Đề tài Sản suất anthocyanyl trong nuôi cấy rễ bất định củ cải đường l. cv. peking koushin

Click to edit Master title style Click to edit Master text styles Second level Third level Fourth level Fifth level 6/6/2014 ‹#› Đề tàiSẢN SUẤT ANTHOCYANYL TRONG NUÔI CẤY RỄ BẤT ĐỊNH CỦ CẢI ĐƯỜNG L. CV. PEKING KOUSHIN GVHD: CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TPHCM KHOA CNSH – KTMT Nội dung Tóm tắt Giới thiệu Vật liệu và phương pháp Kết quả và thảo luận 4 1 2 3 I. Tóm tắt Tạo rễ bất định của củ Cải đường L. cv. Peking Koushin từ đoạn rễ cây giống in vitro trong môi trường 1/2 MS lỏng + 0,5 mg/l IBA Rễ bất định nuôi cấy trong môi trường 1/2 MS lỏng + 0,5 mg/l IBA sản xuất anthocyanin trong bóng tối. Khi nuôi cấy dưới điều kiện chiếu sáng 14 giờ/ngày, rễ bất định trong môi trường có 0,5 mg/l IBA sản xuất anthocyanin nhiều hơn môi trường có 0,1 hoặc 0,5 mg/l NAA Quá trình thủy phân acid của các dịch chiết xuất rễ cho thấy anthocyanidin chính là pelargonidin Ngoài ra, so sánh tinh sạch hoàn toàn chiết xuất rễ bất định bằng DPPH với rễ nguyên của cây cùng loại trong nghiên cứu này II. Giới thiệu III. Vật liệu và phương pháp1. Sự hình thành và sinh trưởng của rễ bất định và củ Hạt giống ngâm với ethanol 75% trong 30 phút Khử trùng với 2% NaOCl có chứa 0.1% Tween 20 trong 10 phút Đặt hạt trên môi trường 0.5% agar + 0.5% saccharose. Nuôi cấy dưới điều kiện chiếu sáng 14h/ngày ở 250C Rửa một lần nước cất vô trùng Rửa 3 lần bằng nước cất vô trùng III. Vật liệu và phương pháp1. Sự hình thành và sinh trưởng của rễ bất định và củ III. Vật liệu và phương pháp2. Phân tích sắc tốa. Tách chiết anthocyanin III. Vật liệu và phương pháp2. Phân tích sắc tốb. Thủy phân acid của anthocyanin III. Vật liệu và phương pháp3. Phân tích HPLC Thời gian lưu của anthocyanidins chính trong các mẫu rễ bất định và rễ nguyên phân tích bằng HPLC được so sánh với những chất chuẩn của anthocyanin (pelargonidin chloride, cyanidin chloride, peonidin chloride và delphinidin chloride). Điều kiện của HPLC Cột: TOSOH TSKgel ODS-80Ts, 4.6×150mm Pha động: 0.4% TFA trong H2O – CH3CN (9:1→7:1 trong 25 phút) Tốc độ dòng chảy: 0.8ml/min Nhiệt độ cột 400C, bước sóng 520nm III. Vật liệu và phương pháp4. Phân tích định lượng anthocyanin Chiết riêng khoảng 20mg mẫu khô với 2ml methanol 80% có chứa 1% TFA bằng sóng siêu âm trong 20 phút. Lọc qua nút bông, lấy 2ml dịch chiết. Đo độ hấp thu ở 521nm và tính toán nồng độ anthocyanin tương ứng III. Vật liệu và phương pháp5. Tinh sạch hoàn toàn bằng DPPH Tinh sạch hoàn toàn bằng phương pháp sử 1,1–diphenyl–2–picrylhydrazyl (DPPH) Hòa tan 10mg dịch chiết từ rễ tươi hoặc khô vào 1ml methanol 80% có chứa 1% TFA rồi lấy 100μl. Thêm vào mỗi dung dịch mẫu 500μl dung dịch DPPH ethanol 0,5mM và 400μl methanol 80% có chứa 1% TFA. Sau đó lắc nhẹ, hỗn hợp phản ứng được để yên trong bóng tối 20 phút ở nhiệt độ phòng rồi đem đi đo độ hấp thu ở 517nm. Tỷ lệ phần trăm tinh sạch được tính bằng công thức: Tinh sạch hoàn toàn bằng DPPH (%) = 100 – (Abs của mẫu phản ứng)/(Abs của mẫu kiểm chứng) × 100 Hoạt tính chống oxy hóa được đo bằng phương pháp TBA sử dụng acid linoleic III. Vật liệu và phương pháp6. Đo hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp 2–thiobarbituric acid (TBA) III. Vật liệu và phương pháp6. Đo hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp 2–thiobarbituric acid (TBA) Tỷ lệ phần trăm hoạt tính chống oxy hóa được tính bằng công thức: Hoạt tính chống oxy hóa (%) = 100 – (Abs của mẫu phản ứng)/(Abs của mẫu kiểm chứng) × 100 IV. Kết quả và thảo luận1. Sự hình thành và sinh trưởng của rễ bất định IV. Kết quả và thảo luận1. Sự hình thành và sinh trưởng của rễ bất định Sản lượng sắc tố của rễ bất định sinh trưởng trong bóng tối thấp hơn so với rễ nhánh của cây nguyên vẹn cùng loại trong nghiên cứu này Sự phát triển của rễ bất định không bị ảnh hưởng bởi hai điều kiện ánh sáng/tối. Khi nuôi cấy rễ bất định (khoảng 45mg trọng lượng tươi/bình 100ml) trong môi trường 1/2 MS lỏng + 0,5 mg/l IBA,chiếu sáng trong bốn tuần, sự hình thành sắc tố tăng rõ rệt Rễ bất định được cấy truyền vào môi trường 1/2 MS lỏng bổ sung NAA (0,1; 0,5 mg/l) hoặc IBA (0,1; 0,5 mg/l), nuôi cấy lỏng lắc tốc độ 100rpm ở 250C, chiếu sáng 14giờ/ngày hoặc trong bóng tối. Rễ bất định được nuôi cấy trong bình tam giác 100ml (chứa môi trường ½ MS lỏng + 0.5 mg/l IBA) khoảng 4 tuần ở 250C, chiếu sáng 14 giờ/ngày   Sắc tố đỏ(Anthocyanin) Bóng tối 14h chiếu sáng 0.1mg/l NAA 0.5mg/l NAA 0.1mg/l IBA 0.5mg/l IBA ± ± ± ±     Bảng. Ảnh hưởng của auxin lên sản lượng anthocyanin của rễ bất định ± : Sản lượng anthocyanin rất thấp  : Sản lượng anthocyanin thấp  : Sản lượng anthocyanin trung bình  : Sản lượng anthocyanin cao IV. Kết quả và thảo luận2. Phân tích anthocyanidin bằng HPLC Thủy phân sắc tố đỏ tách chiết từ rễ bất định và rễ củ bằng HCl 2M, sau đó phân tích bằng HPLC và so sánh với bốn chất chuẩn anthocyanidin: pelargonidin clorua, cyanidin clorua, peonidin clorua và delphinidin clorua Phân tích HPLC để chứng minh rằng anthocyanidin chính của rễ bất định và rễ củ của Peking Koushin là pelargonidin Hàm lượng anthocyanin của rễ bất định đông lạnh (0,15% trọng lượng khô) cao hơn của rễ củ một chút (0,11% trọng lượng khô), mặc dù sự khác nhau không có ý nghĩa ở mức 5% của F test Kết quả phân tích HPLC của chất chuẩn (A) và dịch thủy phân của rễ củ (B) và rễ bất định (C). Hàm lượng anthocyanin trong nuôi cấy rễ củ và rễ bất định. Hàm lượng anthocyanin tương đương với lượng pelargonidin. Cây được trồng khoảng 3 tháng và khi rễ bất định được 4 tuần tuổi thì nuôi cấy trong điều kiện chiếu sáng đã được phân tích. Số liệu trung bình của 3 lần thí nghiệm. Thanh đại diện cho sai số chuẩn. 