Đề tài Nghiên cứu ứng dụng enzyme amylase, protease và nấm men thuần chủng trong sản xuất rượu vang nếp

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TRÀ VINH KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ THỦY SẢN TRUNG TÂM CÔNG NGHỆ SAU THU HOẠCH NGUYỄN HOÀNG ANH NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYME AMYLASE, PROTEASE VÀ NẤM MEN THUẦN CHỦNG TRONG SẢN XUẤT RƯỢU VANG NẾP NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG TRÀ VINH - 2010 Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch i LỜI CẢM TẠ Đề tài nghiên cứu được hoàn thành tại Trung tâm Công nghệ sau thu hoạch, Khoa Nông nghiệp và Thủy sản, Trường Đại học Trà Vinh và Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến: Ban Giám Hiệu Trường Đại học Trà Vinh, Phòng Khoa học công nghệ và đào tạo sau đại học, Ban lãnh đạo Khoa Nông Nghiệp & Thủy Sản, Trung tâm Thí nghiệm, Trung tâm Công nghệ sau thu hoạch đã tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ, hỗ trợ tôi hoàn thành nghiên cứu. Thầy Nguyễn Công Hà đã tận tình hướng dẫn, động viên, giúp tôi vượt qua mọi khó khăn để thực hiện và hoàn chỉnh nội dung nghiên cứu. Qúy Thầy, Cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt khóa học và các Cán bộ phòng thí nghiệm Trung tâm Thí nghiệm, bộ môn Công nghệ Thực phẩm đã tạo điều kiện thuận lợi giúp tôi thực hiện đề tài. Quý Thầy, Cô trong Hội đồng báo cáo nghiệm thu đề tài, đặc biệt là Giáo viên phản biện đã đọc và đóng góp ý kiến quí báo để nghiên cứu được hoàn chỉnh. Cảm ơn quý Thầy, Cô Trung tâm Công nghệ sau thu hoạch đã đóng góp ý kiến, thảo luận và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện thí nghiệm. Xin chân thành cảm ơn! Trà vinh, ngày 4 tháng 09 năm 2010 Nguyễn Hoàng Anh Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch ii TÓM TẮT Ở Việt Nam, rượu nếp chủ yếu sản xuất theo lối thủ công với chất lượng sản phẩm không ổn định. Đến nay, phương pháp truyền thống vẫn là phương pháp chủ yếu để sản xuất rượu mặc dù vẫn còn giới hạn do thời gian sản xuất kéo dài, khó kiểm soát chất lượng của sản phẩm cuối. Trong nghiên cứu: “Hoàn thiện quy trình sản xuất rượu vang nếp trắng bằng enzyme và nấm men thuần chủng” được thực hiện để cải thiện công nghệ sản xuất rượu nếp, nâng cao chất lượng sản phẩm, cũng như dễ dàng để kiểm soát dây chuyền chế biến đặc biệt là trong giai đoạn dịch hóa, đường hóa, thủy phân protein và lên men. Vì vậy, những ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, nồng độ enzyme, tỉ lệ cơ chất và thời gian thủy phân đến hoạt tính các loại enzyme α- amylase, glucoamylase thủy phân tinh bột để tạo ra đường khử và papain hoặc bromelain thủy phân protein để tăng thêm acid amin tự do cho nấm men phát triển sinh khối và chuyển hóa thành rượu làm tăng hiệu suất lên men trong quy trình sản xuất đã được nghiên cứu. Kết quả nghiên cứu cho thấy đã xác định điều kiện tối ưu cho 4 loại enzyme trên với nguyên liệu nếp trắng khi sử dụng α-amylase 0,3%, 31 phút tại pH 6,5, nhiệt độ 870C để thủy phân tinh bột nếp, nồng độ đường khử thu được khoảng 6,46% và khi sử dụng tiếp glucoamylase 0,6%, 39 phút ở nhiệt độ 610C, pH 4,0 hàm lượng đường khử sinh ra lên đến 16,10%. Tiếp theo sử dụng papain với nồng độ 0,35%, thời gian thủy phân 45 phút ở pH 5,9, nhiệt độ 500C thu được hàm lượng nitơ amin 0,081%, cùng các thông số động học Vmax= 0,1065 ± 0,0036; km= 4,7822 ± 0,7705 hoặc bromelain nồng độ là 0,5%, 55 phút tại pH 5,7, nhiệt độ 550C lượng nitơ amin thu được 0,054 % cùng các thông số động học Vmax= 0,0622 ± 0,0013; km= 3,5652 ± 0,4280. Dịch nếp sau khi thủy phân được lọc, điều chỉnh pH 4,9 và lên men với nấm men Saccharomyces cerevisiae 0,2%, sản phẩm rượu vang được so sánh rượu lên men theo phương pháp truyền thống sử dụng bánh men thuốc bắc. Kết quả chỉ ra rằng việc ứng dụng các enzyme thủy phân tinh bột, protein và nấm men thuần chủng trong quy trình sản xuất rượu vang nếp trắng có thể giảm thời gian lên men chính còn 6 ngày, tăng độ rượu tạo thành đến 12,6% và sẽ đảm bảo các chỉ tiêu hóa lí, vi sinh theo TCVN 7045: 2009, từng bước cải thiện quy trình sản xuất truyền thống theo phương pháp cổ truyền, có thể sản xuất công nghiệp tạo ra rượu đạt chất lượng cảm quan cao và đảm bảo an toàn về mặt vệ sinh thực phẩm. Từ khóa: rượu vang nếp, α–amylase, glucoamylase, dịch hóa, đường hóa, papain, bromelain, saccharomyces cerevisiae, bánh men thuốc bắc, lên men rượu. Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch iii ABSTRACT In Vietnam, glutinous rice wine has mainly manufactured by manual work and the quality is not settled. Up to now, traditional method is still the main method to produce rice wine even though they have a limitation due to taking time for production, difficult to control the quality of final product. In this study: “The improvement of white glutinous rice wine production using hydrolysis enzymes and purebred yeast” was used to improving technological production line of glutinous rice wine, make the quality of product better as well as make easy to control processing line especially during liquefaction, saccharification, protein hydrolysis and alcoholic fermentation stage. Therefore, the effect of pH, temperature, enzyme concentration, substrate ratio and the time of activation on the activity of four kinds of commercial enzyme α-amylase, glucoamylase hydrolyze starch to make transformation of glucose and papain or bromelain hydrolyze protein to increases the content of amin acid for the yeast to develop biomass and transform into wine, to increase the fermentation performance of glutinous rice wine were done. The results showed that optimum conditions four kinds of enzyme were studied directly to white glutinous rice material established. When using α-amylase 0.3%, 31 minutes at pH 6.5 and 870C to hydrolyze raw material glutinous rice starch, transformation of glucose was established about 6.46%, and when using glucoamylase 0.6%, 39 minutes at pH 4.0 and 610C directly to glutinous rice material, transformation of glucose was produced upto 16.10 %. Next, using papain to hydrolyze protein of glutinous rice raw material with 0.35% concentration, hydrolysis time 45 minutes at pH 5.9, temperature 500C, nitrogen amin produced content 0.081%, kinetic parameters of papain on glutinous rice starch was Vmax= 0.1065 ± 0.0036; km= 4.7822 ± 0.7705 or using bromelain with 0.5%, 55 minutes at pH 5.7 and 550C, nitrogen amin produced 0.054%, kinetic parameters of bromelain with substrate as protein of glutinous rice was calculated as Vmax= 0.0622 ± 0.0013; km= 3.5652 ± 0.4280. Finally, glutinous rice solution after hydrolysis, filter, adjustment of pH 4.9 are fermented with yeast Saccharomyces cerevisiae 0.2%, wine product fermented compared to product is wine fermented in a traditional method using alcoholic starter. Results indicated that the application of α-amylase, glucoamylase, bromelain and purebred yeast of glutinous rice wine making can reduce the time for alcohol fermentation shorter 6 days, higher alcohol level up to 12.6% and will ensure physical-chemical and microorganism standard criteria TCVN7045: 2009, step by step improving traditional glutinous rice wine production for industrial production and high-quality sensory produce, hygienic and safe. Keyword: glutinous rice wine, α-amylase, glucoamylase, liquefaction, saccharification, papain, bromelain, alcoholic starter, Saccharomyces cerevisiae, alcoholic fermentation. Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch iv MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ ............................................................................................... i TÓM TẮT .................................................................................................... ii ABSTRACT ............................................................................................... iii MỤC LỤC ................................................................................................... iv DANH SÁCH BẢNG ................................................................................. xi CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU ......................................................................... 1 1.1 Đặt vấn đề ................................................................................................... 1 1.2 Mục tiêu của đề tài ..................................................................................... 1 1.3 Nội dung nghiên cứu .................................................................................. 2 CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU .................................................... 3 2.1 Nguồn nguyên liệu sản xuất rượu ............................................................. 3 2.2 Enzyme amylase ......................................................................................... 4 2.2.1 Enzyme α-amylase (EC 3.2.1.1)............................................................ 4 2.2.2 Enzyme glucoamylase (EC 3.2.1.3) ...................................................... 7 2.2.3 Hoạt lực của enzyme amylase ............................................................... 8 2.3 Enzyme papain (EC 3.4.22.2) .................................................................. 13 2.3.1 Cấu tạo của enzyme papain ................................................................ 13 2.3.2 Hoạt tính của enzyme papain .............................................................. 13 2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme papain .......................... 14 2.4 Enzyme bromelain (EC 3.4.22.32) .......................................................... 16 2.4.1 Cấu tạo của enzyme bromelain ............................................................ 16 2.4.2 Hoạt tính enzyme bromelain ................................................................ 17 2.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme bromelain ..................... 