Đề tài Nghiên cứu công nghệ sinh tổng hợp Enzym Glucose Oxidaza (GOD) và ứng dụng trong công nghiệp chế biến một số sản phẩm từ quản nhằm đảm bảo ổn định chất lượng chống biến màu, hạn chế mất mùi sản phẩm

BỘ CÔNG THƯƠNG VIỆN CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI CẤP BỘ NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SINH TỔNG HỢP ENZYM GLUCOSE OXIDAZA (GOD) VÀ ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP CHẾ BIẾN MỘT SỐ SẢN PHẨM TỪ QUẢ NHẰM ĐẢM BẢO ỔN ĐỊNH CHẤT LƯỢNG CHỐNG BIẾN MÀU, HẠN CHẾ MẤT MÙI SẢN PHẨM Chủ nhiệm đề tài: THS. TRẦN THỊ CHÂU 7860 08/4/2010 HÀ NỘI – 2010 1 MỞ ĐẦU Glucooxydaza (GOD) – một trong những enzym oxy hóa khử, được sử dụng khá rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm và chuẩn đoán trong y học. Chúng xúc tác một cách đặc hiệu cho phản ứng giữa glucoza với oxy. Glucoza bị oxi hóa thành axit gluconic và oxy được tiêu thụ. Vì thế, GOD có thể được ứng dụng để lọai bỏ oxy và để định tính và định lượng glucoza. Enzym GOD còn được gọi là β-D-glucose:oxygen 1-oxidoreductase hay EC 1.1.3.4. Trong tự nhiên enzym GOD được tìm thấy trong các mô động vật, thận, gan trong canh trường của nấm mốc, nhất là các loài A. niger, P. amagasakiense, P. chrysogenum, P. vitale, P. notatum và một số loài Penicillium khác [1]; [12]; [30]. Enzym GOD được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như: Công nghiệp thực phẩm, trong y học và trong phân tích. Trong công nghiệp thực phẩm GOD được sử dụng như một chất bảo quản không độc, có nguồn gốc tự nhiên và an toàn (để loại bỏ glucoza và oxy khỏi thực phẩm và đồ uống) như: Bảo quản dịch ép các loại quả nhiệt đới, bảo quản rượu vang. Đồng thời, enzym GOD còn được dùng để loại bỏ glucoza khỏi lòng trắng trứng trước khi sấy khô làm nguyên liệu để sản xuất bánh ngọt [64]; [65];[66];[70]. Trong y học GOD được sử dụng để xác định hàm lượng glucoza trong dịch của cơ thể (xác định hàm lượng glucoza trong máu hoặc nước tiểu của các bệnh nhân tiểu đường). Ngoài ra enzym GOD còn được dùng để đánh dấu các kháng thể và để phát hiện các kháng thể đánh dấu của khối u và các kháng thể của virut. Trong phân tích, enzym GOD được sử dụng rộng rãi để sản xuất các KIT thử sinh học nhằm xác định hàm lượng glucoza có trong mẫu [9]; [88];[90]. GOD có thể được tổng hợp bằng phương pháp lên men chìm từ nguồn cacbon là glucoza, saccaroza, tinh bột và một số chất dinh dưỡng với sự có mặt của oxy bởi các chủng nấm mốc hoặc nấm men [1]; [11];[13]. Ở Việt nam, cho đến nay chưa có công trình nghiên cứu về GOD nào được công bố. Do vậy, việc nghiên cứu sinh tổng hợp enzym GOD ứng dụng trong bảo quản các sản phẩm thực phẩm sẽ rất có ý nghĩa, nó mở ra một triển vọng mới trong việc thay thế các chất bảo quản có nguồn gốc hóa học, góp phần nâng cao chất lượng thực phẩm, đảm bảo vệ sinh an toàn cho người tiêu dùng. Mục đích của nghiên cứu. Quá trình sinh tổng hợp GOD bằng chủng A. niger sẽ được nghiên cứu ở ba mức độ khác nhau: Nuôi lắc trong bình tam giác, trong bình lên men 5 lít và qui mô pilot. Nghiên cứu tập trung vào những nhiệm vụ sau: 2 1. Lựa chọn chủng giống - Lựa chọn chủng giống A. niger. - Nghiên cứu đặc điểm hình thái. - Kiểm tra độ an toàn của chủng giống (dựa trên kết quả kiểm tra độc tố aflatoxin B1,B2,G1,G2). - Định tên chủng giống chọn lựa 