Đề tài Nghiên cứu khả năng tái sinh cây in vitro của một số giống đậu tương

PHẦN MỘT: MỞ ĐẦU I.1. Đặt vấn đề Cây Đậu Tương (Glycine max(L)Merrill) đã được biết đến và trồng từ rất lâu đời. Năm 1994 diện tích đậu tương trên thế giới khoảng 61571000 ha với năng suất bình quân đạt 2078 kg/ha. Sản lượng đạt trên 10 triệu tấn/năm. Điều đó khẳng định cây đậu tương là một trong những cây trồng quan trọng trong nền nông nghiệp.[2] Đậu tương hay đỗ tương, đậu nành là loại cây họ Ðậu (Fabaceae), đặc điểm của hạt đậu tương chứa hàm lượng protein cao, giầu giá dinh dưỡng chính vì vậy là cây thực phẩm có vai trò quan trọng cho con người và gia súc. Từ hạt đậu tương có thể chế biến được nhiều các sản phẩm khác nhau như: sản xuất dầu thực vật, sản xuất dầu ăn, đậu phụ, tào phớ, sữa đậu nành,… là những sản phẩm công nghiệp được chế biến từ đậu tương rất có lợi cho sức khoẻ con người, góp phần chống suy dinh dưỡngvà các bệnh thần kinh, tim mạch. Ngoài việc cung cấp 40-50% lượng protein thì trong hạt đậu tương có chứa hàm lượng lớn lipit cụ thể là 12-24%. Bên cạnh đó, do có khả năng cố định đạm tự do nhờ cộng sinh với vi khuẩn Rhizobium Japonicum mà đậu tương là cây trồng bảo vệ đất chống xói mòn. Cuối cùng cây đậu tương còn góp phần giải quyết công ăn việc làm, tăng thu nhập cho người nông dân [2]. Nền nông nghiệp nước ta đã phát triển cùng với nền văn minh lúa nước, tất nhiên không vì thế mà cây đậu tương mất đi chỗ đứng của nó. Đậu tương nằm trong những cây trồng quan trọng và việc phát triển đậu tương cũng đã được chú trọng. Tuy nhiên, năng suất của cây đậu tương thường rất thấp bởi đang bị ảnh hưởng của hạn hán và dịch bệnh. Tình trạng thiếu nước ảnh hưởng xấu tới sự sinh trưởng và năng suất của cây đậu tương. Bên cạnh đó còn có sự phá hoại của năm loại dịch bệnh phổ biến tấn công đậu tương, đó là bệnh: nấm, thối thân, hội chứng đột tử, tàn lụi vi khuẩn, đốm lá [1, 3]. Các loại bệnh hại này và hạn hán đã gây tổn thất không nhỏ đối với năng suất đậu tương. Nếu sử dụng thuốc trừ sâu hoá học thì chi phí sản xuất cao và gây ảnh hưởng đến môi trường. Rõ ràng, đậu tương là cây thực phẩm thiết yếu, nhưng năng suất của các giống đậu tương hiện nay lại đang bị ảnh hưởng bởi hạn hán và sâu bệnh hại. Chính vì lẽ đó cần có biện pháp cải tạo các giống hiện nay nhằm đem lại hiệu quả cao trong nông nghiệp. Với sự phát triển mạnh mẽ của khoa học, đặc biệt trong lĩnh vực công nghệ sinh học thì có lẽ phương pháp chuyển gene là lựa chọn tối ưu và phù hợp với tình hình hiện nay. Có nhiều phương pháp chuyển gene vào thực vật, trong đó phương pháp chuyển gene thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens vào mô in vitro nhằm tạo cây trồng biến đổi gene đem lại tỷ lệ thành công cao nhất. Tuy nhiên, đậu tương (glycine max L) là cây rất khó tái sinh trong nuôi cấy invitro, đặc biệt là việc tái sinh các callus có nguồn gốc từ chồi, lá mầm và phôi… Đã có nhiều nghiên cứu về việc tái sinh đậu tương thông qua các cơ quan như: lá mầm, mắt lá thật đầu tiên (Barwale và Cs 1986, Kim và Cs 1990), lá thật đầu tiên của cây non (Wright và Cs 1987), phôi soma (Lazzeri và Cs 1985, Rouch và Cs, 1985) [3]… Để phục vụ cho công tác nhân invitro và bảo tồn nguồn gen đặc biệt là chọn giống thông qua chuyển gen, tạo ra giống mới có khả năng kháng sâu, kháng thuốc trừ cỏ… Chúng tôi đã tiến hành đề tài “Nghiên cứu khả năng tái sinh cây in vitro của một số giống đậu tương”. I.2. Mục đích, ý nghĩa, yêu cầu I.2.1. Mục đích Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống đậu tương bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro với 2 công đoạn chính: nuôi cấy, tái sinh cây để phục vụ các nghiên cứu về chuyển gen, nhân giống, bảo tồn in vitro… I.2.2. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn - Ý nghĩa khoa học: Đề tài nghiên cứu nhằm tìm ra các môi trường phù hợp để tái sinh cây đậu tương in vitro nuôi cấy mô một số giống đậu tương. Từ đó xây dựng được quy trình nuôi cấy mô cây đậu tương từ đỉnh sinh trưởng của hai giống đậu tương DT84 và DT2001. - Ý nghĩa thực tiễn: Tạo cây đậu tương nuôi cấy mô thành công sẽ ứng dụng trong việc nhân giống đậu tương sạch bệnh và tạo cây đậu tương biến đổi gen, góp phần vào sự phát triển của nền Nông nghiệp bền vững. I.2.3. Yêu cầu (1) Xác định quy trình khử trùng mẫu để tạo mẫu sạch và môi trường nuôi cấy thích hợp. (2) Xác định nồng độ của BAP lên khả năng tạo thể protocorm ở mỗi giống là cao nhất. (3) Xác định nồng độ của Zeatin lên khả năng tái sinh chồi từ thể protocorm của hai giống là lớn nhất. I.3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu I.3.1. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là các giống đậu tương DT84, DT2001 I.3.2. Phạm vi nghiên cứu * Địa điểm: Bộ môn Kỹ thuật Di truyền – Viện Di truyền Nông nghiệp (Km 2 Đường Phạm Văn Đồng, Từ Liêm, Hà Nội) * Thời gian: từ 23/2/2011 đến 22/5/2011. * Điều kiện nghiên cứu: - Phòng nuôi cấy: . Nhiệt độ: 250C. . Cường độ ánh sáng 2000 lux - Thời gian chiếu sáng: 10giờ/ ngày. - Các dụng cụ, buồng cấy được khử trùng bằng cồn và nhiệt. * Các hóa chất dùng để pha môi trường nuôi cấy. - Các muối khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin B5, phytagel, MES, các chất điều hòa sinh trưởng: BAP, Zeatin, GA3, Glutamin, Asparagin. Nguồn cacbon: Đường saccaroza. PHẦN HAI: TỔNG QUAN TÀI LIỆU II.1. Lịch sử phát triển, cơ sở khoa học và kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật II.1.1. Khái niệm về nuôi cấy mô tế bào thực vật Nuôi cấy mô thực vật (hay còn gọi là nuôi cấy thực vật in vitro) là quá trình nhân giống vô tính thực vật trong ống nghiệm. Nuôi cấy mô thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các kỹ thuật nuôi cấy các bộ phận khác nhau (tế bào, mô, cơ quan) thực vật trong môi trường nhân tạo dưới điều kiện vô trùng (15, 22, 29).. II.1.2. Giới thiệu về nuôi cấy mô tế bào thực vật II.1.2.1. Lịch sử phát triển nuôi cấy mô tế bào thực vật. Năm 1965, Robert Hooke quan sát trên kính hiển vi lát cát của miếng lạc thấy phần mô thực vật được cấu tạo bởi nhiều tập hợp và đưa ra khái niệm “tế bào – cell”. Anten Vanleuwen Hock (1632 – 1723) thiết kế kính hiển vi khuếch đại được 270 lần, lần đầu đưa vào quan sát thấy vi khuẩn, tế bào dịch người hay động vật. Năm 1965, phát hiện thấy tế bào động vật gồm nhiều tế bào động Năm 1838 - 1839 Natthias Schleiden và Theodore Schwann đề xướng học thuyết cơ bản của sinh học gọi là học thuyết tế bào, khẳng định: + Mọi cơ thể sống được cấu tạo bởi 1 hoặc nhiều tế bào. + Tế bào là đơn vị cấu trúc và chức năng cơ bản của cơ thể sống, là hình thức nhỏ nhất của sự sống. + Tế bào chỉ được cấu tạo ra từ tế bào tồn tại trước đó (và mang đầy đủ thông tin di truyền từ tế bào sinh ra nó). Năm 1875 Oscar Hertw’g bằng quan sát trên kính hiển vi cho rằng sự thụ thai