Đề tài Nghiên cứu và phát hiện vi khuẩn leifsonia xyli subsp. xyli, tác nhân gây bệnh cằn mía gốc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT HIỆN VI KHUẨN Leifsonia xyli subsp. xyli, TÁC NHÂN GÂY BỆNH CẰN MÍA GỐC Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: CHU THỊ BÍCH PHƢỢNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2007 2 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP VĂN BẰNG KỸ SƢ NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT HIỆN VI KHUẨN Leifsonia xyli subsp. xyli, TÁC NHÂN GÂY BỆNH CẰN MÍA GỐC Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN CHU THỊ BÍCH PHƢỢNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2007 3 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC FACULTY OF BIOTECHNOLOGY ***000*** Graduation thesis Major: Biotechnology RESEARCH ON Leifsonia xyli subsp. xyli, THE CAUSAL AGENT OF RATOON STUNTING DISEASE ON SUGARCANE Doctor Student LE DINH DON CHU THI BICH PHUONG Ho Chi Minh City 8/ 2007 4 LỜI CẢM ƠN Xin chân thành gửi lời cảm ơn đến:  Ban giám hiệu Trường đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học, cùng tất cả Quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường.  TS. Lê Đình Đôn đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.  ThS. Hà Đình Tuấn, Trung tâm nghiên cứu mía đường Bến Cát, Bình Dương đã tận tình giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện khóa luận.  Anh Nguyễn Văn Lẫm, anh Nguyễn Anh Khoa và các anh chị tại phòng thí nghiệm Hóa Sinh thuộc Trung tâm phân tích thí nghiệm Trường đại học Nông Lâm.  Chị Kiều, chị Vy, Chị Vân cùng toàn thể các bạn sinh viên cùng thực hiện khóa luận tại phòng 105, khu Phượng Vĩ, Trường đại học Nông Lâm đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt thời gian qua.  Các bạn bè thân yêu của lớp Công nghệ Sinh học K29 đã chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập. Sau cùng, con xin bày tỏ lòng kính yêu và biết ơn sâu sắc nhất đối với bố mẹ; cám ơn bố mẹ và hai em đã luôn tin tưởng, yêu thương, tạo mọi điều kiện cho con học tập tốt. Em cũng xin cám ơn anh đã luôn ủng hộ, động viên, giúp đỡ em vượt qua mọi khó khăn trong cuộc sống cũng như trong thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp. Sinh viên thực hiện, Chu Thị Bích Phượng 5 TÓM TẮT Đề tài: "NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT HIỆN VI KHUẨN Leifsonia xyli subsp. xyli, TÁC NHÂN GÂY BỆNH CẰN MÍA GỐC" được thực hiện từ ngày 1 tháng 4 đến ngày 30 tháng 8 năm 2007 tại Trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Hiện nay, cây mía (Saccharum spp.) đang là một trong những loại cây công nghiệp cho hiệu quả kinh tế cao ở nước ta cũng như nhiều nước trên thế giới (Cuba, Ấn Độ, Australia); vì vậy, diện tích trồng mía cũng như sự ra đời của nhiều giống mới không ngừng gia tăng trong những năm gần đây. Tuy nhiên, ở cây mía có đến 126 loại bệnh xảy ra làm giảm đáng kể đến năng suất và sản lượng của cây, gây thiệt hại to lớn đối với ngành công nghiệp đường trên thế giới (Ricaud và ctv., 1989). Trong đó, bệnh cằn mía gốc được phát hiện ở hầu hết các khu vực trồng mía, có thể làm giảm đến 50 % sản lượng đối với các giống nhạy cảm và không có khả năng kháng (Bailey và Bechet, 1995). Đối tượng nghiên cứu là vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx), tác nhân gây bệnh cằn mía gốc. Đây là một loại vi khuẩn có kích thước nhỏ (0,25 - 0,35 x 1 - 4 μm, đôi khi dài đến 10 m), dạng conryne, kí sinh chuyên tính gây tắc bó mạch của cây, làm giảm sức sống và số lượng chồi tạo thành, đặc biệt là các chồi hình thành sau khi thu hoạch. Cây bị bệnh này thường còi cọc, đường kính cũng như chiều dài thân nhỏ hơn so với cây bình thường (Davis và ctv., 1980). Mục đích của đề tài nhằm khảo sát sự phân bố của vi khuẩn Lxx trong bó mạch dọc theo vị trí lóng và khảo sát thời gian kí sinh gây tắc mạch của vi khuẩn khi xâm nhập vào cây; phân lập vi khuẩn Lxx từ dịch chiết của cây bị bệnh; sau đó tiến hành các thử nghiệm sinh hóa nhằm xác định Lxx từ các dòng vi khuẩn được phân lập. Các thí nghiệm khảo sát trên nhằm tạo tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn về sinh học phân tử (PCR, dot blot, nghiên cứu cấu trúc gen, cơ chế gây bệnh), từ đó đưa ra chiến lược xử lý và kiểm soát bệnh hiệu quả. Các nội dung thực hiện (1) Khảo sát sự phân bố của vi khuẩn Lxx dọc theo các lóng bằng phương pháp nhuộm STM (Staining by Transpiration Method). (2) Chủng bệnh các cây nuôi cấy 6 mô 3 tháng tuổi bằng dịch chiết từ cây mía bị nhiễm Lxx. Sau đó, khảo sát thời gian vi khuẩn gây tắc mạch và tỉ lệ cây được chủng bị nhiễm. (3) Phân lập vi khuẩn Lxx từ dịch chiết của cây bị bệnh và thực hiện các phản ứng sinh hóa nhằm xác định vi khuẩn Lxx từ các dòng vi khuẩn phân lập được. Các kết quả thu đƣợc (1) Kết quả cho thấy hầu hết mía được khảo sát đều bị nhiễm bệnh cằn mía gốc với tỉ lệ nhiễm khác nhau