2. Nghiên cứu điều kiện sinh tổng hợp enzym GOD - Xác định ảnh hưởng của các ion kim loại đến quá trình sinh tổng hợp enzym (Sắt, đồng, kẽm, mangan, coban v.v). - Xác định thành phần môi trường sinh tổng hợp enzym (các bon, nitơ, khoáng, chất có hoạt tính bề mặt tween 80, EDTA v.v.) - Xác định điều kiện nuôi cấy để sinh tổng hợp enzym GOD (pH, nhiệt độ, tốc độ đảo trộn môi trường v.v). - Nghiên cứu động học của quá trình sinh tổng hợp GOD. - Sản xuất thử nghiệm enzim GOD quy mô xưởng thực nghiệm 3. Thu nhận, tinh sạch enzym và xác định đặc tính của chế phẩm - Lựa chọn phương pháp phá vỡ tế bào - Thu nhận và tinh sạch enzym. - Nghiên cứu đặc tính của enzym GOD sinh tổng hợp được 4. Nghiên cứu đặc tính sinh hóa và độ an toàn của chế phẩm enzym 5. Nghiên cứu xác định các điều kiện thích hợp trong quá trình sử dụng enzym GOD trong chế biến quả quy mô phòng thí nghiệm và xưởng thực nghiệm (nước quả và rượu vang) 6. Nghiên cứu áp dụng thử nghiệm GOD trong công nghiệp chế biến nước quả và rượu vang 3 CHƯƠNG I TỔNG QUAN I. GIỚI THIỆU VỀ ENZYM GOD I.1 Lịch sử phát hiện enzym GOD Enzym GOD (GOD) là một enzym chống oxi hóa được sinh tổng hợp từ những năm 1950. Năm 1904, Maximow đã phát hiện ra một hệ thống enzym tiêu thụ oxy trong dịch chiết nấm mốc. Năm 1926, D.Mueller đã xác định lại hệ thống này và ông ta đặt tên cho enzym này là glonga oxidaza. GOD được chiết tách lần đầu tiên từ hệ sợi nấm mốc Aspergillus niger và Penicillium glaucum do nhà khoa học Muller (năm 1928). Kể từ sau lần đầu được phát hiện và tách chiết nhiều nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu enzym GOD. Năm 1946, Keilin và Haitree chứng minh rằng GOD là một flavinprotein với một nhóm ngoại (prosthetic) FAD và có đặc tính kháng khuẩn “antibiotic" (do tạo thành hydro peroxit H2O2) [9]. Tiếp theo là báo cáo của Keston năm 1956 về cặp phản ứng giữa GOD, peroxidaza và một chất tạo mầu. Trên nguyên tắc này “que nhúng” định lượng glucoza đã xuất hiện để xác định hàm lượng glucoza trong nước tiểu. Cũng trong năm 1956, dựa trên bài báo của Teller, Worthington lần đầu tiên đã đưa ra hệ thống enzym định lượng để xác định hàm lượng glucoza bằng phương pháp so mầu. Các chủng nấm mốc Aspergillus niger, Penicillium glaucum và nấm men Saccharomyces cerevisiae là nguồn vi sinh vật có khả năng sản xuất ra GOD tốt nhất. Enzym GOD thu được dưới dạng enzym nội bào (Aspergillus niger, Saccharomyces cerevisiae) hay ngoại bào (Penicillium glaucum) được làm sạch với các mức độ khác nhau, tùy theo mục đích sử dụng. Enzym GOD tinh sạch đã loại bỏ các polysaccharit tạp này đã được giới thiệu cho mục đích bảo quản thực phẩm, y học chuẩn đoán và phân tích. I. 2. Cấu tạo của enzym GOD Cũng giống như mọi enzym khác GOD có bản chất là protein.. GOD là một protein có cấu trúc đối xứng, gồm hai monomer giống nhau có trọng lượng phân tử vào khoảng 80,000 daltons, liên kết đồng hóa trị với nhau nhờ các cầu nối disulfit. 