Đề tài Phân lập, tuyển chọn chủng Bacillus subtilis có khả năng sinh tổng hợp chất ức chế α- Glucosidase và tối ưu điều kiện nuôi cấy để thu chất ức chế α-glucosidase cao

Viện Đại học Mở Hà NộiKhoa công nghệ sinh học GVHD: PGS.TS Trần Liên Hà SVTH: Nguyễn Quỳnh Trang Lớp: KS.CNSH 07-01 NỘI DUNG I.TỔNG QUAN 1.1. Bệnh tiểu đường Dự kiến đến 2030 có thể tăng lên đến 472 triệu người 1.2. Tác hại của bệnh tiểu đường Meglitimide Metformin Sulphonylurea 1.3. Thuốc chữa bệnh tiểu đường Thuốc ức chế α-glucosidase ere … 1.4. Cơ chế tác dụng của AGIs trong điều trị tiểu đường II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2. 1. Vật liệu 2.2. Phương pháp nghiên cứu III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập Bacillus từ tương Nam Đàn 3.2. Nhuộm Gram & bào tử Bào tử của chủng T13 3.3. Khảo sát định tính khả năng sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase  Đường kính vòng thủy phân mẫu đối chứng d=18 mm Đường kính vòng thủy phân chủng T13 Hình thái khuẩn lạc chủng T13 3.4. Khảo sát định lượng khả năng sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase   3.5. Tối ưu điều kiện nhiệt độ 30oC 35oC 3.5. Tối ưu điều kiện nhiệt độ 40oC 3.5. Tối ưu điều kiện nhiệt độ 45oC 3.5. Tối ưu điều kiện nhiệt độ 3.6. Tối ưu điều kiện pH 3.7.Tối ưu nồng độ cơ chất Lựa chọn cơ chất Hàm lượng Nitơ tổng Thành phần môi trường Lựa chọn cơ chất Khả năng sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase sử dụng cơ chất đậu tương IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận - Phân lập được 13 chủng từ tương Nam Đàn. - Chủng T13 có đường kính vòng thủy phân nhỏ nhất 12mm - Chủng Natto có khả năng sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase cao nhất 70,61%. - Chủng Natto có khả năng sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase cao nhất ở 40oC (82,23%), pH 5 (83, 73%), sử dụng cơ chất đậu tương với hàm lượng Nitơ 5% (85,75%).  4.2. Kiến nghị Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ lắc đến sự sinh trưởng phát triển và khả năng sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase từ canh trường nuôi cấy của chủng Natto. - Thu, tách và tinh sạch chất kìm hãm để ứng dụng trong điều trị bệnh tiểu đường. Khảo sát định tính khả năng sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase Dựa trên phương pháp đo đường kính vòng thủy phân tạo thành sau khi cho α-glucosidase thủy phân tinh bột tan đồng thời bổ sung canh trường nuôi cấy vi khuẩn có chứa chất ức chế enzyme α-glucosidase. *Cách tiến hành Khảo sát định lượng khả năng sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase Dựa trên phương pháp xác định hàm lượng đường glucose tạo thành sau khi cho α-glucosidase thủy phân tinh bột tan và cho thêm canh trường nuôi cấy vi sinh vật chứa chất ức chế α-glucosidase. Hàm lượng glucose được xác định bằng phương pháp DNS. Khi lượng glucose tạo thành càng ít thì giá trị hấp thụ màu của phản ứng DNS ở bước sóng 540nm càng thấp. Hoạt tính ức chê α-glucosidase dựa trên độ giảm khả năng hấp thụ màu của hỗn hợp.  Hoạt tính ức chế α-glucosidase được xác định theo công thức: % ức chế = [Α – (B – C)]/Α.100 (%) (1) Trong đó: A: là hàm lượng glucose tạo thành khi α-glucosidase bị thủy phân. B: là hàm lượng glucose tạo thành sau khi cho thêm canh trường nuôi cấy vi khuẩn C: là hàm lượng đường glucose có sẵn trong canh trường nuôi vi khuẩn. * Phương pháp xác định hoạt tính ức chế α-glucosidase: Phương pháp nhuộm bào tử * Nguyên tắc: Sự bắt màu thuốc nhuộm của tế bào vi sinh vật là một quá trình hấp phụ. Phần lớn vi sinh vật bắt màu bền vững. Thuốc nhuộm thường dùng là các chất aminlin (chủ yếu là loại kiềm hoặc trung tính). Vì thành phần tế bào của mỗi vi sinh vật khác nhau nên khả năng bắt màu cũng rất khác nhau. * Cách tiến hành: Trước khi nhuộm bào tử, tiến hành sốc nhiệt (70oC trong 10 phút) hoặc để lạnh trong tủ lạnh 2oC trong 2 ngày, nhằm kích thích vi khuẩn tạo bào tử. Sau đó tiến hành làm tiêu bản để nhuộm bào tử. Làm vết bôi và cố định vết bôi bằng cách hơ trên ngọn lửa đèn cồn. Nhuộm xanh metylen theo loffler: Nhỏ 1 giọt xanh metylen, hơ nóng đến sôi nhẹ và giữ như vậy trong 15 − 20 giây. Rửa bằng nước cất, nhuộm lại bằng fucshin giữ khoảng 30 giây. Sau đó rửa bằng nước cất, hơ khô. Nhỏ 1 giọt dầu soi rồi quan sát dưới vật kính dầu 100X. Kết quả: tế bào bắt màu hồng, bào tử bắt màu xanh. Phương pháp nhuộm Gram * Cách tiến hành: Làm vết bôi và cố định vết bôi bằng cách hơ trên ngọn lửa đèn cồn. Nhỏ 1 giọt tím gential lên trên vết bôi, giữ trong khoảng 1 − 2 phút, rửa bằng nước cất, thấm khô. Nhỏ dung dịch lugol lên trên vết bôi, giữ trong 1 phút rồi rửa cồn, thấm khô (hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn). Nhỏ 1 giọt fucshin lên vết bôi, giữ trong 12 phút. Sau đó rửa nước, thấm khô. Nhỏ 1 giọt dầu soi rồi quan sát dưới vật kính dầu 100X. Kết quả: vi khuẩn Gram (+) bắt tím, vi khuẩn Gram (−) bắt màu hồng. IC50: The half maximal inhibitory concentrationDNJ : 1-deoxynojrimycinα-glucosidase (enzyme EC 3.2.1.20) Trung tâm hoạt động của α-glucosidase họ GH13