từ nhẹ đến trung bình. Vi khuẩn Lxx tập trung chủ yếu ở lóng thứ nhất từ dưới lên và có mật độ giảm dần trong các lóng ở phía trên. (2) Hầu hết các cây nuôi cấy mô sau khi chủng đều bị nhiễm bệnh. Kết quả khảo sát cho thấy cây bắt đầu bị tắc mạch sau khoảng 30 ngày chủng bệnh, tỉ lệ mạch tắc tăng dần theo thời gian quan sát (45, 60 ngày). (3) Các dòng khuẩn lạc phân lập được sau 28 – 42 ngày nuôi cấy đều có dạng tròn lồi, đường kính 0,1 – 0,3 mm, trong suốt giống như mô tả khuẩn lạc của vi khuẩn Lxx. Các khuẩn lạc này được cấy chuyền trên môi trường MSC và SC, sau đó tăng sinh trong môi trường lỏng S8 và thực hiện các thử nghiệm sinh hóa. Tuy nhiên, kết quả thử nghiệm sinh hóa cho thấy chỉ có một dòng vi khuẩn phân lập được có thể là Leifsonia xyli subsp. xyli. Giới hạn của đề tài (1) Phương pháp nhuộm STM là một phương pháp hiệu quả để phát hiện bệnh cằn mía gốc. Tuy nhiên, phương pháp này không thể tiến hành ở giai đoạn sớm mà chỉ có thể tiến hành đối với những cây mía trên 3 tháng tuổi; do đó, việc kiểm soát bệnh ở giai đoạn cây còn nhỏ rất khó khăn. (2) Quá trình nuôi cấy phân lập vi khuẩn Lxx rất khó khăn do đây là vi khuẩn ký sinh chuyên tính trong bó mạch của cây mía. Vi khuẩn Lxx chỉ có thể phát triển trên môi trường MSC hoặc SC sau thời gian 28 – 42 ngày, do môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng lại được ủ trong thời gian dài nên sự tạp nhiễm rất dễ xảy ra. (3) Kết quả thử nghiệm sinh hóa chỉ nhằm phát hiện sơ bộ vi khuẩn Lxx từ các dòng vi khuẩn phân lập được, cần phải tiến hành các thử nghiệm phân tử để xác định lại kết quả đã đạt được. 7 SUMMARY The thesis titled: "RESEARCH ON Leifsonia xyli subsp. xyli, THE CAUSAL AGENT OF RATOON STUNTING DISEASE ON SUGARCANE" was submitted to Biotechnology Department, Nong Lam University by CHU THI BICH PHUONG in partial fulfillment of the requirements for the degree of Bachelor in Biotechnology. Ratoon stunting disease (RSD), caused by the xylem–limited coryneform bacterium Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx), is a major constraint for worldwide sugarcane production. However, RSD is difficult to detect in the field because the typical symptoms of this disease, such as thinner, weaker and fewer stalks per stool, could be due to unknown factors. Since Lxx spread mechanically by infected planting and harvesting equipments, as well as by infected plant materials, it is necessary that the initial planting material be free of RSD. Our research was conducted to investigate the Lxx's distribution along the stalk, the infection level of the inoculated plants and the time for Lxx colonized the vascular; in order to develop the best control strategy to prevent losses from RSD. Although Lxx's colonization in the sugarcane is a systemic infection, the results of staining by Transpiration Method (STM) showed that the titer of the bacterium was different between the internodes. The bacteria titer was highest in the basal internode, it is suitable for conclusions of Dean (1984) and Grisham (2007); so that diagnoses should be conducted on this position. It took about 30 days for Lxx to colonize in the xylem vascular of the inoculated plants. After 28 – 42 days inoculated, bacteria strains isolated from sap of infected plants were subjected to the biochemical tests for identifing Lxx. The preliminary results showed that only one strain was recommended to be Lxx; consequently, molecular biology tools should be used to dissect Leifsonia xyli subsp. xyli, the causal agent of RSD. 8 MỤC LỤC Nội dung Trang Lời cảm ơn ........................................................................................................... iii Tóm tắt................................................................................................................. iv Summary .............................................................................................................. vi Mục lục ................................................................................................................ vii Danh sách các chữ viết tắt ................................................................................... x Danh sách các bảng ............................................................................................ xi Danh sách các hình ............................................................................................. xii 1. MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ..................................................................................................... 1 1.2. Mục đích, nội dung nghiên cứu ..................................................................... 3 1.2.1. Mục đích ..................................................................................................... 3 1.2.2. Nội dung ..................................................................................................... 