4 Trọng lượng phân tử của enzym GOD khoảng 160.000 dalton. Kích thước phân tử của GOD thu nhận từ các nguồn khác nhau là khác nhau (khối lượng phân tử GOD thu được từ Aspergillus niger là 186.000 Da. từ Penicillium notatum là 152.000 Da) [39]. Để có thể làm việc như một chất xúc tác, mỗi một monomer của GOD cần một nhân tố phụ trợ là FAD (flavin adenine dinucleotide). Trong phản ứng oxy hóa khử do enzym GOD xúc tác, FAD đóng vai trò như chất nhận điện tử ban đầu và khử thành FADH2 sau đó FADH2 được oxy hóa bởi chất nhận điện tử cuối cùng là một phân tử oxy (O2) vì oxy có thế oxy hóa khử cao hơn. Sau đó oxy được khử thành hydro peroxit (H2O2). FAD được gắn với protein bởi liên kết không đồng hóa trị và có thể bị giải phóng khỏi cấu trúc protein khi bị biến tính. Enzym GOD được gắn với 16% (w/w) hydratcacbon. 80% (w/w) hydratcacbon là mannoza. Đường mannoza có thành phần nitơ và oxy liên kết với các axit amin: Arginin, threonin và serin. Mạch hydratcacbon trong phân tử GOD không tham gia vai trò xúc tác của phản ứng enzym và cấu tạo của nó cho tới nay vẫn chưa được xác định rõ ràng [23]. Enzym GOD được sinh tổng hợp từ A. niger có cấu tạo bởi 583 axit amin. Enzym GOD có tính đặc hiệu rất cao. Một thay đổi nhỏ trong cấu trúc đã có tác động lớn tới hoạt lực oxy hoá của enzym. Gốc glucoza trong phân tử của enzym ở dạng β- D- glucoza có hoạt tính oxy hoá mạnh hơn α- D- glucoza 157 lần [39]. Hình 1.1. Cấu trúc không gian ba chiều của GOD Hình 1.2. Cấu trúc tiểu đơn vị của GOD (mầu đỏ là FAD) 5 I.3. Tính chất của enzym GOD [8];[39];[92] ¾ Tính chất vật lý - Phân tử protein tan dễ dàng trong dung dịch potassium phosphate 0.1M, pH 7.0 cho dung dịch mầu vàng, trong suốt. Hệ số phân li của dung dịch GOD 1% (w/v) ở bước sóng 280 nm là 13.8. - Enzym thể hiện mức độ chuyên hóa rất cao đối với β-D glucoza mặc dầu 2- deoxy-D-glucoza, D-mannoza và D-fructoza cũng bị oxy hóa. - Protein của bản thân enzym là có tính axit và có điểm đẳng điện (pI) là 4.2. ¾ pH tối ưu - pH của môi trường ảnh hưởng rõ rệt đến phản ứng enzym vì nó ảnh hưởng đến mức độ ion hoá cơ chất, enzym và độ bền của protein enzym. Đa số các enzym đều bền trong giới hạn pH từ 5- 9. Độ bền của enzym đối với môi trường cũng có thể tăng lên khi có cơ chất coenzym và ion Ca++. - pH tối thích (pHopt) cho hoạt động của GOD thu được từ các nguồn khác nhau là khác nhau. Giá trị pH không cố định mà phụ thuộc vào nhiều yếu tố như cơ chất, tính chất dung dịch đệm, nhiệt độ v.v. pH thích hợp cho hoạt động của GOD vi sinh vật trong khoảng 4 –7, tối ưu nhất là 5.6. ¾ Tính đặc hiệu Enzym có đặc tính chuyên hóa cao đối với β-D-glucoza. Với đồng phân α -D- glucoza enzym không có tác dụng. Với các cơ chất như 2-deoxy-D-glucoza, D- mannoza và D-galactoza enzym GOD thể hiện hoạt tính rất thấp. ¾ Các chất ức chế - Ức chế bởi: D- arabinoza và 2- deoxy-D-glucoza. - Ức chế hoàn toàn bởi: ρ- cloromercuribenzoat. - Ức chế một phần bởi: 8- hydroxycholin, semicarbazit - Bị mất hoạt lực bởi: H2O2 - CO, HCN, NaF không ảnh hưởng đến hoạt tính của enzym. ¾ Các chất kìm hãm Các ion kim loại Ag+, Hg2+, Cu2+ có ảnh hưởng kìm hãm đến hoạt tính enzym GOD. Sự gắn kết của FAD bị kìm hãm bởi một vài nucleotit. 6 ¾ Điều kiện bảo quản Enzym GOD dạng khô là ổn định trong nhiều năm khi bảo quản ở chỗ mát. Các dạng dung dịch tính ổn định phụ thuộc nhiều vào các điều kiện bảo quản. I.4. Cơ chế hoạt động cña enzym GOD [77] Enzym GOD (còn gọi là β-D-glucose:oxygen 1-oxidoreductase, EC 1.1.3.4) là một enzym oxi hóa khử β-D glucoza bị oxi hóa thành axit gluconic và oxi bị tiêu thụ. GOD Phản ứng tổng quát: C6H12O6 + ½ O2 C6H12O7 Trước tiên, β-D-glucoza bị loại nước thành D-glucono-1,5-lacton và FAD bị khử