Đề tài Phân lập và tuyển chọn chủng nấm men có hoạt lực cao trong sản xuất rượu đặc sản từ bánh men lá ở một số vùng miền núi phía Bắc

MỤC LỤC PHẦN I: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Uống rượu gắn liền với nét văn hóa ẩm thực của không chỉ người dân Việt Nam. Nếu như xứ Scotland tự hào về dòng wishky, người Pháp có cognac, Nga có vodka, Trung Quốc có Mao Đài, Nhật Bản có rượu Sake, Hàn Quốc có rượu Sochou thì Việt Nam chúng ta cũng rất tự hào về loại rượu nấu theo cách cổ truyền như: rượu nếp, rượu cần, rượu ngô, rượu sắn... Xã hội ngày càng phát triển thì nhu cầu về văn hóa ẩm thực nói chung cũng như văn hóa dùng rượu nói riêng đòi hỏi chúng ta cần phải có sản phẩm rượu vừa thơm ngon mang tính đặc trưng của dân tộc lại đảm bảo được sức khỏe cho người tiêu dùng. Nhưng chúng ta chưa có dòng rượu sang trọng dùng để tiếp khách. Và như chúng ta thấy, người dân Việt Nam dùng rượu ngoại rất nhiều trong nhu cầu hàng ngày cũng như làm quà để biếu. Ở Việt Nam, nghề nấu rượu đã có từ lâu đời rong nhân dân. Ở miền núi, đồng bào dân tộc dùng gạo, ngô, khoai, sắn, nấu chín rồi lên men. Men giống được nuôi với một số lá rừng được gọi là men lá. Sau quá trình lên men và tiến hành cất rượu thì thu được sản phẩm là rượu trắng và nếu không qua chưng cất sản phẩm được gọi là rượu cần, một sản phẩm nổi tiếng ở vùng núi. Nghề nấu rượu ở nước ta từ trước đến nay vẫn dùng men giống ở dạng bánh men hoặc men lá. Trong các men này là một tập hợp vi sinh vật có khả năng đường hóa tinh bột và lên men đường thành rượu. Mãi đến cuối thế kỷ XIX, các nhà sinh vật học Pháp Calmette, Boidin đã phân lập được một loài nấm mốc trong bánh men thuốc bắc, đặt tên là Murcor rouxii. Loài nấm mốc này phát triển tốt trên môi trường có gluxit, nhất là gạo, tích lũy phức hệ enzyme tương đối hoàn chỉnh, nên không những có khả năng phân giải tinh bột đạ hiệu suất cao mà còn có khả năng lên men đường thành rượu. Đến năm 1898, một loạt nhà máy sản xuất rượu từ nguyên liệu tinh bột (chủ yếu là gạo) theo phương pháp amilomyces rouxii được xây dựng tại Hà Nội, Nam Định, Hải Dương, Sài Gòn... Tất cả các nhà máy này đặt dưới sự quản lý đặc quyền của công ty rượu Fontaine từ Pháp. Mặt khác, thực dân Pháp cho duy trì các cơ sở sản xuất rượu thủ công. Thời bấy giờ, nhân dân thường gọi rượu do nhà máy sản xuất là rượu “ Đế”, còn rượu do các cơ sở thủ công sản xuất là rượu “Ngang”, rượu “lậu”. Do mục đích thống trị thực dân nên thời đó rượu sản xuất ra không cần tinh chế, hàm lượng tạp chất cao, do đó rượu được liệt vào hàng thuốc phiện về phương diện độc hại. Sau ngày hòa bình lặp lại, năm 1955 đến nay, nhà nước Việt Nam đã có kế hoạch khôi phục, phát triển ngành sản xuất rượu theo các thời kỳ, tiến hành nghiên cứu cải tiến phương pháp công nghệ và thiết bị để nâng cao năng suất, hiệu suất và chất lượng rượu trong công nghệ sản xuất rượu. Ở nước ta rượu được sản xuất ra theo nhiều phương pháp khác nhau, trong đó phương pháp lên men rượu truyền thống bằng bánh men hiện nay vẫn được dân gian sử dụng nhiều tuy nhiên hiệu suất lên men cũng như chất lượng ruợu ở nhiều vùng, nhiều địa phương còn chưa ổn định [8]. Một trong những nguyên nhân quan trọng gây lên sự không ổn định đó chính là chủng vi sinh vật lên men trong sản xuất rượu.Vì vậy cần thiết phải tuyển chọn những chủng vi sinh vật có hoạt lực đường hoá cao, hoạt lực lên men mạnh đồng thời bổ sung các loại lá với hàm lượng thích hợp để nâng cao hiệu suất lên men và chất lượng rượu thu được. Do vậy chúng tôi thực hiện đề tài này để “Phân lập và tuyển chọn chủng nấm men có hoạt lực cao trong sản xuất rượu đặc sản từ bánh men lá ở một số vùng miền núi phía Bắc”. Từ đó có cơ sở tạo ra loại rượu truỳên thống mang đậm hương vị Việt Nam và sanh tầm với các loại rượu truyền thống của các nước trên thế giới. 