Đề tài Nghiên cứu kỹ thuật PCR chuẩn đoán virut gây bệnh ở tôm sú

Nghiên cứu kỹ thuật PCR chuẩn đoán virut gây bệnh ở tôm sú Nguyễn Thị Tần, Lê Quang Hưng, Phạm Anh Tuấn Viện nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản I Đặt vấn đề Bệnh đốm trắng (White spot syndrom virut - WSSV) đã và đang gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi tôm sú không chỉ ở Châu á mà còn trên toàn thế giới (Flegel và ctv., 1997). Bệnh đốm trắng đã phát hiện ở trên một số loài tôm khác nhau: P. monodon, P. japonicus và L. vannameit....WSSV nhiễm ở tôm bố mẹ có thể truyền sang tôm giống (Lo và ctv., 1997), tôm giống mang mầm bệnh sau 1-2 tháng đầu thả nuôi phát triển bình thường, nhưng sau đó khoảng 80% số ao nuôi phát hiện bệnh đốm trắng và gây chết hàng loạt. Nghiên cứu phát hiện bệnh đốm trắng bằng nhiều phương pháp khác nhau như mô bệnh học, nhuộm tươi và PCR. Trong đó kỹ thuật PCR chính xác và nhạy cảm cao, cho phép phát hiện nhanh ngay từ khi tôm mới nhiễm bệnh ở giai đoạn sớm, do đó ngày nay phương pháp này được sử dụng rất rộng rãi. Để phát triển bền vững nghề nuôi tôm, rất nhiều tác giả nghiên cứu phát hiện bệnh đốm trắng bằng phương pháp PCR với các cặp mồi khác nhau. (Kasornchandra và ctv., 1998) sử dụng cặp mồi 102F1&102R1 cho PCR đơn phát hiện virus gây bệnh đốm trắng trên tôm ở sáu nước Châu á. Kim và ctv (1998) cũng sử dụng cặp mồi 1F&1R1 cho PCR đơn phát hiện WSSV trên tôm ở Hàn quốc. Lo và ctv.,(1996 a,b) sử dụng các cặp mồi 146F1&146R1,146F2&146R2 cho PCR lồng trên tôm ở Đài Loan. Peng và ctv.,(1998), Chou và ctv., (1998) nghiên cứu phát hiện WSSV với cặp đoạn mồi theo nghiên cứu của Lo (1996) với các chu kỳ nhiệt khác nhau. Như vậy, có rất nhiều quy trình khác nhau để phát hiện WSSV. Tuy nhiên việc ứng dụng các quy trình này và tìm ra quy trình tối ưu cho việc phát hiện bệnh đốm trắng ở tôm nuôi tại Việt Nam là lĩnh vực nghiên cứu hoàn toàn mới. Nhằm đáp ứng mục tiêu phát hiện nhanh WSSV, hạn chế thiệt hại do bệnh đốm trắng gây ra, và tìm ra quy trình tối ưu nhằm ứng dụng rộng rãi trong chuẩn đoán phát hiện WSSV trên tôm nuôi tại Việt nam, chúng tôi tiến hành những nội dung nghiên cứu sau: 1. Các phương pháp tách chiết ADN 2. Pháp phát hiện bệnh đốm trắng bằng PCR đơn với các chu kỳ nhiệt khác nhau 3. Phát hiện bệnh đốm trắng bằng PCR lồng với các chu kỳ nhiệt khác nhau 4. Chạy PCR phát hiện virus gây bệnh đốm trắng trên tôm ở các mẫu mô khác nhau 5. Phát hiện bệnh bằng phương pháp PCR Kit 6. ứng dụng quy trình PCR tối ưu cho việc phát hiện virus gây bệnh đốm trắng trên tôm sú ở một số tỉnh miền Bắc và miền Trung. 