17 2.5 Nấm men ................................................................................................... 18 2.5.1 Cấu tạo và thành phần của nấm men.................................................. 18 2.5.2 Sự sinh trưởng và phát triển của nấm men ......................................... 19 2.5.3 Nấm men sử dụng trong sản xuất rượu vang ...................................... 19 Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch v 2.6 Bánh men thuốc bắc ................................................................................. 21 2.7 Các quá trình chính trong sản xuất rượu vang nếp ............................. 22 2.7.1 Quá trình hồ hóa tinh bột .................................................................... 22 2.7.2 Quá trình đường hóa trong sản xuất rượu vang nếp .......................... 23 2.7.3 Quá trình lên men trong sản xuất rượu vang nếp ............................... 23 2.7.4 Cơ chế của quá trình lên men rượu .................................................... 24 2.7.5 Các giai đoạn của quá trình lên men rượu ......................................... 25 2.7.6 Cơ chế chuyển hóa đường thành rượu ............................................... 25 2.7.7 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men rượu ............................. 26 2.8 Sản phẩm phụ và sản phẩm trung gian của quá trình lên men rượu 27 2.8.1 Sự tạo thành methalnol ...................................................................... 28 2.8.2 Sự tạo thành aldehyde ........................................................................ 28 2.8.3 Sự tạo thành các rượu bậc cao .......................................................... 28 2.8.4 Sự tạo thành các acid hữu cơ ............................................................. 29 2.8.5 Sự tạo thành các ester ........................................................................ 29 2.8.6 Sự tạo thành furfurol ........................................................................... 29 2.9 Quy trình sản xuất rượu vang nếp ......................................................... 30 2.9.1 Sơ đồ quy trình .................................................................................... 30 2.9.2 Thuyết minh quy trình ......................................................................... 31 CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 3.1 Phương tiện nghiên cứu ........................................................................... 32 3.1.1 Thời gian và địa điểm ......................................................................... 32 3.1.2 Nguyên vật liệu ................................................................................... 32 3.1.3 Hóa chất .............................................................................................. 32 3.1.4 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm ............................................................ 32 3.2 Phương pháp nghiên cứu ........................................................................ 34 3.2.1 Phương pháp lấy mẫu ......................................................................... 34 3.2.2 Phương pháp nghiên cứu .................................................................... 34 Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch vi 3.2.3 Phương pháp phân tích ....................................................................... 34 3.3 Nội dung và bố trí thí nghiệm ................................................................. 35 3.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ứng dụng enzyme α-amylase trong quá trình dịch hóa và đường hóa một phần bột nếp trắng. ........................................ 35 3.3.1.1 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng pH và nhiệt độ của enzyme α-amylase trong quá trình thủy phân bột nếp. ..................................................... 35 3.3.1.2 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ enzyme α-amylase và thời gian thủy phân bột nếp. ............................................................................ 36 3.3.1.3 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ bột nếp đến hoạt tính của enzyme α-amylase trong quá trình thủy phân. ....................................... 37 3.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ứng dụng enzyme glucoamylase trong quá trình đường hóa dịch nếp trắng. ................................................................... 37 3.3.2.1 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng pH và nhiệt độ của enzyme glucoamylase trong thủy phân dịch nếp. .............................................................. 37 3.3.2.2 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ enzyme glucoamylase và thời gian thủy phân dịch nếp trắng. .......................................... 38 3.3.2.3 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ bột nếp đến hoạt tính của enzyme glucoamylase trong quá trình thủy phân. .................................. 39 3.