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Phân lập được các chủng nấm men từ bánh men lá ở một số vùng núi phía Bắc. Tuyển chọn được chủng nấm men có hoạt lức cao nhất trong sản xuất rượu đặc sản từ các chủng đã phân lập được. 1.3 Yêu cầu nghiên cứu Phân lập được chủng nấm men có trong bánh men lá. Tuyển chọn được chủng nấm men có hoạt lực cao nhất để sản xuất rượu đặc sản. Sơ bộ định danh chủng có hoạt lực cao nhất trong sản xuất rượu đặc sản. Tối ưu hóa điều kiện sinh trưởng và phát triển của chủng đã tuyển chọn. 1.4 Ý nghĩa của đề tài Ý nghĩa khoa học: Biết được trong men lá có chủng nấm men nào Và chủng có hoạt lực sản xuất rượu cao nhất. Ý nghĩa thực tiễn: Tạo ra được loại bánh men lá để sản xuất rượu ở quy mô công nghiệp mang hương sắc riêng của loại rượu đặc sản Việt Nam. PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Khái quát về men lá. Men lá loại bánh men có lá, vỏ, rễ cây rừng chứa tinh dầu, có tác dụng dược lý sát trùng. Ở một số vùng đồng bào Tây Nguyên, bà con dân tộc dùng một số loại lá có lượng tinh dầu cao để sát trùng và tạo hương sau này khi tiến hành lên men rượu. Tùy theo sở thích mà số lượng lá cho vào nhiều hay ít, vì thế có tên một lá hay hai lá, ba lá. Việc cho lá rừng vào còn có tác dụng giống như một nguồn vi sinh vật giống tự nhiên. Trong men lá có chứa vi sinh vật tổng hợp enzyme amylase, có khả năng lên men rượu và tạo hương thơm cho quá trình lên men, và sự xảy ra quá trình đồng thời một loạt các quá trình đường hóa, quá trình rượu hóa. Vì thế việc sản xuất bánh men có liên quan rất lớn đến khả năng phát triển hài hòa của các nhóm vi sinh vật trong bánh men ấy. Trong bánh men lá thường có hệ vi sinh vật sau: Nấm mốc gồm có Aspergillus oryzae, A. flavus, A. awamorii , A. Usami, A. Niger...( giống Aspergillus chiếm phần lớn). Nấm mốc sinh enzyme amylase đường hóa tinh bột [15]. Nấm men chủ yếu là Saccharomyces cerevisiae. Ngoài ra còn thấy có Hyphopichia burtonii, Pichia anomada, Candida....Những nấm men này coi như nấm dại, men tạp có lẫn trong bánh men. Nấm men rượu chuyển hóa đường thành rượu [15]. Trong nấm men còn thấy có loài men giả là Endomycopsis fibuliger, tương tự nấm men nhưng có thể mọc sợi, có khả năng sinh glucoamylase và thủy phân tinh bột thành đường glucose [15]. Ngoài ra còn có vi khuẩn lactic. 2.2 Đặc điểm chung của nấm men Nấm men là tên gọi thông thường của một nhóm nấm có vị trí phân loại không thống nhất nhưng có chung các đặc điểm sau: Nói chung có tồn tại trạng thái đơn bào. Đa số sinh sôi nảy nở theo lối nảy chồi, cũng có khi hình thức phân cắt tế bào. Nhiều loại có khả năng lên men đường Thành tế bào có chứa mannan Thích nghi với môi trường chứa đường cao, có tính axit cao. Nấm men phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên, nhất là trong các môi trường có chứa đường, có pH thấp, chẳng hạn như trong hoa quả, rau dưa, mật mía, rỉ đường, mật ong, trong đất ruộng mía, đất vườn cây ăn quả, trong đất có nhiễm dầu mỏ [6]. 