thành dạng FAD khử. Sau đó D-glucono-1,5-lacton bị kết hợp với nước tạo thành axit gluconic và FAD khử phản ứng với oxy tạo thành hydro peroxit (H2O2). Nếu có mặt enzym catalaza hydro peroxit (H2O2) sẽ bị phân hủy thành nước và oxy. Phương trình phản ứng như sau: GOD C6H12O6 + FAD C6H10O6 + FAD~H2 gluconolacton +O2 +H2O C6H12O7 H2O2 H2O + ½ O2 + FAD Sự tạo thành axit gluconic làm giảm pH môi trường nên trong quá trình phản ứng đồng thời phải bổ sung kiềm để điều chỉnh pH. Theo cơ chế hoạt động xúc tác của của enzym GOD, quá trình oxy hoá glucoza luôn có sự hình thành H2O2 chính sản phẩm phụ này lại ức chế ngược hoạt động của enzym GOD. Hoạt lực của enzym GOD luôn biểu hiện giảm mạnh sau 5 giờ phản ứng. Các kết quả đều cho thấy hoạt lực của GOD giảm tỷ lệ nghịch với sự tăng của nồng độ H2O2 [45]. 7 I. 5. Chỉ tiêu chất lượng của một số chế phẩm GOD [8]. ¾ Hoạt tính riêng Dựa vào hoạt tính riêng của GOD mà chia enzym này thành 4 loại: - Loại I khoảng 210 U/mg - Loại II khoảng 70 U/mg - Loại III khoảng 20 U/mg - Loại IV khoảng 1.5 U/mg ¾ Mức độ tinh sạch - Loại I: amylaza, sacaroza – mỗi loại < 0.01%, catalaza <10U/mg - Loại II: amylaza, sacaroza – mỗi loại < 0.1%, catalaza < 250 U/mg - Loại III: amylaza, sacaroza – mỗi loại < 0.1%, catalaza < 260 U/mg ¾ Dạng chế phẩm GOD có sẵn - Loại I và II dạng dung dịch. - Loại III và IV dạng bột khô. ¾ Độ bền GOD được bảo quản ở 40C, không bị giảm hoạt tính trong vòng 12 tháng. II. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ SẢN XUẤT GOD TRONG NƯỚC VÀ TRÊN THẾ GIỚI GOD được tìm thấy trong các mô động vật, thận, gan trong canh trường nuôi cấy nấm mốc, nhất là các loài Aspergillus niger, P. amagasakiens, P. chrysogenum, P. vitale. P. notatum, P. glaucum, P. purpurogennum và P. variabile [1]; [12]; [30]. GOD sinh tổng hợp từ các vi sinh vật nói trên đã được nghiên cứu kỹ ở các nước như: Liên Xô, Tiệp Khắc, Mỹ và Nhật. Trên thị trường đã có một số chế phẩm enzym GOD được lưu hành với những tên thương phẩm như Oxidoredutaza 1.1.3.4 (Liên Xô). GluzymeTM BG của hãng Ecozym (Hungary), Glucose oxidase của hãng Calzyme (Mỹ) hay Novarom của hãng Novozyme (Đan Mạch) [9]; [70] . Kreston (1956) đã sản xuất que thử glucoza để xác định glucoza niệu. Worthington (1956) lần đầu tiên đã đưa ra phương pháp định lượng glucoza dựa trên phản ứng màu của enzym. Ông đã sử dụng enzym GOD dạng thô tách chiết từ Aspergillus niger. Tuy nhiên. phương pháp này có độ sai số cao do enzym GOD có lẫn 8 các enzym khác như amylaza, maltaza, saccharaza. Williams và cộng sự (1976), Auses và cộng sự (1975) đã tiến hành xác định hàm lượng glucoza bằng enzym GOD đã được tinh sạch với sự có mặt H2O2 và chất chỉ thị màu luminol. Greenfeld và cộng sự (1975), Lahoda và cộng sự (1975) đã sử dụng enzym GOD cố định trong chuẩn đoán bệnh tiểu đường. Năm 1997, enzym GOD đã được Janser sử dụng để bảo quản dịch ép các loại quả nhiệt đới. Pickering (2000) đã sử dụng GOD trong bảo quản rượu vang [64]; [65];[66];[70]. Chính vì tính chất ưu việt của GOD mà các công trình nghiên cứu về enzym này vẫn được tiếp tục công bố. Akulova và cộng sự (1978) đã nghiên cứu động học của quá trình sinh tổng hợp và tính ổn định của enzym GOD từ chủng Penicillium vitale. Li (1996) đã nghiên cứu nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp GOD từ chủng Streptomyces sp. Năm 2001, các tác giả Kapat, A., Jung, J.K., Park, Y.H đã nghiên cứu nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp GOD từ chủng Saccharomyces cerevisiae tái tổ hợp. Cùng thời gian này Rinas và cộng sự đã sản xuất GOD từ chủng Aspergillus niger tái tổ hợp và sử dụng các nguồn cacbon không phải glucoza. Gần đây có nhiều công trình công bố điều kiện nuôi cấy tối ưu cho sinh tổng hợp GOD, sinh tổng hợp catalaza (CAT) và kích thích sinh tổng hợp cả hai enzym.