Đề tài Phương pháp lai Northern blot

Môn học: Kỹ thuật di truyền Chủ đề: Phương pháp lai Northern blot Giáo viên hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Dung Nhóm : 14 Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Trúc Giang 61303495 Nguyễn Thị Ngọc Dung 61303469 Lê Thị Ngọc Bích 61303442 I/ giới thiệu 1/ khái niệm Phương pháp lai Northern blot là phương pháp áp dụng cho RNA, lai DNA-RNA hoặc RNA-RNA. Phương pháp này được sử dụng để xác định kích thước và hàm lượng của một mRNA đặc trưng trong một hỗn hợp RNA. Kỹ thuật lai Northern blot được phát triển vào năm 1977 bởi James Alwine, David Kemp, và George Stark tại Đại học Stanford. 2/ Thủ tục: Bắt đầu với khai thác của tổng số RNA từ một mẫu mô đồng nhất hoặc từ các tế bào. Nhân điển hình mRNA sau đó có thể được cô lập thông qua việc sử dụng các phương pháp sắc ký oligo (dT) cellulose để cô lập chỉ những RNA với poly (A) đuôi. Mẫu RNA sau đó được phân cách bằng gel điện. Các mẫu RNA, bây giờ tách ra theo kích cỡ, được chuyển giao cho một màng nylon thông qua một hệ thống mao mạch hoặc máy hút thấm. Mao dẫn thấm thiết lập hệ thống cho việc chuyển giao RNA từ gel điện đến một màng thấm. Các bộ đệm chuyển giao sử dụng cho thấm thường chứa Formamide bởi vì nó làm giảm nhiệt độ ủ của sự tương tác thăm dò-RNA, do đó loại bỏ sự cần thiết cho nhiệt độ cao, có thể gây suy thoái RNA. Sau khi RNA đã được chuyển giao cho màng, nó được cố định thông qua các liên kết cộng hóa trị với màng bằng ánh sáng tia cực tím hoặc nhiệt.Sau đó, nó được lai với RNA trên màng. Điều kiện thí nghiệm có thể ảnh hưởng đến hiệu quả và độ đặc hiệu của lai bao gồm sức mạnh ion, độ nhớt, độ dài song công, cặp base sai, và thành phần cơ bản. 3/ Gel: RNA được chạy trên gel agarose formaldehyde, Các mẫu RNA được phổ biến nhất là tách trên gel agarose có chứa formaldehyde như một chất làm biến tính cho RNA để hạn chế cấu trúc thứ cấp. gel được nhuộm với Ethidium Bromide (EtBr) và quan sát dưới ánh sáng tia cực tím để quan sát chất lượng và số lượng RNA trước khi thấm. gel Polyacrylamide electrophoeresis bằng urê cũng có thể được sử dụng trong RNA tách biệt nhưng nó thường được sử dụng cho RNA bị phân mảnh hay microRNA. một thang RNA thường chạy song song với các mẫu trên gel điện để quan sát kích thước của các mảnh vỡ thu được nhưng trong tổng số mẫu RNA các tiểu đơn vị ribosome có thể hoạt động như đánh dấu kích thước. 4/ Đầu dò Đầu dò bao gồm các axit nucleic với một chuỗi bổ sung cho tất cả hoặc một phần của RNA quan tâm, nó có thể là DNA, RNA, hoặc Oligonucleotide với tối thiểu là 25 cơ sở bổ sung cho chuỗi. các đầu dò cần phải được dán nhãn hoặc gắn với đồng vị phóng xạ (32P) hoặc với Chemiluminescence trong đó Phosphatase kiềm hoặc Peroxidase phá vỡ nền sản xuất Chemiluminescent phát xạ có thể phát hiện ánh sáng . Việc ghi nhãn chemiluminescent có thể xảy ra theo hai cách: + Hoặc là thăm dò được gắn vào enzyme + Hoặc thăm dò được dán nhãn với một phối tử (ví dụ như biotin) mà các kháng thể (ví dụ như avidin hay streptavidin) được gắn vào enzyme phim X-quang có thể phát hiện cả hai tín hiệu phóng xạ và chemiluminescent ( nhiều nhà nghiên cứu thích các tín hiệu chemiluminescent vì nó