1 Phương pháp nghiên cứu 1. Thu mẫu: Tất cả các mẫu được thu từ Nha Trang, Bình Thuận và Ninh Thuận Stt Quần đàn Số mẫu Kết quả theo mô bệnh học 1 Nha Trang I 10 10 (++) 2 Nha Trang II 10 10 (+) 3 Ninh Thuận I 10 4 (+); 2 (-); 3 (++) 4 Bình Thuận IV 10 10 + 5 Bình Thuận V 10 10 + 6 Ninh Thuận II 3 3+ 2. Tách chiết ADN 2.1. Phương pháp 1 Lấy một phần chân bơi hoặc mô cơ, nếu tôm nhỏ ta lấy mẫu cả con, rửa sạch. Nghiền 1 lượng mẫu khoảng 0,05g trong 900 µl Cell Lysis Solution. Dùng RNase - A (10mg/ml) loại ARN, kết tủa protein bằng 7.5 M Amonium Acetate, dùng cồn 960 để kết tủa ADN. Sau đó ADN được hoà tan trong đệm TE hoặc nước cất tinh khiết, bảo quản ở 40C. 2.2. Phương pháp 2 Dùng phenol, chloroform, isoamyl alcohol (tỷ lệ 25:24:1). Kết tủa ADN bằng cồn 960 hoặc isopropanol. Sau đó ADN được hoà tan trong đệm TE hoặc nước cất tinh khiết, bảo quản ở 40C. 2.3. Phương pháp 3 Dùng Lysis Buffer trong bộ kit IQ2000-WSSV, Đài Loan 3. Phản ứng PCR 3.1. Phương pháp 1: PCR đơn Trình tự các đoạn mồi sử dụng cho phương pháp PCR đơn 102F1: 5’ - TCA CAT CGA GAC CTC TGT AC - 3’ và 102R1: 5’ - TCT AGG ACG GAC TAT GGC - 3’(Kaornchandra và ctv., 1998), bệnh bắt cặp lên ở 520bp. 1F: 5’ - ATC TGA TGA GAC AGC CCA AG - 3’ 2 và 1R: 5’ - GGG AAT GTT AAA TAT GTA TCG G - 3’ (Kim và ctv., 1998), bệnh bắt cặp lên ở 365bp. 3.2. Phương pháp 2: PCR lồng Trình tự các đoạn mồi sử dụng cho phương pháp PCR lồng (Lo và ctv., 1996) Cặp mồi cho PCR lần 1: 146 F1: 5' - ACT ACT AAC TTC AGC CTA TCT CG - 3' 146 R1: 5' -TAA TGC GGG TGT AAT GTT CTT ACG A - 3'. bệnh bắp cặp lên ở 1447bp Cặp mồi cho PCR lần 2: 146 F2: 5' - GTA ACT GCC CCT TCC TCC ATC CTC CA - 3' 146 R2: 5' - TAC GGC TGC TGC TGC ACC TTG T - 3' bệnh bắp cặp lên ở 941bp 2.3. Phương pháp 3: phương pháp kit First PCR Premix Nested PCR Premix Kết quả và thảo luận 1. Tách chiết ADN Giếng 1 2 3 4 5 6 Hình 1: Kết quả kiểm tra ADN tách chiết trên gel agarose 1% Giếng 1, 2: tách chiết phương pháp 1 Giếng 3, 4: Tách chiết phương pháp 2 Giếng 5, 6: tách chiết phương pháp 3 3 Qua cả 3 phương pháp tách chiết trên cho thấy, sản phẩm ADN thu được đều đủ về số lượng và độ tinh sạch cho các nghiên cứu tiếp theo. Tuy nhiên chúng tôi muốn đưa ra cả 3 phương pháp tách chiết để tuỳ theo điều kiện và hoá chất của từng phòng thí nghiệm có ứng dụng phương pháp thích hợp. 2. Pháp phát hiện bệnh đốm trắng bằng PCR đơn với các chu kỳ nhiệt khác nhau Chúng tôi tiến hành làm thí nghiệm 50 mẫu đã xác định là có nhiễm bệnh đốm trắng qua phương pháp mô bệnh học, thành phần cho chạy PCR bao gồm: + 10X PCR buffer + 25pmol đoạn mồi R + 2mM dNTPs + 2u Taq polymerase + 1,5mM MgCl2 + 100ng ADN mẫu + 25pmol đoạn mồi F +dung dịch H2O 2.1.Kết quả chạy PCR đơn với cặp đoạn mồi 1F&1R với các chu kỳ nhiệt khác nhau Chu kỳ nhiệt I II III 94oC (30”) 55oC 94oC (50”) 60 oC 94oC (50”) 54oC (45”) 72 oC (45”) (1’) 72 oC (1’30”) (1’) 72 oC (1’30”) Kết quả + - + - + - Tỷ lệ phát hiện bệnh (%) 22% 88% 10% 90% 32% 68% +: Mẫu phát hiện có bị bệnh đốm trắng -: Mẫu không phát hiện được bệnh đốm trắng Chu kỳ nhiệt I chúng tôi tiến hành như tác giả đã công bố, tỷ lệ phát hiện bệnh dao động từ 10% đến 32%, tỷ lệ phát hiện đạt hiệu quả cao nhất (32%) với chu kỳ nhiệt 94oC (50”), 54oC (60”), 72oC (90”), và thấp nhất với chu kỳ nhiệt 94oC (50”), 60oC (60”), 72oC (90”). Giếng 1 2 3 4 5 6 7 8 4 Hình 2: Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR dùng cặp mồi 1F, 1R Giếng 8: Thang ADN chuẩn Qua hình trên cho ta thấy giếng 2, 3 và 6 bị bệnh đốm trắng, các băng lên ở 365bp phù hợp với kết quả nghiên cứu của (Kim và ctv.,1998). 2.2.Kết quả chạy PCR với cặp đoạn mồi 102F&102R với các chu kỳ nhiệt khác nhau Chu kỳ nhiệt I II III 95oC (50”) 58 oC 94oC (50”) 55 oC 95oC (50”) 57 oC (1’30) (1’) 72 oC (1’) (1’) 72 oC (1’) 72300b oCp (1’25”) Kết quả + - + - + - Tỷ lệ phát hiện 16% 84% 8% 92% 26% 74% bệnh (%) +: Mẫu phát hiện có nhiễm bệnh đốm trắng -: Mẫu không phát hiện được bệnh đốm trắng Chu kỳ nhiệt I chúng tôi tiến hành như tác giả đã công bố, tỷ lệ phát hiện bệnh dao động từ 8% đến 26%, tỷ lệ phát hiện đạt hiệu quả cao nhất (26%) với chu kỳ nhiệt 95oC (50”), 57 oC (1’30), 72 oC (1’25”), và thấp nhất (8%) với chu kỳ nhiệt 94oC (50”), 55 oC (1’), 72 oC (1’). Giếng 1 2 3 4 5 6 7 8 500bp 400bp 300bp Hình 3: Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR dùng cặp mồi 102F, 102R Giếng 8: Thang ADN chuẩn 5 Qua hình 3 cho thấy giếng 2, 3 và 6 bị bệnh đốm trắng, các băng lên ở 520bp phù hợp với kết quả nghiên cứu của Kaornchandra và ctv. (1998). 3. Kết quả chạy Nested PCR với cặp đoạn mồi 146 của Lo. (1996) với các chu kỳ nhiệt khác nhau Chu kỳ nhiệt I II III 94oC (1’) 60 oC (1’) 95oC (50”) 58 oC 94oC (1’) 55 oC (1’) 72 oC (3’) (1’) 72 oC (1’25”) 72 oC (3’) Kết quả + - + - + - Tỷ lệ phát hiện 90% 10% 86% 14% 96% 4% bệnh (%) +: Mẫu phát hiện có nhiễm bệnh đốm trắng -: Mẫu không phát hiện được bệnh đốm trắng Chu kỳ nhiệt I chúng tôi tiến hành như tác giả đã công bố, tỷ lệ phát hiện bệnh dao động từ 86% đến 96%, tỷ lệ phát hiện đạt hiệu quả cao nhất (96%) với chu kỳ nhiệt 94oC (1’), 55 oC (1’), 72 oC (3’), và thấp nhất (86%) với chu kỳ nhiệt 95oC (50”), 58 oC (1’), 72 oC (1’25”). 1353bp im chm Giếng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 PCR lần 2 PCR lần 1 2-------------------------------9 10___________15 Hình 4: Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR dùng cặp mồi 146F1, 146R1; 146F2, 146R2 Giếng 1, 8, 15: thang ADN chuẩn (1353, 1078, 872, 603 bp) 6 Qua hình 4 cho ta thấy, giếng 12 nhiễm bệnh nặng nên biểu hiện băng đặc hiệu ngay ở PCR lần 1 ứng với 1447bp. Giếng 10, 11, 13, 14 không thấy biểu hiện bệnh. Khi PCR lần 2 ta thấy giếng 2, 4, 7 có biểu hiện bệnh ứng với 941bp. Sản phẩm của phản ứng PCR lồng, có độ nhậy cao hơn phản ứng PCR đơn từ 103 - 104 lần (Peng, 1998), và phản ứng PCR đơn chỉ có khả năng phát hiện WSSV khi tôm đã nhiễm bệnh từ giai đoạn nặng đến rất nặng, còn PCR lồng có khả năng phát hiện WSSV