[34], [39], [69];[71]. Năm 2003, Hafiz và cộng sự đã tiến hành tối ưu hoá các thông số khác nhau của quá trình sản xuất GOD trên môi trường tinh bột sử dụng chủng Aspergillus niger [36]. Rhinas và cộng sự (2001) đã nghiên cứu ảnh hưởng của sự thông khí đến hình thái sợi nấm, sự tạo thành viên và sự sản xuất enzym GOD của chủng tái tổ hợp Aspergillus niger. Theo tác giả này, trong nuôi cấy chìm khi tốc độ thông khí tăng từ 200 – 800 v/p, hình thái sinh trưởng của A. niger thay đổi từ hạt kích thước lớn (đường kính trung bình 1500 µm) đến hạt kích thước nhỏ. Có một sự tương quan giữa cường độ thông khí với hình thái sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym GOD. Khả năng tổng hợp enzym tăng lên khi thay đổi hình thái sinh trưởng từ dạng viên đến dạng sợi mảnh. Tuy nhiên, dạng sợi mảnh có sức căng bề mặt lớn hơn, cần thông khí mạnh hơn và lượng sinh khối thu được ít hơn [63];[69]. Cho đến nay, ở Việt Nam chưa có công trình nghiên cứu nào về GOD được công bố. 9 II.1. Chủng vi sinh vật trong sản xuất enzym GOD Chủng giống là điều kiện tiên quyết quan trọng nhất trong sản xuất enzym công nghiệp bằng kỹ thuật lên men. Việc lựa chọn chủng giống đang ngày càng đóng vai trò quan trọng trong sản xuất enzym. Một chủng giống tốt không chỉ giúp tăng sản lượng của sản xuất enzym, tăng tốc độ sử dụng nguyên liệu thô mà còn liên quan đến tính đa dạng của các enzym, rút ngắn quá trình sản xuất, cải thiện quá trình lên men và tách chiết. Nấm sợi là vi sinh vật hoại sinh điển hình, chúng tiết ra một loạt các enzym tham gia vào việc phân hủy các polyme sinh học của các mô động vật và thực vật. Đại bộ phận các enzym này là enzym thủy phân và đóng vai trò quan trọng trong dinh dưỡng của nấm mốc, giải phóng cacbon và nitơ liên kết trong các đại phân tử để cung cấp dinh dưỡng cho nấm mốc. Điều này làm cho nấm sợi như là vật chủ để sản xuất các enzym [12]. Khả năng của nấm sợi trong việc bài tiết protein ở mức cao là một trong những đặc điểm then chốt trong việc xem xét chúng như là vật chủ giàu tiềm năng để sản xuất các protein tái tổ hợp có giá trị cao dùng trong y học [23]. Khả năng sinh tổng hợp GOD được phát hiện ở nhiều chủng nấm mốc như Penicilium (P. notatum, P. chrysogenum, P. .vitale), Aspergillus (A. niger), nấm men (Saccharomyces sp) và vi khuẩn (Streptomyces sp) [71]. Tuy nhiên, enzym GOD được sản xuất chủ yếu từ các chủng A. niger, P. notatum, P. glaucum, P. amagasakiense, P. purpurogenum, P. variablile và Alternaria alternate [30]. Trong một vài năm gần đây, nhiều công trình nghiên cứu về khả năng sinh hợp GOD của chủng nấm mốc A.niger đã được công bố. Trong số các chủng nấm mốc được sử dụng để sản xuất enzym qui mô công nghiệp thì chủng Aspergillus niger là được sử dụng nhiều hơn cả nhờ sự đa dạng về trao đổi chất của chủng này. Việc sử dụng chủng