2.2.1 Đặc điểm hình thái của nấm men Nấm men loài vi sinh vật điển hình cho nhóm nhân thật. Tế bào nấm men thường lớn gấp 10 lần so với vi khuẩn. Loại nấm men nhà máy rượu , nhà máy bia thường sử dụng là Saccharomyces cerevisiae, có kích thước thay đổi khoảng 2,5 - 10µm × 4,5 - 21µm do đó có thể thấy rõ được dưới kính hiển vi quang học [6]. Tế bào nấm men có dạng: hình cầu, hình ovan hoặc elíp, hình quả chanh, hình trụ, hình chùy hoặc đôi khi kéo dài ra thành sợi. Nấm men có thể thay đổi hình dạng và kích thước trong các giai đoạn phát triển và điều kiện môi trường xung quanh. Hình dạng của chúng không thay đổi chỉ ở các giống nuôi cấy khi còn trẻ trong các môi trường sinh dưỡng tiêu chuẩn. So với các sinh vật khác (đối với vi khuẩn chẳng hạn) tế bào nấm men có kích thước tương đối lớn: Đường kính khoảng 1µm; chiều dài 8µm. Với kích thước này, ta có thể ước tính bề mặt của tế bào nấm men trong 1 lít dịch lên men vào khoảng 10m2, và do vậy cường độ trao đổi chất của tế bào nấm men với môi trường xung quanh là vô cùng to lớn. Với lượng nấm men là 500kg so với trâu bò cùng một khối lượng thì một ngày đêm nấm men tổng hợp được 50 tấn Protein, còn trâu bò chỉ tổng hợp được 0,5kg. Trọng lượng riêng của tế bào nấm men không khác mấy so với tế bào vi khuẩn (ở nấm men chỉ số này là 1,055 – 1,060, ở vi khuẩn: 1,050 – 1,112) [15]. 2.2.2 Cấu tạo tế bào nấm men. Nấm men là sinh vật đơn bào hiển vi, tế bào cơ bản giống như ở động, thực vật. So sánh cấu tạo tế bào nấm men với vi khuẩn ta thấy có sự tiến hóa nhảy vọt từ nhân sơ đến nhân chuẩn. Cùng với sự tiến hóa về nhân và cơ chế phân chia nhân (nhân có màng, có các thể nhiễm sắc, phân bào có tơ...) ở cơ thể xuất hiện nhiều thể không thấy ở nhân sơ, như ti thể, lục lạp... Tế bào nấm men có thành phần và cấu tạo phức tạp. Trong tế bào có các cấu tử tiểu thể và có thể chia thành: các cơ quan nội bào hay cơ quan tử của tế bào và các chất chứa trong tế bào hay các thể vùi của tế bào [15] Vỏ tế bào: bao quanh tế bào nấm men là một lớp màng mỏng dày đặc, mềm mại có thể đàn hồi để định hình cũng như bảo vệ tế bào chống lại các tác động bên ngoài và chất độc. Vỏ tế bào nấm men mang điện. Nó còn có tác dụng giữ áp suất thẩm thấu nội bào, điều chỉnh các chất dinh dưỡng là các hợp chất có phân tử lượng thấp và các muối khoáng đi qua các lỗ nhỏ vào trong tế bào [15] Thành tế bào nấm men dày khoảng 25nm. (chiếm 25% khối lượng khô của tế bào). Đa số nấm men có thành tế bào cấu tạo bởi glucan và mannan. Một số nấm men có thành tế bào chứa kitin và mannan. Trong thành tế bào còn có chứa 10% protein (tính theo khối lượng khô), trong số protein này có một phần là enzim. Trên thành tế bào còn thấy có cả một lượng nhỏ lipit [6]. Màng tế bào chất: Xung quanh màng tế bào chất được bao quanh một lớp màng rất mỏng, chiều dày không quá 0,1nm dính chặt với tế bào chất. Có thể quan sát thấy lớp màng này dưới kính hiển vi trường tối: thấy màng là lớp viền sáng rất mỏng quanh tế bài chất. Màng tế bào chất có 4 chức năng cơ bản: tác dụng như rào chắc thẩm thấu, điều chỉnh chất dinh dưỡng từ môi trường vào trong tế bào và ngược lại cho các sản phẩm trao đổi chất ra ngoài tế bào; thực hiện sinh tổng hợp một số hợp phần của tế bào (các cấu tử của vỏ tế bào); nơi khu trú một số enzym và cơ quan tử của tế bào (như riboxom). Vận chuyển chất qua màng liên quan đến tính thấm của màng. Đặc tính này trước hết