3 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................................. 4 2.1. Giới thiệu sơ lược về cây mía ....................................................................... 4 2.1.1. Nguồn gốc và lịch sử phát triển ................................................................. 4 2.1.2. Phân loại học .............................................................................................. 4 2.1.3. Phân bố ....................................................................................................... 5 2.1.4. Đặc điểm thực vật học ................................................................................ 5 2.1.4.1. Các bộ phận của cây mía ......................................................................... 5 2.1.4.2. Các giai đoạn sinh trưởng và phát triển .................................................. 6 2.1.5. Giá trị kinh tế của cây mía ......................................................................... 8 2.2. Các loại bệnh hại trên mía ............................................................................. 9 2.3. Sơ lược về bệnh cằn mía gốc ....................................................................... 12 2.3.1. Tác nhân gây bệnh .................................................................................... 12 2.3.2. Triệu chứng ............................................................................................... 13 2.3.3. Sự phát triển, lan truyền dịch bệnh ........................................................... 14 9 2.3.4. Biện pháp ngăn chặn và kiểm soát dịch bệnh ........................................... 15 2.4. Các phương pháp chẩn đoán, phát hiện vi khuẩn Lxx .................................. 16 2.4.1. Phương pháp chẩn đoán truyền thống ....................................................... 16 2.4.2. Phương pháp chẩn đoán trực tiếp bằng kính hiển vi ................................. 16 2.4.3. Phương pháp nhuộm STM ........................................................................ 16 2.4.4. Phương pháp huyết thanh học ................................................................... 17 2.4.5. Phương pháp chẩn đoán dựa vào kỹ thuật sinh học phân tử ..................... 18 2.5. Tình hình nghiên cứu bệnh cằn mía gốc ...................................................... 19 2.5.1. Trên thế giới .............................................................................................. 19 2.5.2. Trong nước ................................................................................................ 20 3. VẬT LIỆU PHƢƠNG PHÁP ....................................................................... 21 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................................ 21 3.2. Vật liệu và hóa chất thí nghiệm ................................................................... 21 3.2.1. Vật liệu thí nghiệm .................................................................................... 21 3.2.2. Hóa chất thí nghiệm .................................................................................. 21 3.2.3. Thiết bị, dụng cụ ....................................................................................... 22 3.3. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 22 3.3.1. Phương pháp thu thập mẫu ........................................................................ 22 3.3.2. Phương pháp nhuộm STM ........................................................................ 24 3.3.3. Phương pháp chủng bệnh lên cây nuôi cấy mô bằng dịch chiết của cây mía bị bệnh ........................................................................................ 24 3.3.4. Phương pháp tiến hành các thử nghiệm sinh hóa bước đầu khẳng định vi khuẩn Lxx từ các dòng vi khuẩn phân lập được .......................... 24 3.3.4.1. Xác định Gram của vi khuẩn .................................................................. 24 3.3.4.2. Thử nghiệm khả năng lên men carbohydrate ......................................... 26 3.3.4.3. Thử nghiệm xác định hoạt động của enzyme ngoại bào ở vi sinh vật ............................................................................................................. 26 3.4. Bố trí thí nghiệm .......................................................................................... 27 10 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................... 29 4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát tỉ lệ phân bố của vi khuẩn Lxx dọc theo lóng của cây mía bị bệnh ..................................................................................... 29 4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát thời gian vi khuẩn Lxx gây tắc mạch và tỉ lệ cây bị bệnh sau khi chủng ............................................................................ 