là sự hợp nhất tinh trùng và trứng. Sau đó Hermann P, Butschili và Schneider FA đã mô tả chính xác quá trình phân chia tế bào Năm 1902, Haberlandt là người đầu tiên đưa các giả thu.yết về tính toàn thế của tế bào vào thực nghiệm. Theo ông, tất cả tế bào thực vật có tính toàn năng, mỗi tế bào đều mang một lượng thông tin di truyền đầy đủ của cơ thể và gặp điều kiện thuận lợi thì có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Năm 1922, Kotte người Mỹ học trò của Haberlandt và Robbins lặp lại thực nghiệm của Haberlandt với đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ một cây hòa thảo. Trong môi trường lỏng gồm có muối khoáng và glucose, đầu rễ sinh trưởng mạnh, tạo nên một hệ thống có rễ phụ. Giai đoạn này làm cơ sở cho việc chọn mẫu cấy và những nghiên cứu về thành phần môi trường ở các giai đoạn sau. Năm 1929 - 1933 lần lượt Bchumuker, Scheitter, Pfcifer và Lance thành công trong việc nuôi cấy một đoạn đầu mút rễ hoàn chỉnh. Năm 1934, bắt đầu giai đoạn thứ hai trong lịch sử nuôi cấy mô thực vật, khi White (Hoa Kỳ) nuôi cấy thành công đầu rễ cây cà chua (Lycopersicum esculentum) trong thời gian dài bằng muối khoáng, glucose và nước chiết nấm men. Sau đó, nước chiết nấm men được thay thế bằng 3 loại vitamin nhóm B: thiamin (B1), pyridoxine (B6) và nicotinic acid. Từ đó, việc nuôi cấy đầu rễ trong thời gian vô hạn được tiến hành ở nhiều cây khác nhau. Cũng trong năm 1934, Kogl lần đầu tiên xác định được vai trò của IAA (Indol Acetic Acid), một hoocmon thực vật đầu tiên thuộc nhóm auxin có khả năng kích thích sự tăng trưởng và phân chia tế bào. Năm 1939, ba nhà khoa học Gautheret, Nobecourt và White đã đồng thời nuôi cấy mô sẹo thành công trong thời gian dài từ mô thượng tầng (cambium) ở cà rốt và thuốc lá, mô sẹo có khả năng sinh trưởng liên tục. Trong thời gian này, nhiều chất sinh trưởng nhân tạo đã được nghiên cứu và tổng hợp thành công, như Napthyl Acetic Acid (NAA), 2,4 Dichlorphenoxy acetic acid (2,4D). Nhiều tác giả nhận thấy cùng với nước dừa, NAA và 2,4 D giúp tạo mô sẹo, gây phân chia tế bào thành công ở nhiều đối tượng thực vật mà trước đó rất khó nuôi cấy. Năm 1955, Miller và cộng sự đã phát minh cấu trúc và sinh tổng hợp của kinetin – một cytokinin đóng vai trò quan trọng trong phân bào và phân hoá chồi ở mô nuôi cấy. Năm 1957, Skoog và Miler công bố kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ nồng độ các chất auxin/ cytokinin trong môi trường phát sinh cơ quan (rễ hoặc chồi) của mô sẹo ở thuốc lá. Khi tỷ lệ auxin/ cytokinin như: IAA/ kinetin 1 mô sẹo có khuynh hướng phát triển rễ. Tỷ lệ auxin/ cytokinin thích hợp sẽ kích thích phân hóa cả chồi và rễ, tạo cây hoàn chỉnh. Từ năm 1954 đến 1959, kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào đơn đã được phát triển. Muir, Hildebrandt và Riker đã tách các tế bào của mô sẹo thành các tế bào đơn bằng cách sử dụng máy lắc. Năm 1960, Morel đã thực hiện bước ngoặt cách mạng trong sử dụng kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng trong nhân nhanh các loại địa lan Cymbidium, mở đầu công nghiệp vi nhân giống thực vật. Cũng trong năm này, Bergman công bố có thể dùng phương pháp lọc đơn giản để thu được hầu hết tế bào đơn mà không dính cụm. Cùng với kỹ thuật gieo tế bào của Bergman, nhiều tác giả đã thành công trong việc tạo cây hoàn chỉnh từ một tế bào, chứng minh được tính toàn năng của tế bào. Năm 