1, rễ khô; 2, nuôi cấy rễ bất định khô. Nuôi cấy rễ bất định (khoảng 45 mg trọng lượng tươi) trong môi trường ½ MS lỏng + 0.5 mg/l IBA ở 250C, chiếu sáng 14 giờ/ngày trong máy lắc tốc độ 100rpm IV. Kết quả và thảo luận3. Thời gian tăng trưởng và hàm lượng anthocyanin trong nuôi cấy rễ bất định Trọng lượng tươi và khô của rễ bất định tăng lên nhanh chóng trong 2 tuần đầu tiên, tăng đến tuần thứ 7. Athocyanin sản xuất giai đoạn đầu quá trình nuôi cấy, khối lượng lớn nhất trong tuần 5 (khoảng 250 μg/ bình 100ml), sau đó giảm dần. Thời gian tăng trưởng (A) và hàm lượng anthocyanin trong nuôi cấy rễ bất định của Peking Koushin. Rễ bất định được nuôi cấy trong môi trường ½ MS lỏng + 0.5 mg/l IBA trong 4 tuần, ở 250C, chiếu sáng 14giờ/ngày. Số liệu trung bình của 3 lần thí nghiệm. Thanh đại diện cho sai số chuẩn Tinh sạch hoàn toàn bằng DPPH của 0.2 và 1 mg/ml dung dịch phản ứng chuẩn bị từ những mẫu khác nhau đã được khảo sát. 0.2 mg/ml dung dịch phản ứng cho thấy hoạt tính thấp hơn nhiều so với 1 mg/ml dung dịch phản ứng IV. Kết quả và thảo luận4. Tinh sạch hoàn toàn bằng DPPH Số liệu trung bình trong 3 lần thí nghiệm. Thanh đại diện cho sai số chuẩn. 1, rễ Peking Koushin tươi; 2, rễ Peking Koushin khô; 4, rễ bất định Peking Koushin khô; 5, rễ Aokubi tươi. IV. Kết quả và thảo luận5. Hoạt tính chống oxi hoá đo bằng phương pháp TBA Các hoạt tính chống oxy hóa trong rễ củ và rễ bất định được xác định bằng phương pháp TBA. Các hoạt tính chống oxy hóa của rễ khô và tươi khoảng 25% Số liệu trung bình trong 3 lần thí nghiệm. Thanh đại diện cho sai số chuẩn. 1,rễ Peking Koushin tươi; 2,rễ Peking Koushin khô; 3,rễ bất định Peking Koushin tươi; 4,rễ bất định Peking Koushin khô; 5, rễ Aokubi tươi. IV. Kết quả và thảo luận5. Hoạt tính chống oxi hoá đo bằng phương pháp TBA Số liệu trung bình trong 3 lần thí nghiệm. Thanh đại diện cho sai số chuẩn. 1,rễ Peking Koushin tươi; 2,rễ Peking Koushin khô; 3,rễ bất định Peking Koushin tươi; 4,rễ bất định Peking Koushin khô; 5, rễ Aokubi tươi. Hoạt tính chống oxi hóa anthocyanin trong các mẫu khác nhau (phương pháp TBA) Kết luận Từ những kết quả này, nuôi cấy rễ bất định của R.sativus L. cv. Peking Koushin, trong đó sản xuất anthocyanin và tinh sạch hoàn toàn bằng DPPH, các hoạt tính chống oxy hóa (phương pháp TBA), có thể được sử dụng như một nguồn thay thế màu thực phẩm với hoạt tính sinh học. Cảm ơn cô và các bạn!!!