Đề tài Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên GP 120 của virus HIV phân type B lưu hành tại Việt Nam

Click to edit Master title style Click to edit Master text styles Second level Third level Fourth level Fifth level 5/23/2011 ‹#› KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên GP 120 của virus HIV phân type B lưu hành tại Việt Nam Người hướng dẫn : PGS.TS Đinh Duy Kháng Sinh viên : Phạm Thu Trang Tình hình HIV trên thế giới 2009 Ước tính đến năm 2011, Việt Nam có khoảng 311.500 người bị nhiễm bệnh. Tại Việt Nam tính đến ngày 31/12/2010 183.938 người 44.938 người 49.477 người Phân bố các phân type HIV-1 M theo vùng địa lý (2008) Glycoprotein gp 120 Glycoprotein vỏ gp 120 của virus HIV Phức hợp gp120-CD4-đồng thụ thể VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Plasmid mang gen gp120 của virus HIV phân type B lưu hành ở Việt Nam (mẫu số 6, Quảng Ninh) được tách dòng thành công tại Phòng Vi sinh vật học phân tử - Viện CNSH - Viện KH&CN VN. Các hóa chất, sinh phẩm và trang thiết bị tại Phòng Vi sinh vật học phân tử - Viện CNSH - Viện KH&CN VN. Phương pháp nghiên cứu Nhân bản gen mã hóa protein gp120B của virus HIV bằng phương pháp PCR. Gắn sản phẩm PCR vào vector. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E.coli. Cắt DNA bằng enzyme giới hạn. Xác định trình tự gen bằng máy giải trình tự gen tự động Biểu hiện gen trong tế bào E.coli tái tổ hợp. Tinh sạch protein tái tổ hợp bằng cột ái lực Ni2+ . Phương pháp Western Blot. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Thiết kế vector biểu hiện pET32a(+) mang gen gp120B Khuếch đại gen gp120B_EX bằng cặp mồi biểu hiện  ĐC1: Thang DNA chuẩn 1kb ĐC2: sản phẩm PCR. Tạo vector tái tổ hợp pET32a(+) mang gen gp120B_EX ĐC 1: Plasmid gốc vector pET32a(+) ĐC 2-12: DNA plasmid có khả năng mang gen gp120B_EX ĐC1: Thang DNA chuẩn 1 kb. ĐC2-6: Các dòng plasmid 3, 4, 8, 10, 12 cắt bằng BamH I và Xho I ĐC7: Đối chứng (đoạn gen gp120B_EX) Tinh sạch DNA plasmid ĐC1-3: Tương ứng với dòng plasmid tái tổ hợp số 4, 10, 12 Gen gp120B_EX trong vector biểu hiện pET32a(+) đã được giải trình tự Kiểm tra khung đọc của gen gp120B trong vector pET32a(+) Biểu hiện gen gp120B trong vi khuẩn E.coli chủng BL21 StarTM (DE3) ĐC 1: Thang Protein chuẩn ĐC 2,4: Mẫu không cảm ứng ĐC 3,5: Mẫu cảm ứng bằng IPTG 1mM Kiểm tra trạng thái tồn tại của protein gp120B tái tổ hợp M: Thang Protein chuẩn ĐC: Mẫu trước cảm ứng C: protein thu được ở pha cặn HT: Mẫu protein thu được ở pha nổi Ảnh hưởng của nồng độ IPTG ĐC M: Thang Protein chuẩn ĐC 0: Mẫu không cảm ứng ĐC 0,25; 0,5; 1: Mẫu cảm ứng bằng ITPG tương ứng nồng độ 0,25mM, 0,5mM, 1mM Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy ĐC M: Thang Protein chuẩn ĐC 0: Mẫu không cảm ứng ĐC 1, 2, 3,4: Mẫu cảm ứng với thời gian tương ứng 1h, 2h, 3h, 4h Tinh chế protein gp120B tái tổ hợp ĐC 1: Thang protein chuẩn (Fermentas) ĐC 2-8: Các phân đoạn đẩy ra khỏi cột sau khi tinh sạch ĐC 9: Dịch phá tế bào bằng siêu âm, ĐC 10: Dịch chảy qua cột Nghiên cứu khả năng phản ứng của GP120 tái tổ hợp với kháng thể kháng HIV trong huyết thanh bệnh nhân HIV bằng Western blot Hình A: Phản ứng giữa protein tái tổ hợp gp120B với huyết thanh dương tính với HIV Hình B: Phản ứng giữa protein tái tổ hợp gp120B với huyết thanh âm tính với HIV ĐC 1: Thang protein chuẩn ĐC 2: Protein tái tổ hợp GP120B ĐC 3: Protein tái tổ hợp Thioredoxin KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ I. KẾT LUẬN 1. Đã thiết kế thành công vector biểu hiện để biểu hiện gen gp120 phân type B của HIV lưu hành ở Việt Nam. 2. Đã biểu hiện thành công gen mã hóa protein gp120 ở vi khuẩn và đã tìm được điều kiện tối ưu để biểu hiện. 3. Đã tinh sạch được kháng nguyên GP120 phân type B có độ tinh sạch. Sau khi tinh sạch kháng nguyên vẫn giữ được đặc tính kháng nguyên, phản ứng đặc hiệu với kháng thể kháng HIV tự nhiên trong huyết thanh bệnh nhân HIV dương tính. II. KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu sử dụng kháng nguyên GP120 tái tổ hợp từ phân type B để chế tạo kit chẩn đoán HIV.   