải được thực hiện và vận chuyển ở xung quanh nhiệt độ khoảng 130C. Giữ mẫu qua đêm ở 20C sẽ giết chết Leptospira. • Nếu môi trường nuôi cấy đã được giữ lạnh cần ủ môi trường cho tới nhiệt độ phòng trước khi sử dụng. • Mẫu xét nghiệm tránh tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng (tia cực tím có thể phá hủy các mô). b. Kết quả Một thí nghiệm nhằm tối ưu hóa việc nuôi cấy Leptospira đã sử dụng bốn loại phương pháp lấy mẫu khác nhau. Đó là: whole blood, surface plasma (huyết tương bề mặt), deposit from spun plasma và clotted blood (máu ngưng đọng lại) (2). Kết quả thí nghiệm cho bởi bảng sau (2): Kết quả cho thấy sử dụng whole blood vẫn cho tỉ lệ phát hiện cao (81.3%). Tuy nhiên, đối với Leptospira trong máu thường chỉ tồn tại 7-15 ngày nên việc lấy mẫu máu tốt nhất cho nuôi cấy là vào khoảng ngày thứ 5 khi nhiễm bệnh. Kết quả nuôi cấy Leptospira tại Leptospira Research Laboratory (26) Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải Trang 10 c. Nhận xét Ưu điểm: thường sử dụng trong công tác nghiên cứu bệnh học phòng thí nghiệm. Nhược điểm: • Mất thời gian (khoảng 20 – 30 ngày để nhận kết quả dương tính). • Độ nhạy thấp, khả năng thành công không cao khi nuôi cấy. Sau ngày nhiễm bệnh thứ 14, hiếm khi thu được khuẩn lạc. • Có thể gây nhiễm cho người thí nghiệm. • Thường không sử dụng trong xét nghiệm bệnh. 2. Kỹ thuật Microscopic agglutination test (MAT) Được mô tả bởi Galton et al. (1965) và được sửa đổi bởi Cole et al. (1973) Kỹ thuật MAT là một phép kiểm tra đã được chứng minh và chấp nhận trong việc chuẩn đoán, phát hiện kháng thể Leptospira trong huyết thanh động vật và người. Hiện nay, đây là kỹ thuật được sử dụng thông dụng nhất trong chuẩn đoán bệnh Leptospirosis. Nguyên tắc chung: Sự ngưng kết được đọc trực tiếp dưới kính hiển vi nền tối (3). a. Quy trình thực hiện (được cho bởi Cole et al – 1973)(4) • Thiết bị chuẩn độ (microtiter equipment) gồm: đĩa vi chuẩn độ (microtitration plate), đĩa truyền (transfer plates), khay đựng đĩa truyền (transfer plate holder), nắp khay đựng (transfer plate lids), đĩa đỡ (base plate), dụng cụ làm loãng mẫu độ chính xác đến 0.025 ml, 2 vật kính. • Kháng nguyên là Leptospira sống (chứa 108 Leptospires/ml) được nuôi cấy trong 4 – 8 ngày ở môi trường nuôi cấy thích hợp . Hình ảnh dụng cụ của kỹ thuật MAT (3) Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải Trang 11 Hình ảnh đĩa đỡ chứa đĩa truyền và 2 vật kính kính hiển vi (3) • Mẫu huyết thanh lấy từ gia súc được pha loãng ban đầu (1/25) với phosphate buffer saline (PBS) pH 7.2 trên đĩa vi chuẩn độ tạo thành dịch pha loãng huyết thanh. • Khoảng 25µl PBS được đặt vào từng cái giếng của đĩa và một lượng dịch pha loãng huyết thanh đồng đều nhau được cho vào hàng đầu tiên (qui ước là hàng A) của đĩa. • Dịch pha loãng huyết thanh (1/50) được pha loãng dần (2 lần) từ hàng A đến hàng H của đĩa • Sau đó, 25µl kháng nguyên sống được thêm vào mỗi giếng. • Đĩa được lắc nhẹ 15 – 20s để trộn đều các thành phần, rồi được che lại bằng nắp đậy để tránh các vật lạ và ngăn sự bay hơi. Sau đó ủ đĩa ở nhiệt độ 320C – 370C. • Kết quả đọc từ đĩa truyền một giọt từ mỗi giếng trên vật kính kính hiển vi. − Phương pháp thông dụng (Cole et al – 1973): Dịch pha loãng huyết thanh của hỗn hợp kháng nguyên/ huyết thanh ở đĩa chuẩn độ và truyền được chuyển lên vật kính bằng pipette (3). − Phương pháp cải tiến (Philip L. Carter và Terence J. Ryan – 1975): Đặt các đĩa truyền, đĩa chứa mẫu, vật kính lên đĩa đỡ. Các giọt mẫu chảy xuyên qua đĩa truyền lên 2 vật kính. Sau đó, vật kính sẽ được lấy ra khỏi đĩa đỡ, tránh làm nghiêng khiến các giọt hòa vào nhau (3). • Đọc kết quả dưới kính hiển vi (X200), khô, với tụ sáng là tối (4). b. Kết quả Kết quả dương tính khi 50% kháng nguyên hay hơn có phản ứng ngưng kết. Điểm cuối chuẩn độ xác định bởi giếng cuối cùng mà 50% kháng nguyên hay hơn có phản ứng ngưng kết quan sát thấy (4). Sự ngưng kết ở phương pháp thông thường và phương pháp cải tiến thu được là như nhau (3). Phương pháp cải tiến được đề nghị sử dụng và thay thế phương pháp thông dụng (1975) do khi sử dụng phương pháp này không có sự mất mẫu khi chảy qua các lỗ ở đĩa chuyển. Trong khi đó, sử dụng pipette thường có sự rò rỉ của mẫu vì không hút được toàn bộ dịch mẫu (3). Lý Sơn Tùng GVHD: Nguyễn Ngọc Hải Trang 12 c. Nhận xét Đây là kỹ thuật đã được sử dụng từ lâu trong việc chẩn đoán Leptospira. Nó được dụng rộng rãi trong nhiều nước (theo Thiermann và Garrett, 1983; Ellis, 1986), đặc biệt là trong các phòng thí nghiệm. Ưu điểm: • Đơn giản. • Tiết kiệm thời gian hơn so với nuôi cấy tế bào. • Thích hợp cho kiểm tra bệnh ở một nhóm hoặc đàn gia súc (ít nhất là 30 con hoặc 10% số con trong một đàn lớn) với nhiều lứa tuổi khác nhau. Nhược điểm: • Vẫn mất khá nhiều thời gian. • Cần lượng mẫu lớn. • Không phân biệt được độ chuẩn sau khi tiêm vaccin và độ chuẩn sau khi nhiễm trùng tự nhiên khi chuẩn độ là của cùng một lượng giống nhau. • Có thể cảy ra các phản ứng chéo giữa các nhóm huyết thanh giống nhau. Ví dụ: sự nhiễm trùng bởi L. balcanica (Mackintosh et al., 1981) và L. medanensis có thể tạo ra những phản ứng L. hardjo dương tính giả. 3. Kỹ thuật indirect Enzyme-Linked-Immunosorbent Serologic Assay (ELISA gián tiếp) Đây là kỹ thuật được kiến nghị thay thế cho phương pháp MAT. Ngoài chẩn đoán thông thường, nó còn có thể thực hiện các test nhanh để phát hiện Leptospira. Nguyên tắc chung (1): các kháng nguyên đã biết được gắn lên các giá thể, dung dịch mẫu chuẩn và đối chứng được cho vào các giếng, ủ trong điều kiện nhiệt độ