phụ thuộc vào các enzym phospholipaza và lipaza. Tế bào chất: còn gọi là nguyên sinh chất. Nó có cấu trúc không đồng nhất (heterogen) và ở thể keo, chứa tất cả các cấu trúc cơ bản của tế bào: Ti thể, riboxom, mạng lưới nội chất, các chất dự trữ và các thể vùi của hợp chất lipolit và hydratcacbon tự nhiên trong nội bào. Nhờ kính hiển vi điện tử mà chúng ta biết được tế bào chất là hệ keo được cấu tạo từ protein (đặc tính keo dính là đặc tính của protein), hydrat, lipit, các chất khoáng, nước và các hợp chất khác nữa. Nước trong tế bào chất chiếm 90% ở dạng tự do để hòa tan các chất trước khi tham gia vào các phản ứng trao đổi và dạng liên kết. Tế bào chất có độ nhớt cao tương ứng với glyxerin hoặc xiro đặc. (Như vậy gấp 800 – 8000 lần so với nước). Khi tế bào già độ nhớt này giảm. Trong tế bào chất chứ đầy đủ các cơ quan tử của tế bào, như ti thể, nhân, các khoang không bào, các hạt chất dự trữ dạng tinh bột, dạng chất béo, cũng như mạng lưới nội chất và các thể vùi khác (trong đó có các hạt riboxom)... Cấu trúc của tế bào chất thay đổi phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy và tuổi sinh trưởng của tế bào. Sự thay đổi này có thể là thuận nghịch và không thuận nghịch là do mức độ tác động của các yếu tố bên ngoài. Các tế bào trẻ có chất nguyên sinh đồng nhất, khi già chất này xuất hiện không bào, các giọt chất béo, các hạt polyphosphat và lipoit. Như vậy tế bào trở nên dị nguyên (không đồng nhất). Ngoài các cơ quan tử của tế bào có trong tế bào chất ở dạng ti thể hay thể vùi (ti thể, microxom, không bào...), còn có chất xúc tác sinh học rất quan trọng là enzym tham gia vào tất cả các phản ứng hóa sinh. Microxom hay lipoxom: Đây là thể vùi có dạng hạt siêu hiển vi, được cấu tạo từ lipoit, protit và axit ribonucleic (ARN). Các thành phần này ta thấy hàm lượng protit và ARN hầu như bằng nhau còn lipit là rất nhỏ. Ở đây sẽ xảy ra các quy trình tổng hợp protein cho tế bào từ các axit amin đã được hoạt hóa ở hệ thống ti thể. Các axit amin này được nối với nhau theo lệnh của nhân được chuyển qua ARN đi vào các phản ứng sinh tổng hợp protein. Ti thể: Có dạng hạt nhỏ, dạng que hoặc dạng sợi mảnh phân bố trong tế bào chất ở khoảng giữa vỏ tế bào và không bào. Có thể thấy chúng ở tất cả các giai đoạn sinh trưởng của tế bào nấm men: Thời kỳ yên tĩnh, nảy chồi, sinh bào tử... Chiều dài của sợi ti thể là 0,2 – 7,5µm. Hình dạng của nó có thể thay đổi trong quá trình nuôi cấy, có thể là từ các hạt hoặc que hay sợi đơn đến kết hợp thành chuối. Bình thường số lượng ti thể trong tế bào nấm men dao động rất lớn: Từ 1 - 50. Nếu trong tế bào chỉ có một ti thể thì thể tích của nó chiếm không nhỏ hơn 20% thể tích tế bào, ở S. cerevisiae có một ti thể chiếm tới 88% thể tích tế bào. Trong môi trường có nồng độ glucose thấp tế bào nấm men có tới 100 – 200 ti thể, nhưng ở nồng độ cao chỉ thấy 30 – 40. Mạng lưới nội chất: Trong tế bào của nấm men còn chứa một hệ thống màng 2 lớp, được gọi là mạng lưới nội chất bao gồm hằng dãy màng kép có gai cong dày. Một số màng có kết hợp với riboxom. Đôi khi đầu màng chuốt thành các bọng tròn và rồi có thể từ đây tạo thành không bào. Mạng lưới này còn được gọi là thể golgi hay bộ máy golgi. Mặc dù mạng lưới nội chất của nấm men, cũng như các vi sinh vật khác, có tham gia vào các hoạt động của tế bào. Song, mối quan hệ mạng lưới này với các cơ quan nội bào khác vẫn chưa được biết rõ ràng. Có tác giả cho rằng, mạng lưới kép này điều hành chung quá trình sinh lý của tế bào. Nhân tế bào: Nhân là cấu tử bất biến của tế bào nấm men. Ta thấy rõ nhân tế bào nấm men trong trường hợp giữ tế bào trong nước vô trùng vài ngày. Lúc này tế bào chất trở thành đồng nhất và trong suốt do bị đói. Với kính hiển vi thông thường ta có thể quan sát rất rõ ràng nhân tế bào hoặc dưới kính hiển vi huỳnh quang hay kính hiển vi đối pha sau khi xử lý bằng dung dịch Fluorocrom. Nhân của tế bào nấm men có màng vỏ, hạch nhân (thể nhiễm sắc) và chất nhân. Vỏ nhân tham gia vào điều hòa cac quy trình trong nhân bằng cách thay đổi tính thấm và thông báo trực tiếp giữa nhân với môi trường bên ngoài tế bào, cũng như giữa nhân và tế bào chất. Đường kính của nhân tế bào nấm men vào khoảng 2µm. Phần lớn nhân có dạng hình cầu hoặc elip. Sự phân bố của chúng trong nội bào có thể thay đổi trong suốt quá trình sống của tế bào. Kích thước nhân của tế bào nấm men không đồng nhất không những ở các tế bào khác giống, mà ở tế bào cùng một giống trong trạng thái sinh lý khác nhau. Nhân to ở các giống Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Saccharomycodes và dễ dàng nhìn thấy dưới kính hiển vi. Còn các giống lên men hoặc không lên men như Torulopsis pulcharrina, T.utilis... thường có nhân nhỏ. Ở tế bào nấm men đang sinh trưởng nhân rất giàu axit Nucleic và vùng sinh sản được hoạt hóa (nó sẽ mọc chồi hoặc phân cắt tế bào) [15]. 2.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của nấm men Nấm men đặc biệt là chủng Saccharomyces cerevisiae là loại hiếu khí, nhưng khi thiếu 02 chúng lên men thành ethanol và CO2 qua con đường EM: pyruvat bị decacboxi hóa thành axetaldehyt và CO2 nhờ enzyme pyruvat – decacboxilase (phụ thuộc vào TPP), sau đó axetaldehyt bị khử thành etanol nhờ alcohol – dehydrogenase. Nếu thêm hydrosulfit vào dung dịch nấm men đang lên men glucose, axetaldehyt sẽ bị giảm: hiệu suất etanol và CO2 giảm, đồng thời glyxerin xuất hiện. Sự lên men etilic thông thường được gọi là: ”Dạng lên men Neuberg 1”. Nấm men là vi sinh vật kỵ khí tùy tiện. Khi thiếu O2 chúng lên men mạnh nhưng không sinh trưởng, khi có O2 chúng hô hấp và lên men bị ức chế (hiệu quả Pasteur), sự tiêu thụ glucose sản lượng etanol và CO2 đều giảm sinh khối, trái lại tăng lên tế bào chỉ tạo thành 2mol ATP / mol 2 mol glucose khi lên men so với 38 ATP / mol glucose khi hô hấp. Hiện tượng trên chịu sự điều chỉnh của một số cơ chế trong đó cơ chế cạnh tranh ADP và Pi [17]. Đối với nấm men trong quá trình hoạt động sống, chúng đồng hóa các monosacarit trong điều kiện yếm khí, thải ra môi trường xung quanh sản phẩm dị hóa là rượu etylic và khí cacbonic nhờ tác dụng của một phức hệ enzyme. Đây là một trong nhứng đặc trưng quan trọng của nấm men đã được nhân dân ta ứng dụng từ lâu đời để sản xuất rượu (rượu ngang, rượu nếp) [8]. Chúng ta đều biết, mọi quá trình muốn tiến hành được đòi hỏi phải có năng lượng. Để thực hiện được các hoạt đọng sống như sinh trưởng, phát triển và sinh sản của mình, nấm men đòi hỏi phải có năng lượng. Lên men là quá trình để cung cấp năng lượng và các hợp chất trung gian cho tế bào nấm men. Nhưng tế bào sống chỉ sử dụng năng lượng ở dạng hóa năng tàng trữ trong các mạch cacbon và được giải phóng ra trong các phản ứng enzyme do sự chuyển điện tử từ mức năng lượng này sang mức năng lượng khác. Các phản ứng hóa sinh trong quá trình