ngay từ giai đoạn tôm nhiễm bệnh rất nhẹ (Lo và ctv, 1998). Kết quả phát hiện bệnh của các cặp mồi khác nhau chạy với chu trình nhiệt tối ưu nhất Cặp đoạn mồi 1F&1R 102F&102R 146F1&146R1 146F2&146R2 Kết quả + - + - + - + - Tỷ lệ phát hiện 30% 70% 24% 76% 38% 62% 96% 4% bệnh (%) +: Mẫu phát hiện có nhiễm bệnh đốm trắng -: Mẫu không phát hiện được bệnh đốm trắng Kết quả trên cho thấy các cặp đoạn mồi trên đều có khả năng phát hiện WSSV, khả năng phát hiện WSSV của các cặp đoạn mồi 1F&1R, 102F1&102R1 dùng cho phản ứng PCR đơn và cặp mồi 146F1&146R1 chỉ giao động trong khoảng 24% đến 38%. Theo kết quả mô bệnh học chỉ có 27,08% mẫu bị bệnh nặng, còn 72,92% mẫu bị bệnh nhẹ. Hơn nữa tất cả những mẫu mô bệnh học phát hiện là bệnh nặng, thì đều được phát hiện ở cặp 1F, 1R, 102F, 102R và 146F1, 146R1khi chậy PCR. Như vậy cho ta thấy cặp mồi 1F, 1R, 102F, 102R và 146 F1, 146R1 chỉ có khả năng phát hiện được mẫu đã nhiễm bệnh nặng, chỉ có PCR lồng với cặp mồi 146F2, 146R2 có khả năng phát hiện được những mãu nhiễm bệnh ở giai đoạn nhẹ. Điều này phù hợp với nghiên cứu của Lo và ctv, 1996, Chang và ctv., 1998 PCR lồng nhạy cảm hơn PCR đơn từ 103 đến 104. 4. Xác định mẫu mô nhiễm bệnh thích hợp cho PCR Kết quả khả năng phát hiện bệnh đốm trắng ở các mô khác nhau, sử dụng cặp mồi của Lo và theo phương pháp đã được chúng tôi tối ưu. Kết quả nhân bản PCR với các mô khác nhau Stt Mang Chân bơi Đuôi Stt Mang Chân bơi Đuôi 1 + + + 16 + + + 2 + + + 17 + + + 3 + + + 18 + + + 4 + + + 19 + + + 5 + - + 20 + + + 6 + + - 21 + + + 7 + + + 22 + + - 7 8 + + + 23 + + 9 + + + 24 + + - 10 + + - 25 + + + 11 + + + 26 + + + 12 + + + 27 + + + 13 + + + 28 + + + 14 + + - 29 + + - 15 + + - 30 + + + Tỷ lệ phát hiện bệnh ở các mô khác nhau Số mẫu bị bệnh (Theo mô bệnh học) Tỷ lệ phát hiện bệnh (%) Mang Chân bơi Đuôi 30 100% 96,66% 76,66% Như vậy, khả năng phát hiện WSBV ở mô mang cho hiệu quả cao nhất, tiếp theo là chân bơI, bụng..... và cuối cùng là đuôi. Theo Chang (1996) tác nhân gây bệnh đốm trắng - WSBV ở dạ dầy, mô mang được phát hiện ngay ở giai đoạn tôm nhiễm bệnh rất nhẹ, và số lượng tác nhân không ngừng tăng cùng với thời gian nhiễm bệnh, và tác nhân gây bệnh chỉ được phát hiện ở đuôi khi tôm đã nhiễm bệnh nặng (sau thời gian cảm nhiễm 64 giờ)- Chang và ctv (1996). Lo (1996). Kim (1998) và Kaornchandra,1998 cũng đã nghiên cứu WSBV trên các mô khác nhau và họ cho rằng khả năng phát hiện WSBV ở mô mang cho hiệu quả rất cao. Như vậy chúng ta nên sử dụng mô mang của tôm bệnh để tách chiết ADN cho phản ứng PCR. Từ những kết quả nghiên cứu thu được chúng tôi đè xuất quy trình tối ưu để chuẩn đoán bệnh đốm trắng cho tôm ở Việt Nam. - Tách chiết ADN từ mang (20-30mg), nồng độ ADN dùng cho phản ứng PCR từ 100 - 200ng. - Cặp mồi lên dùng: 146F1&146R1,146F2&146R2 - Thành phần phản ứng PCR + 10X PCR buffer + 2mM dNTPs + 1,5mM