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát động học và ứng dụng enzyme papain thủy phân protein dịch nếp sau khi dịch hóa và đường hóa bằng α- amylase và glucoamylase. .................................................................................................. 39 3.3.3.1 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng pH và nhiệt độ của enzyme papain trong quá trình thủy phân protein nếp. ..................................................... 40 3.3.3.2 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ enzyme papain và thời gian thủy phân protein nếp. .......................................................................... 40 3.3.3.3 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ bột nếp đến hoạt tính enzyme papain trong quá trình thủy phân protein nếp. ................................ 41 3.3.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát động học và ứng dụng enzyme bromelain thủy phân protein dịch nếp sau khi dịch hóa và đường hóa bằng α- amylase và glucoamylase. .................................................................................................. 42 3.3.4.1 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng pH và nhiệt độ của enzyme bromelain trong quá trình thủy phân protein nếp................................................. 42 Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch vii 3.3.4.2 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ enzyme bromelain và thời gian thủy phân protein nếp. ...................................................................... 42 3.3.4.3 Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ bột nếp đến hoạt tính enzyme bromelain trong quá trình thủy phân protein nếp. ........................... 43 3.3.5 Thí nghiệm 5: Theo dõi, so sánh, đánh giá chất lượng sản phẩm rượu lên men truyền thống sử dụng men thuốc bắc và rượu sử dụng enzyme với nấm men thuần chủng trong giai đoạn lên men chính và ổn định. ................ 44 CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................ 46 4.1 Thành phần chính nguyên liệu nếp trắng .............................................. 46 4.2 Kết quả khảo sát ứng dụng enzyme α-amylase trong quá trình dịch hóa và đường hóa một phần bột nếp trắng. ............................................ 46 4.2.1 Kết quả ảnh hưởng pH và nhiệt độ của enzyme α-amylase trong quá trình thủy phân bột nếp trắng. ...................................................................... 46 4.2.2 Kết quả ảnh hưởng nồng độ enzyme α-amylase và thời gian thủy phân bột nếp. ........................................................................................................ 49 4.2.3 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ bột nếp đến hoạt tính của enzyme α-amylase trong quá trình thủy phân. ..................................................... 51 4.3 Kết quả khảo sát ứng dụng enzyme glucoamylase trong quá trình đường hóa dịch nếp trắng. ................................................................................ 52 4.3.1 Kết quả ảnh hưởng pH và nhiệt độ của enzyme glucoamylase trong thủy phân dịch nếp trắng. ........................................................................... 53 4.3.2 Kết quả ảnh hưởng nồng độ enzyme glucoamylase và thời gian thủy phân dịch nếp trắng. .................................................................................... 55 4.3.3 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ bột nếp đến hoạt tính của enzyme glucoamylase trong quá trình thủy phân ................................................ 57 4.4 Kết quả khảo sát động học và ứng dụng enzyme papain thủy phân protein dịch nếp sau khi dịch hóa và đường hóa bằng α-amylase và glucoamylase. ................................................................................................. 58 4.4.1 Kết quả ảnh hưởng pH và nhiệt độ của enzyme papain trong quá trình thủy phân protein nếp. ................................................................................. 59 4.4.2 Kết quả ảnh hưởng nồng độ enzyme papain và thời gian thủy phân protein nếp. ................................................................................................. 60 Nghiên cứu khoa học cấp trường - 2010 Trường Đại học Trà Vinh Chuyên ngành Công nghệ sau thu hoạch viii 4.4.3 Kết quả ảnh hưởng nồng độ bột nếp đến hoạt tính enzyme papain trong quá trình thủy phân protein nếp ................................................................. 62 4.5 Kết quả khảo sát động học và ứng dụng enzyme bromelain thủy phân protein dịch nếp sau khi dịch hóa và đường hóa bằng α- amylase và glucoamylase .................................................................................................. 64 4.5.1 Kết quả ảnh hưởng pH và nhiệt độ của enzyme bromelain trong quá trình thủy phân protein nếp ........................................................................... 64 4.5.2 Kết quả ảnh hưởng nồng độ enzyme bromelain và thời gian thủy phân protein dịch nếp. ......................................................................................... 66 4.5.3 Kế