1964, Guha và Maheshwari lần đầu tiên thành công trong tạo được cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn của cây cà rốt. Đầu những năm 1970, Nagata và Takebe (Nhật) thành công trong việc làm cho các protoplast tách từ mô thuốc lá tái tạo vỏ cellulose, phân chia, tạo nên quần thể tế bào trong môi trường lỏng. Năm 1972 Carlson và cộng sự lần đầu tiên thực hiện lai tế bào soma giữa các loài, tạo được cây từ dung hợp tế bào trần của 2 loài thuốc lá Nicotiana glauca và N langsdorfi Năm 1978, Melcher và cộng sự đã tạo được cây lai soma cà chua – thuốc lá bằng dung hợp tế bào trần. Năm 1979, Marton và cộng sự đã xây dựng được quy trình chuyển gen vào tế bào trần bằng đồng nuôi cấy tế bào trần và Agrobacterium. Từ năm 1980 đến 1992, nhiều thành công mới trong lĩnh vực công nghệ gen thực vật được công bố, hàng loạt các công trình chuyển gen ngoại lai vào nhiều họ thực vật. Khả năng nhân giống và phục tráng cây trồng được thể hiện rõ rệt trong những ứng dụng của nuôi cấy mô thực vật. Morel (1960) đã nhận thấy đỉnh sinh trưởng của các loài địa lan (Cymbidium) khi đem nuôi cấy sẽ hình thành các protocorm. Khi chia cắt các protocorm và nuôi cấy tiếp thì thu được các protocorm mới. Khi nuôi trong các điều kiện nhất định protocorm có thể phát triển thành cây lan con, tạo ra các dòng vô tính không bị nhiễm virus. Kỹ thuật này đặc biệt có giá trị đối với các cây như: khoai tây, cây ăn quả và nhiều cây nhân giống vô tính khác. Năm 1993, Kranz và Lorz thực hiện thụ tinh invitro tạo ra và nuôi cấy phôi hợp tử ở ngô. Các quá trình phát triển và phân hoá của phôi sau đó đã được quan sát dưới kính hiển vi và phân tích biểu hiện của gen nhằm xác định các gen tham gia trong từng giai đoạn phát triển của phôi. Hiện nay, nuôi cấy mô thực vật được ứng dụng mạnh mẽ trong việc nhân giống, chọn tạo giống, sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học và nghiên cứu lý luận di truyền thực vật bậc cao. Nuôi cấy mô thực vật đã được đưa vào các chương trình chọn giống, nhân giống hiện đại (Nguyễn Văn Uyển, 1993) [8]. II..1.2.2. Lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật ở Việt Nam Tại Việt Nam, nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật bắt đầu từ năm 1975. Phòng nuôi cấy mô đầu tiên được xây dựng tại Viện Sinh Học, Viện khoa học Việt Nam do Tiến Sĩ Lê Thị Muội đứng đầu. Nhận thức được triển vọng to lớn của nuôi cấy mô trong chọn giống và nhân giống cây trồng nông nghiệp, các cơ sở thuộc Trung tâm nghiên cứu Khoa học tự nhiên và Công nghệ Quốc gia Hà Nội, TP Hồ Chí Minh, một số đơn vị nghiên cứu thuộc Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, Bộ Lâm nghiệp, Bộ Y tế, Viện nghiên cứu Hạt Nhân đã xây dựng các phòng nuôi cấy mô thực vật, từng bước xây dựng tiềm lực khoa học và đào tạo cán bộ nghiên cứu vào ngành này (Trần Văn Minh, 1999) [7]. Theo Nguyễn Văn Uyển và các tác giả, 1993 nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật ở Việt Nam đã đạt một số thành tựu như sau [8]: - Nhân giống khoai tây (Solanum tuberosum L..) tại Viện Công Nghệ Sinh học. - Nhân giống vô tính cà Phê (họRubiaceae) Nguyễn Thị Quyền, Nguyễn Văn Uyển). - Nhân giống chuối (Mus a spp) - Nhân giống cây bắt ruồi ( Nepenthes madagascariens ) Đoàn Thị Ái Thuyền. - Nhân giống dứa Cayen và Queen Long An. - Ứng dụng nuôi cấy mô trong nhân giống mía đường (Sacharum offciarum), nhân giống cây Vani (Vanilla sp) bằng nuôi cấy mô (Vũ Mỹ Liên) II.1.3. Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Nuôi cấy mô tế bào thực vật là khái niệm chung cho tất cả các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo trong điều kiện vô trùng [6]. Nuôi cấy mô tế bào thực vật bao gồm: - Nuôi cấy cây non và cây trưởng thành. - Nuôi cấy cơ quan: rễ, thân, lá, hoa, quả, bao phấn, noãn chưa thụ tinh. - Nuôi cấy phôi: phôi non và phôi trưởng thành - Nuôi cấy mô sẹo(callus). - Nuôi cấy tế bào đơn (huyền phù tế bào). - Nuôi cấy prôtplast: nuôi cấy tế bào trần. Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa vào tính toàn năng của tế bào và dựa vào khả năng phân hoá – phản phân hoá của tế bào. II.1.3.1. Tính toàn năng của tế bào Năm 1902, Haberlandt đã quan niệm rằng mỗi tế bào bất kì của một cở thể sinhvật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Theo quan niệm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hoá đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ cả sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh đó là tính toàn năng của tế bào [6]. Như vậy, tính toàn năng của tế bào thực vật là khả năng của các tế bào đã được biệt hoá (trừ một số tế bào đã được biệt hoá sâu như ống mạch, mao dẫn) có khả năng thể hiện toàn bộ hệ thống di truyền và có khả năng phát triển thành cây hoàn chỉnh mới. II.1.3.2. Sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào Cơ thể thực vật trưởng thành là một nhóm chính thể thống bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, được hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau. Tuy nhiên tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợp tử). Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia hình thành nhiều tế bào phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên hoá). Sau đó từ các tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục biến đổi thành tế bào chuyên hoá đặc biệt cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau. Sự phân hoá tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô chuyên hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau. Ví dụ: Mô dậu làm nhiệm vụ quang hợp, mô bì làm nhiệm vụ bảo vệ, mô dự trữ làm nhiệm vụ dự trữ, mô dẫn làm chức năng dẫn nước và dẫn dinh dưỡng. Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hoá thành các tế bào có chức năng chuyên, chúng không hoàn toàn mất đi khả năng biến đổi của mình. Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ. Quá trình đó gọi là phản phân hoá tế bào, ngược lại với sự phân hoá tế bào. Qúa trình phân hóa và phản phân hóa của tế bào được biểu diễn dưới sơ đồ sau: Phân hoá tế bào Tế bào phôi sinh Tế bào dãn Tế bào chuyên hoá Phản phân hoá tế bào Trong đó: + Tế bào hợp tử là tế bào ban đầu. + Tế bào phôi sinh là tế bào chưa có chức năng riêng biệt. +Tế bào chuyên hóa là các tế bào đã mang chức năng riêng biệt [15]. Về bản chất thì sự phân hoá và phản phân hoá là một quá trình hoạt hoá, ức chế các gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gene được hoạt hoá (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ra tính trạng mới, còn một số gene khác lại bị đình chỉ hoạt động. Điều này theo một chương trình đã được mã hoá trong cấu trúc phân tử DNA của mỗi tế bào khiến quá trình sinh trưởng và phát triển của cơ thể thực vật luôn được hài hoà. Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể bình thường bị ức chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thước của từng khối mô sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự hoạt hoá các gen của tế bào. Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào thực vật thực chất là kết quả của quá trình phân hoá và phản phân hoá. Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào xét cho đến cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo và vô trùng) một cách định hướng dựa vào sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào trên cơ sở tính toàn năng của tế bào thực vật. Để điều khiển sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy hai nhóm chất điều tiết sinh trưởng thực vật là auxin và cytokinin. * Các giai đoạn trong quá trình nhân giống in vitro +Giai đoạn 1: Giai đoạn chuẩn bị tạo cây mẹ sạch bệnh và nuôi cấy khởi động. + Giai đoạn 2: Chọn mẫu cấy phù hợp cho việc tái sinh nhân nhanh cây. Khử mô nuôi cấy sau khi đã xác định được mẫu cấy bằng (HgCl2, NaOCl, H2O2). Lựa chọn môi trường nuôi cấy phù hợp để mẫu phát sinh chồi bất định hoặc phôi vô tính. + Giai đoạn 3: Nhân nhanh. + Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh. + Giai đoạn 5: Đưa cây ra ngoài vườn ươm. II.1.4. Các kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật invitro * Nuôi cấy phôi Năm 1921 Dieterich đã đưa ra kết luận là phôi nuôi cấy invitro hoàn toàn có thể nảy mầm không qua giai đoạn ngủ nghỉ dựa trên cơ sở các nghiên cứu của mình. Nhưng môi trường dinh dưỡng cho sự tạo cây ở phôi trưởng thành và phôi non là khác nhau, phôi non cần môi trường giàu dinh dưỡng hơn. * Nuôi cấy mô trong cơ quan tách rời Năm 1946 Wetmare đã chứng minh các bộ phận của cây đều có thể nuôi cấy khi gặp điều kiện thuận lợi. Với các bộ phận khác nhau trên cây thì nhu cầu dinh dưỡng khi nuôi cấy cũng rất khác nhau. Muốn duy trì sinh trưởng và phát triển mô của cơ quan nuôi cấy thì sau một khoảng thời gian nhất định ta phải cấy chuyển sang môi trường mới. Ứng dụng: Nghiên cứu các môi trường dinh dưỡng phù hợp với các bộ phận khác nhau của cây, tạo mô sẹo nhân cây in vitro. * Kỹ thuật nuôi cấy mô phân sinh Thường sử dụng là các mô đỉnh chồi và đỉnh cành có kích thước từ 0,1 mm đến 1,0 mm. Các mô phân sinh dùng để nuôi cấy thường tách từ các mầm non, các chồi mới hình thành và các cành non. Khi sử dụng các mô phân sinh cần phải cân bằng giữa các chất điều hòa sinh trưởng. Ứng dụng: Tạo cây sạch virus, nhân giống in vitro tạo cây đa bội thông qua xử lý Conxixin [16]. * Nuôi cấy bao phấn Đã có rất nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy hạt phấn nuôi cấy có thể phát triển thành cây đơn bội hoàn chỉnh trong điều kiện nuôi cấy in vitro bằng con đường tạo phôi trực tiếp và gián tiếp trung gian qua mô sẹo và tạo cơ quan. Ứng dụng: Tạo các dòng thuần, biểu hiện các gen lặn, cây đơn bội thu được từ nuôi cấy bao phấn và hạt phấn là nguồn nguyên liệu cho chọn dòng đột biến. * Nuôi cấy tế bào đơn và tế bào trần Năm 1960 Cooking sử dụng enzim phân giải tế bào và đã tạo ra một số lượng lớn tế bào trần. Khi tách khỏi mô hoặc quần thể tế bào chúng được nuôi riêng rẽ. Ứng dụng: Là đối tượng lý tưởng trong nghiên cứu những biến đổi di truyền ở thực vật bằng phương pháp dung hợp 2 loại tế bào trần để tạo các cây lai soma. * Nuôi cấy mô sẹo Các mô đã biệt hóa được tách ra dưới điều kiện thích hợp sẽ phản biệt hóa tạo thành mô sẹo. Có thể sử dụ