MgCl2 + 25pmol đoạn mồi F : + 25pmol đoạn mồi R + 2u Taq polymerase + 100ng ADN mẫu +Dung dịch H2O - Chu kỳ nhiệt chạy PCR với (chạy 40chu kỳ): 940C (1’); 550C (1’); 720C (3’); chu kỳ cuối 720 C (7’); 40C (∞) 8 5. Phát hiện bệnh bằng phương pháp PCR kit với tổng thể tích mẫu khác nhau Giếng M 2 3 4 5 6 7 8 M Hình 5: Tổng thể tích cho quá trình chạy PCR là 20ul. Sản phẩm kiểm tra trên giếng dày 0,75mm, chiều dài 0,5cm, lượng mẫu chấm từ 10 - 13ul. Giếng 1 và 9: Thang ADN chuẩn (848, 630, 330bp) Giếng 2: Mẫu đối chứng không có ADN (Yeast tRNA) Giếng 3, 4, 5: không bị bệnh ứng với 848 bp Giếng 6, 7: bệnh nặng lên 3 băng (910, 550, 296bp) Giếng 8: (P+ standard) Qua hình trên cho ta kết quả giếng 6, 7 nhiễm bệnh nặng; giếng 3, 4, 5 không nhiễm bệnh. Cũng vẫn tiến hành làm như các bước trên nhưng tổng thể tích chạy PCR giảm xuống 10ul và 7ul, kết quả thu được ở hình dưới. M Giếng M 1 2 3 4 5 6 Hình 6: Tổng thể tích 7ul Tổng thể tích 10ul M: Thang ADN chuẩn (848, 630, 330bp) 9 Sản phẩm kiểm tra trên giếng dày 0, 75mm, chiều dài 0,25cm, lượng mẫu chấm từ 4 - 5ul. Giếng 1 và 4 không bị bệnh; giếng 2 và 5 bị bệnh rất nhẹ; mẫu 3 và 6 bị bệnh nhẹ. Như vậy với thể tích rất nhỏ 10ul hoặc 7ul, chúng tôi vẫn có thể kiểm tra được mẫu có bị bệnh hay không. Bằng cách chấm mẫu kiểm tra trên bản gel có giếng chấm nhỏ 0,25 cm, khi đó lượng mẫu chấm chỉ là 5ul. Do đó hạ được chi phí xuống chỉ còn 1/2 đến 1/3 so với quy trình bộ kit đưa ra 20ul. 6. ứng dụng phương pháp PCR tối ưu cho việc phát hiện bệnh đốm trắng trên tôm sú ở một số tỉnh miền Bắc và miền Trung Việt nam STT Tỉnh Quần đàn Số Kết quả Kết quả % sai lượng mô PCR giữa PCR và mẫu + - + - mô 1 Ninh thuận 47 29 18 25 22 8,51% 2 Miền Trung Bình thuận 30 20 10 20 10 6,6% 3 Nha trang 30 20 10 21 9 3,3% 4 Bình định 30 30 26 4 13,3% 5 Tôm bố mẹ 24 11 13 11 13 0% 6 Miền Bắc Thanh hoá 30 20 10 7 Nghệ an 30 25 5 25 5 0% 8 Quảng Ninh 30 14 16 Tổng 251 135 56 162 89 5,28% 10 Tài liệu tham khảo Chang. P S, C F. Lo, Y C. Wang, G H. Kou,1996: Indentification of white spot syndrom associate baculovirus target organs in the shrimp by in situ hybridization, Diseases of aquaculture oganims 27, 131 - 139 Chou. H Y, C Y. Huang, C F. Lo, G H. Kou,1998: Studies tranmission of White spot syndrom associated baculovirus in peneaus monodon DNA peneaus japonicus ia water born contact DNA oral ingetion, Aquaculture 164, 263 - 276 Hassan. M D, M. shariff, A H. Sahtout, 2001: DNA fragmentation, an indicator of apotosis in culture black tiger shrimp peneaus monodon infected with White spot syndrom baculovirus, Diseases of aquaculture oganims 44. Kasornchandra.J, S. Boonyaratpalin,T. Itami,1998: Detection of White spot syndrom inculture penaeid shrimp in Asia: Microscopic observation ADN PCR, Aquaculture 164, 243 - 251 Kim C K, P K. Kim, D S. Sim, M A. Park, M S. Heo, T