34 4.3. Thí nghiệm 3: Nuôi cấy phân lập vi khuẩn Lxx ........................................... 38 4.4. Thí nghiệm 4: Thử nghiệm sinh hóa bước đầu khẳng định vi khuẩn Lxx từ các dòng vi khuẩn phân lập được ..................................................... 41 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 45 5.1. Kết luận ........................................................................................................ 45 5.2. Đề nghị ......................................................................................................... 45 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 47 Tài liệu tham khảo Tiếng Việt ............................................................................ 47 Tài liệu tham khảo Tiếng Anh ............................................................................ 48 Tài liệu tham khảo Internet ................................................................................. 51 7. PHỤ LỤC ....................................................................................................... 52 Phụ lục 1: Môi trường SC ................................................................................... 52 Phụ lục 2: Môi trường MSC ................................................................................ 52 Phụ lục 3: Môi trường lỏng S8............................................................................ 53 Phụ lục 4: Môi trường Phenol Red Carbohydrate Broth ................................... 53 Phụ lục 5: Môi trường Starch ............................................................................. 53 Phụ Lục 6: Bảng sinh hóa phát hiện vi khuẩn Lxx ............................................. 54 11 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT Lxx : Leifsonia xyli subsp. xyli STM : Staining by Transpiration Method RSD : Ratoon Stunting Disease PCR : Polymerase Chain Reaction ctv. : cộng tác viên rRNA : Ribosome ribonuleic acid Mb : Mega bases bp : base pair ITS : Intergenic transcribed spacer region LT – EIA : Liquid Transfer Enzyme immunoassay EB – ELISA : Evaporative binding - Enzym Linked immunosorbent assay TBIA : Tissue Blot Enzym Immunoassay NCM : Nitrose cellulose membrance TRITC : Tetramethylrhodamine isothiocyanate FAT : Indirect flourescent antibody technique FADCF : Flourescent antibody directed counting filter µl : Micro litre µg : Micro gram µM : Micro mol mM : Mili mol IgG : Immunoglobulin 12 DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng 2.1. Danh sách bệnh hại mía quan trọng và phổ biến ............................ 11 Bảng 4.1. Kết quả khảo sát tỉ lệ bó mạch đỏ và bó mạch vàng trong mỗi lóng dọc theo chiều cao cây............................................................ 29 Bảng 4.2. Kết quả khảo sát thời gian vi khuẩn Lxx gây tắc mạch và tỉ lệ bị bệnh của các cây nuôi cấy mô được chủng thông qua tỉ lệ mạch đỏ trung bình ......................................................................... 35 Bảng 4.3. Bảng kết quả của các thử nghiệm sinh hóa đối với 8 dòng vi khuẩn đã phân lập được .................................................................. 41 13 DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình Trang Hình 2.1. Cây mía ............................................................................................ 5 Hình 2.2. Một số bệnh hại phổ biến trên cây mía ........................................... 10 Hình 2.3. Vi khuẩn Lxx – tác nhân gây bệnh cằn mía gốc .............................. 12 Hình 2.4. Sự phân chia của các tế bào Leifsonia xyli subsp. xyli được phân lập từ dịch chiết nước mía ..................................................... 13 Hình 2.5. Triệu chứng của cây mía bị bệnh cằn mía gốc ................................ 14 Hình 3.1. Quy trình nhuộm STM để chẩn đoán cây mía bị bệnh ................... 23 Hình 3.2. Phương pháp chủng bệnh cằn mía gốc vào cây mía nuôi cấy mô ................................................................................................... 25 Hình 4.1. Lát mỏng cắt ngang của thân mía sau khi nhuộm STM ................. 30 Hình 4.2. Kết quả khảo sát sự phân bố của vi khuẩn Lxx dọc theo lóng của cây mía bị bệnh ........................................................................ 31 Hình 4.3. Mẫu thân cây mía cắt dọc................................................................ 36 Hình 4.4. Kết quả thử nghiệm phản ứng sinh hóa .......................................... 42 14 Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Mía là một loại cây công nghiệp ngắn ngày có vị thế ngày càng quan trọng ở nước ta. Nó là một trong những cây mũi nhọn, có hiệu quả kinh tế cao, là cây có ưu thế trong việc chuyển đổi cơ cấu cây trồng ở vùng đất cao chưa chủ động nước và vùng đồi thấp. Mía là cây có khả năng bảo vệ và bồi dưỡng đất, là cây làm giàu của trung du. Trước mắt, mía