lên men là phản ứng chuyển hydro. Các enzyme xúc tác quá trình tách hydro khỏi cơ chất được gọi là enzyme dehydrogenase. Như vậy lên men là quá trình oxy hóa khử sinh học [8]. Lên men là quá trình để thu năng lượng qua đó hydro tách ra khỏi cơ chất được chuyển đến chất tiếp nhận cuối cùng là chất hữu cơ. Hợp chất hữu cơ được khử rồi đi vào môi trường dinh dưỡng và tích tụ lại trong đó. Trong quá trình lên men rượu, hợp chất hữu cơ được tích tụ chủ yếu là rượu etylic [8]. Quá trình lên men chuyển hóa đường thành rựơu là quá trình sinh hóa phức tạp, bao gồm một chuỗi các phản ứng theo con đường fructoza – 1,6 – diphotphat. Người ta nhận thấy rằng chu trình Embden – Meyerhof – parnas và chu trình Crep là trung tâm của các quá trình lên men. Vì lẽ những chu trình này đáp ứng được các yêu cầu về nguồn năng lượng, nguồn cacbon và nguồn các chất khử là những yếu tố rất cần thiết để duy trì các hoạt động sống của tế bào [8]. Các chủng nấm men khác nhau có khả năng đồng hóa (lên men) các nguồn hydrocacbon khác nhau. Sự khác nhau này do tính chất đặc hiệu, chuyển hóa của các loại enzyme chứa trong tế bào nấm men quyết định. Nói chung đại bộ phận các chủng nấm men đều đồng hóa được các monosacarit glucoza, fructoza... Đối với quá trình lên men rượu, nguồn hydrocacbon có ảnh hưởng tới năng suất và chất lượng rượu. Ví dụ chủng S.cerevisiae XII chỉ lên men được glucoza, fructoza, sacaroza, galactoza và rafinoza nhưng không lên men được lactoza. Còn đối với chủng S.cerevisiae lại lên men được glucoza, fructoza, sacaroza, mantoza và cả dextrin [8]. Dựa vào mối quan hệ với nhiệt độ người ta chia nấm men ra làm 2 loại: loại lên men ở nhiệt độ thấp (5 – 100C) và loại lên men ở nhiệt độ cao (28 – 320C). Trong công nghiệp sản xuất rượu người ta sử dụng những chủng nấm men lên men ở nhiệt độ cao, chủng có khả năng lên men nhanh và mạnh mẽ. Khi sản xuất rượu từ nguyên liệu chứa tinh bột thì trước hết cần phải chuyển tinh bột của nguyên liệu đó thành đường đơn giản. Thường thì tinh bột của nguyên liệu được thủy phân đến mantoza và glucoza nhờ enzyme amylase. Muốn có được sản phẩm chủ yếu trong môi trường lên men rượu là rượu etylic thì tác nhân cung cấp hệ enzyme đặc thù đó phải là giống nấm men Saccharomyces cerevisiae. Nhờ nấm men này, trong điều kiện sống yếm khí, chúng có khả năng chuyển hóa đường thành rượu etylic và CO2 một cách hợp thức. Trong điều kiện yếm khí nấm men không có khả năng chuyển hóa tiếp các etanol đã được tạo thành. Có nghĩa là sự lên men sẽ dừng lại ở giai đoạn hình thành và tích lũy rượu etylic. Như vậy biện pháp kỹ thuật tương ứng là phải lên men trong thùng kín [22], [28]. Tế bào nấm men có đặc điểm nữa là có khả năng tạo ra các nội enzyme (endofecmen) nghĩa là nhừng enzyme tiến hành xúc tác ở bên trong tế bào. Như vậy sự phân li đường sẽ xảy ra ở bên trong tế bào nấm men, còn rượu etylic và CO2 được tạo thành thì đi ra khỏi tế bào và tích tụ trong môi trường. Xét về mặt hóa học, sự lên men rượu bình thường có thể chia ra 2 thời kỳ: - Thời kỳ cảm ứng: Ở giai đoạn này, chất tiếp nhận hydro của enzyme ancoldehydrogenaza là axetandehyt được tạo thành chưa đủ, do đó enzyme sẽ chuyển hydro đến cho andehyt photphatglixerinic. Dưới tác dụng của enzyme photphatase, photphatglixerin bị thủy phân để tạo thành glyxerin. Như vậy trong môi trường sẽ hình thành glixerin và CO2: - Thời kỳ tĩnh: Đến lúc này lượng axetandeh