A. niger để sinh tổng hợp enzym GOD có những ưu điểm sau [30]: • A. niger có thể tạo ra các enzym nhất định với với số lượng vài kg/1 m3 ở điều kiện thích hợp. • A. niger có lịch sử lâu đời về ứng dụng trong công nghiệp lên men và nhìn chung chúng được coi là an toàn. 10 • Các ngành công nghiệp lên men là tương tự nhau về các điều kiện cần thiết để cực đại hóa việc sản xuất các protein đồng hình của Aspergillus. Vì vậy, nó cung cấp điểm khởi đầu tốt nhất để nhận biết các ảnh hưởng hóa lý đối với việc sản xuất và bài tiết các protein dị hình khi dùng một chủng tương tự. • Các loài Aspergillus là các nhà máy bài tiết protein hiệu quả, với số lượng cao gấp nhiều lần so với trong tự nhiên. Chúng không có khuynh hướng tích lũy một số lượng lớn protein nội bào dưới dạng cấu trúc cơ thể như vi khuẩn và nấm men. • Aspergillus là một hệ thống sản xuất hữu ích các protein dị hình nhận được từ các nấm sợi khác. • Tính ổn định của các biến đổi di truyền là khá cao vì vậy, mối đe dọa của sự lại giống hầu như không được nhắc tới. II. 2. Định tên chủng nấm mốc Aspergillus niger là một trong những loài nấm mốc được nghiên cứu nhiều nhất. Tuy nhiên, các cơ sở để phân loại chúng là chưa thật chắc chắn. Thông thường tên A. niger có thể được sử dụng cho bất kỳ thành viên nào thuộc nhóm này bởi vì chúng rất khó phân biệt. Các đặc điểm về hình thái của chúng là rất giống nhau và rất khó phân biệt các loài trong cùng một nhóm A. niger [16]. Theo Al-Musallam (1981) và Samson (2004) thuộc nhóm A. niger gồm có 8 loài: A. niger, A. tubingensis, A. foedidus, A. piperis, A. brasiliensis, A. vadensis, A. costaricensis và A. lacticoffeatus. Cho đến năm 1991 bằng kỹ thuật gen dựa trên kết quả đọc trình tự các đoạn gen ITS, β-tubilin, calmodulin, IGS và cox1 đã cho phép phân biệt chính xác hơn các loài trong nhóm A. niger [46]. Theo Varga và cộng sự, 1993; 1994; Accensi và cộng sự, 1999; 2001, nếu chỉ dựa trên phương pháp phân loại nấm mốc cổ điển, không thể phân biệt được đã phân biệt được A. tubingensis và A. niger. Hai loài này có độ tương đồng về hình thái rất cao và A. tubingensis được xem như là loài phụ của A. niger. Việc sử dụng các phương pháp phân tử cho phép phân biệt chính xác hơn các loài trong nhóm A. niger và đã phân loại được A. niger và A. tubingensis là hai loài riêng biệt [16]; [83]; [84]. Sự phân biệt chính xác A. niger và A. tubingensis là rất có ý nghĩa bởi vì A. niger được công bố 11 là có sinh độc tố ochratoxin A (OA) trên hạt cafe, trong khi A. tubingensis là loài không sinh độc tố vi nấm này [16]. II.3. Độc tố nấm mốc [3];[4]; [7]; [14];[17] Một số chủng nấm mốc thuộc nhóm Aspergillus trong quá trình sinh trưởng ở điều kiện nuôi cấy nhất định có sinh ra độc tố vi nấm. Trong số các độc tố do nấm mốc sinh ra thì aflatoxin là độc tố gây nguy hiểm nhất, nó ảnh hưởng xấu tới gan và là nguyên nhân gây xơ gan và ung thư gan. Chỉ với một hàm lượng rất nhỏ (10 mg) mà con người ăn phải cũng có thể gây tử vong. Bảng 1. 1. Các loài thuộc chi nấm cúc Aspergillus và các độc tố nấm TT Loài nấm Độc tố nâm mốc 1 A. amstelodami catenarin, entocroxin 2 A. avenaceus x 3 A. elavatus aflatoxin (k), patulin (k), ascladiol 4 A. candidus x 5 A. carneus x 6 A. claviforme x 7 A. flavus aflatoxin (k), axit koji, axit nitro-propionic, tremorgen, aspertoxin, metylste