nhanh hơn, nhạy cảm hơn, và giảm nguy cơ sức khỏe mà đi cùng với nhãn phóng xạ.) II/ Nguyên tắc lai: Dựa trên nguyên tắc bổ sung giữa cặp bazo nito A-T và G-C. Các đoạn polynucleotit đơn có nguồn gốc khác nhau nhưng có cấu trúc bổ sung với nhau thì chúng có thể bắt cặp với nhau tạo ra phân tử lai. Phương pháp này cũng bao gồm những bước sau: RNA (đã được làm biến tính )sẽ được phân tách theo kích thước nhờ điện di trên gel agarose có chứa các chất làm biến tính . Các chất làm biến tính có tác dụng khiến các liên kết yếu quy định cấu trúc bậc 2 của RNA không thể hình thành trở lại sau khi RNA đã biến tính. Và do đó không cản trở sự di chuyển cũng như sự phân tách các RNA trong gel. Sau đó RNA được chuyển lên mành lai . RNA cố định trên màng lai được đem lai với mẫu dò có đánh dấu phóng xạ . Các phân tử lai được phát hiện nhờ kĩ thuật phóng xạ tự ghi. III/ Các phương pháp thực hiện: Bước 1: tách chiết và biến tính Tách chiết RNA ra khỏi tế bào Tiến hành điện di hỗn hợp RNA vừa tách trên gel agarose Làm biến tính các dải băng RNA trên gel nhờ dd formaldehyde Bước 2: thẩm tích Chuyển mRNA lên màng lai nitrocellulo hoặc nilon filte. Dựa trên nguyên tắc mao dẫn: Đệm từ phía dưới được thấm một cách tự nhiên lên trên chuyển các mạch DNA từ gel lên màng và bám chặt vào màng. Kỹ thuật chuyển RNA từ gel agarose lên màng lai Bước 3: lai với mẫu dò (probe) có đánh dấu phóng xạ Ủ màng lai với mẫu dò ( probe) có gắn đồng vị phóng xạ, hoặc chất phát huỳnh quang. DNA cố định trên màng lai kết hợp Probe theo nguyên tắc bổ sung. Bước 4: phóng xạ tự chụp Rửa trôi các probe không được gắn Làm khô Cho chụp phóng xạ tự động Phát hiện số lượng và vị trí nhờ phim phóng xạ tự ghi hoặc hiển thị huỳnh quang IV/ Tổng quát: RNA làm biến tính bằng formanldehyde được phân tách theo kích thước nhờ điện di trên gel agarose RNA được chuyển lên màng lai và thẩm tích RNA cố định trên màng lai được đem lai với mẫu dò được đánh dấu phóng xạ Các phân tử lai được phát hiện nhờ kĩ thuật phóng xạ tự chụp V/ Ưu, nhược điểm của phương pháp lai: 1/ Ưu điểm: Phát hiện kích thước RNA, quan sát các sản phẩm nối thay thế. Việc sử dụng các thiết bị thăm dò với một phần tương đồng, chất lượng và số lượng RNA có thể được đo trên gel trước khi thấm và màng có thể được lưu trữ trong nhiều năm sau khi thấm. Những gen chip đang khá thông dụng và là thường phù hợp với dữ liệu thu được từ phương pháp Northern Blot. 2/ Nhược điểm: Một vấn đề ở miền bắc thấm thường là sự xuống cấp mẫu bằng RNases (cả nội sinh để mẫu và thông qua ô nhiễm môi trường), có thể tránh được bằng cách khử trùng thích hợp của thủy tinh và việc sử dụng các chất ức chế RNase như DEPC (diethylpyrocarbonate). Các hóa chất được sử dụng trong hầu hết các blots Bắc có thể là một nguy cơ đối với các nhà nghiên cứu, kể từ formaldehyde, chất phóng xạ, ethidium bromide, DEPC và ánh sáng tia cực tím đều gây hại dưới tiếp xúc nhất định. VI/ Ứng dụng: TÀI LIỆU THAM KHẢO: Trịnh Đình Đạt . Công nghệ sinh học. Tập 4. NXB Giáo dục. Hồ Thị Thùy Dương. Sinh học phân tử . NXB Giáo dục. Lê Trần Bình. Cơ sở công nghệ sinh học. Tập 1. NXB Giáo dục Việt Nam. Lê Đình Lương. Nguyễn Đình Thi. Kỹ thuật di truyền và ứng dụng. NXB Giáo dục.