XIN TRÂN TRỌNG CẢM ƠN! Vòng đời của virus HIV Các phương pháp phát hiện kháng thể Áp dụng - Giám sát dịch tễ. - Chẩn đoán nhiễm HIV trên 18 tháng tuổi. Các phương pháp : - Huỳnh quang miễn dịch. - Enzyme liên kết miễn dịch: ELISA (Enzyme Linked Immunoadsorbent Asay). - Kỹ thuật ngưng kết vi lượng thụ động (Serodia). - Kỹ thuật xét nghiệm Western Blot. -Kỹ thuật RIPA (Radioimmuno precipitation assay). Những phương pháp phát hiện trực tiếp kháng nguyên Áp dụng - Phát hiện nhiễm HIV ở trẻ sơ sinh được sinh ra từ mẹ nhiễm HIV - Phát hiện sớm giai đoạn mới nhiễm HIV (giai đoạn cửa sổ) hoặc khi kết quả phát hiện kháng thể không rõ ràng. - Theo dõi diễn biến bệnh, đánh giá hiệu quả điều trị thuốc kháng virus trong các mục đích nghiên cứu khác. Các phương pháp: - Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) - Phát hiện kháng nguyên P24 của virus trong máu. Nuôi cấy từ các lympho bào để phân lập virus Nguyên lý: Tách tế bào đơn nhân trong máu bệnh nhân và nuôi cấy chung với tế bào đơn nhân của người lành đã được hoạt hóa trong môi trường nuôi cấy PHA (phytohemagglutinin) thích hợp. Xác định sự nhân lên của virus bằng kỹ thuật [5] : ELISA phát hiện kháng nguyên P24 trong nước nổi môi trường nuôi cấy tế bào. Dùng đồng vị phóng xạ phát hiện enzyme sao chép ngược của virus (RT) Phương pháp này dùng chủ yếu là để nghiên cứu, còn để chuẩn đoán thì ở giai đoạn mới nhiễm rất khó phân lập, vì khi huyết thanh có kháng thể kháng HIV thì việc phân lập được virus là rất hạn hữu. Chẩn đoán sinh học có suy giảm miễn dịch và có rối loạn miễn dịch Dấu hiệu tin cậy và trực tiếp nhất là giảm TCD4+ bình thường 450-1280/mm3; TCD8+ bình thường 258-800/mm3. Dấu hiệu gián tiếp và cũng tin cậy là tỷ lệ TCD4+/ TCD8+ giảm, bình thường là 1,4-2,2. Qui định: <400 TCD4+/mm3 tiện lượng xấu, chứng tỏ đã suy giảm miễn dịch đáng kể. < 200 TCD4/mm3 suy giảm miễn dịch nghiêm trọng, giảm lympho B, bình thường 25-280/mm3. Theo dõi kháng nguyên P24: Vừa có giá trị phát hiện sớm bệnh 50-70% (+) ở giai đoạn sơ nhiễm. Khi có hội chứng AIDS đầy đủ 50-70% (+) trở lại. Bệnh tiến triển trầm lặng thì kháng nguyên P24 giảm dần theo thời gian. Dấu hiệu gián tiếp suy giảm miễn dịch.   Những thuốc điều trị HIV hiện nay Triomune-30( or -40);Mỗi viên nén chứa: Stavudine 30 mg(or 40 mg); Lamivudine 150 mg; Nevirapine 200 mg.Cả hai stavudine và lamivudine hoạt động bằng cách chấm dứt sự tăng trưởng của các chuỗi DNA và sao chép các ức chế ngược của HIV. Nevirapine là một non-nucleoside ức chế sao chép ngược. Nó hoạt động bằng cách sao chép ngược trực tiếp ức chế. Amantadine: Tác dụng ở giai đoạn 1, tức là ức chế sự hòa nhập virus vào bên trong tế bào ký chủ. Ribavirin: Tác dụng ở giai đoạn 2, tức là ức chế virus (đặc biệt virus cúm) tổng hợp RNA của nó, từ đó ức chế sự sao chép của virus bên trong tế bào. Cũng thuộc loại này, Acyleovir ức chế sự tổng hợp DNA của virus Herpes. Zidovudine (Retrovir, còn gọi tắt AZT): Ðây là thuốc trị HIV. Cơ chế của thuốc là ức chế sự phiên mã ngược RNA thành DNA của HIV làm cho HIV ngưng phát triển, không sinh sản được. Cũng thuộc loại này còn có Didanosine, Zalcitabine, Lamivudine... Oseltamivir (Tamiflu): Thuốc có tác dụng ở giai đoạn cuối, tức là ngăn không cho virus cúm sao chép trưởng thành và phóng thích ra khỏi tế bào bằng cách ức chế men neuraminidase (chính là kháng nguyên N của lớp vỏ virus cúm). Thuốc ức chế protease: Gồm có Indinavir, Ritonavir, Saquinavir, Nelfinavir. Ðây là nhóm thuốc phối hợp với AZT để trị HIV. Cơ chế của thuốc ức chế protease là làm cho men phân giải đạm của HIV không hoạt động được, để nó không nhân lên nhiều HIV mới. Gamma globulin và Interferon: Ðây chính là các chất sinh học do cơ thể sản xuất ra để chống lại virus. Gamma globulin ngăn virus xâm nhập vào tế bào vì có chứa kháng thể chống lại kháng nguyên bề mặt nằm trên lớp vỏ của virus. Còn Interferon kháng virus bằng cách ngăn cản virus tổng hợp protein, RNA hoặc DNA của nó trong tế bào. Human immune deficiency virus – HIV Là 1 retrovirus; thuộc họ retroviridae. Thuộc nhóm Lentivirus. Sơ đồ phân type virus HIV Hình dạng và cấu trúc virus HIV Cấu trúc genome của virus HIV-1 Glycoprotein vỏ gp 120 của virus HIV