H. Lee, J D. Lee, H K. Jun, K L. Jang,1998: Development of a polymerase chain reaction - PCR procedure for the detection of baculovirus associated with White spot syndrom baculovirus in penaeid shrimp, Journal of fish diseases 21, 11 - 17 LO. C F, J H. Leu, C H. Ho, C H. Chen, S E. Peng, Y T. Chen, c m. Chou, P Y. Yeh, C J. Huang, H Y. Chou, Y L. Chiu, C H. Wang, G H. Kou,1996a: Detecton of baculovirus associate with White spot syndrom baculovirus in penaeid shrimp using PCR, Diseases of Aquaculture ogarnism 25, 133 - 141 LO. C F, K F. Liu, C H. Ho, C H. Chen, S E. Peng, M S. Su, C F. Chang, H C. HsuC H. Wang, G H. Kou,1996b:White spot syndrom baculovirus detected in culture DNA capture shrimp, crabs DNA other arthropods, Diseases of Aquaculture ogarnism 27, 215 - 225 LO. C F, K F. Liu, C H. Ho, C H. Chen, S E. Peng, M S. Su, C F. Chang, H C. HsuC H. Wang, G H. Kou, Y L. Chiu, P Y. Yeh, 1997: Detection DNA tissue tropism of White spot syndrom baculovirus in capture brooder of peneaus monodon with a special emphasis on reproductive organ, Diseases of Aquaculture ogarnism 30, 53 - 72 Peng. S E, C F. Lo, C F. Chang, G H. Kou,1998: Detection of White spot syndrom baculovirus in giant fresh water prawn, Macrobrachium rosenbergii, using PCR , Aquaculture 164, 253 - 262 Peng. S E, C F. Lo, K F. Liu, G H. Kou,1998: The transition from prepatent to patent infection of White spot syndrom baculovirus in peneaus monodon triggered pereiopod exsision, fish pathology 33, 395 - 400. 11 Phụ lục : Kết qủa mô bệnh học và PCR chạy theo các chu kỳ tối ưu Mô 1F& 1R 102F & 102R 146F1& 146R1 146F2& 146R2 stt Kq stt Kq stt Kq stt Kq stt Kq 1 + 1 + 1 + 1 + 1 + 2 - 2 - 2 - 2 + 2 + 3 - 3 - 3 - 3 - 3 + 4 + 4 + 4 + 4 + 4 + 5 - 5 - 5 - 5 - 5 + 6 + 6 + 6 + 6 - 6 + 7 - 7 - 7 - 7 - 7 + 8 - 8 - 8 - 8 - 8 + 9 - 9 + 9 - 9 + 9 + 10 - 10 - 10 - 10 - 10 + 11 - 11 - 11 - 11 + 11 + 12 - 12 - 12 - 12 - 12 + 13 + 13 + 13 + 13 + 13 + 14 - 14 - 14 - 14 - 14 + 15 - 15 - 15 - 15 - 15 + 16 + 16 + 16 + 16 + 16 + 17 - 17 - 17 - 17 - 17 + 18 - 18 + 18 - 18 - 18 + 19 - 19 - 19 - 19 - 19 + 20 - 20 - 20 - 20 - 20 - 21 - 21 - 21 - 21 - 21 + 22 + 22 + 22 + 22 + 22 + 23 - 23 - 23 - 23 - 23 + 24 - 24 - 24 - 24 + 24 + 25 - 25 - 25 - 25 - 25 + 26 - 26 - 26 - 26 - 26 + 27 - 27 - 27 - 27 - 27 + 28 - 28 - 28 - 28 + 28 + 29 - 29 - 29 - 29 - 29 + 30 + 30 + 30 + 30 + 30 + 31 + 31 + 31 + 31 + 31 + 32 - 32 - 32 - 32 - 32 + 33 - 33 - 33 - 33 + 33 + 34 - 34 - 34 - 34 - 34 + 35 - 35 - 35 - 35 - 35 + 36 + 36 + 36 + 36 + 36 + 37 + 37 + 37 + 37 + 37 + 38 - 38 - 38 - 38 - 38 + 39 - 39 - 39 - 39 - 39 + 40 - 40 - 40 - 40 - 40 + 41 + 41 + 41 + 41 + 41 + 42 - 42 - 42 - 42 + 42 - 43 - 43 - 43 - 43 - 43 + 44 - 44 - 44 - 44 - + 45 - 45 - 45 - 45 - + 12 46 + 46 + 46 + 46 + + 47 - 47 - 47 - 47 - + 48 - 48 + 48 - 48 + + 49 - 49 - 49 - 49 - + 50 - 50 - 50 - 50 - + 13